時差成像技術(shù)輔助胚胎選擇在單胚胎移植中的應(yīng)用價值

田可可，王娟，閆虹，杜威，呂玉珍

(焦作市婦幼保健院 生殖醫(yī)學(xué)科，河南 焦作 454000)

在輔助生殖技術(shù)中，為了保證較高的臨床妊娠率，傳統(tǒng)移植策略通常是移植2～3枚胚胎，這就導(dǎo)致多胎妊娠率顯著增高。有研究表明，雙胚胎移植是多胎妊娠最主要的影響因素[1]。為了減少多胎妊娠所帶來的母嬰并發(fā)癥，選擇性單胚胎移植逐漸成為未來生殖醫(yī)學(xué)發(fā)展的方向。然而，如何選擇發(fā)育潛能最好的胚胎用于移植，從而在降低多胎率的同時保證臨床妊娠率，仍是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的難題。幾十年來，傳統(tǒng)的胚胎形態(tài)學(xué)評分(conventional morphological assessment，CMA)方法由于其簡單實用、無創(chuàng)、低成本等特點，在世界各個生殖中心被廣泛采用。然而，胚胎發(fā)育是一個連續(xù)性的動態(tài)過程，傳統(tǒng)的胚胎評估方法是在特定的時間點將胚胎移出培養(yǎng)箱進(jìn)行觀察，由于不能進(jìn)行連續(xù)的觀察，收集到與胚胎發(fā)育相關(guān)的指標(biāo)非常有限。近年來興起的時差成像技術(shù)(time-lapse monitoring technology，TLT)較好地克服了這一弊端，可以對胚胎的發(fā)育過程進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測，捕捉胚胎發(fā)育各個階段的圖像并合成動態(tài)視頻，為胚胎選擇提供更多的參考信息[2]。對于TLT能否改善妊娠結(jié)局，學(xué)者們持不同的觀點。Pribenszky等[3]及紀(jì)冰等[4]研究表明，通過TLT提供的動力學(xué)參數(shù)篩選胚胎，可顯著改善體外受精的妊娠結(jié)局。另有研究報道，采用TLT篩選胚胎與傳統(tǒng)的靜態(tài)形態(tài)學(xué)評估相比并無優(yōu)勢[5]。目前國內(nèi)關(guān)于選擇性單胚胎移植中應(yīng)用TLT的文獻(xiàn)報道較少，本研究比較了應(yīng)用TLT輔助胚胎選擇在卵裂期單胚胎移植及單囊胚移植中的臨床妊娠結(jié)局，從而探討TLT的臨床應(yīng)用價值，旨在為臨床工作中TLT在選擇性單胚胎移植中的應(yīng)用提供參考。

1 資料和方法

1.1 研究對象對2019年1月至2021年6月在焦作市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科治療的體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(in-vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embyro transfer，IVF/ICSI-ET)周期患者的資料進(jìn)行回顧性分析。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡<40歲；②月經(jīng)第3天血清卵泡刺激素<12 IU·L-1；③獲卵數(shù)≥6枚，取卵后第3天形成的優(yōu)質(zhì)胚胎≥4枚，患者于取卵后第3天或第5天行單胚胎移植，所移植的卵裂期胚胎及囊胚均為優(yōu)質(zhì)胚胎。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①女方存在反復(fù)移植失敗、反復(fù)流產(chǎn)等不良預(yù)后情況；②子宮肌瘤、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥；③子宮畸形，如單角子宮、縱隔子宮、雙子宮等；④補救卵胞漿內(nèi)單精子注射(rescue intracytoplasmic sperm injection，R-ICSI)。共納入414例患者，依據(jù)胚胎篩選方法和胚胎發(fā)育時期分為4組：傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評分-卵裂期單胚胎移植組(CMA-single cleavage embryo transfer，CMA-SCT，n=130)、時差成像-卵裂期單胚胎移植組(TLT-single cleavage embryo transfer，TLT-SCT，n=90)、傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評分-單囊胚移植組(CMA-single blastocyst transfer，CMA-SBT，n=105)、時差成像-單囊胚移植組(TLT-single blastocyst transfer，TLT-SBT，n=89)。

1.2 治療方法采用卵泡期長方案，于月經(jīng)第2天抽血和B超檢查后，肌內(nèi)注射長效亮丙瑞林(上海麗珠制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20093852)3.75 mg，30 d后復(fù)診，至調(diào)節(jié)達(dá)標(biāo)[6](子宮內(nèi)膜厚度≤5 mm，血清卵泡刺激素<5 IU·L-1，血清黃體生成素<5 IU·L-1，雙側(cè)卵巢內(nèi)卵泡直徑<5 mm，雌二醇<50 ng·L-1)后使用促卵泡生長激素，具體用量根據(jù)卵巢儲備、年齡及體質(zhì)量等進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)16 mm以上的卵泡占主導(dǎo)卵泡60%左右時，注射8 000～10 000 IU人絨毛膜促性腺激素(上海麗珠制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H44020672)，36～37 h后在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。

1.3 胚胎體外培養(yǎng)

1.3.1撿卵與授精 經(jīng)陰道穿刺獲得的卵冠丘復(fù)合物經(jīng)ART-1023(美國SAGE)洗滌后轉(zhuǎn)入序貫培養(yǎng)液ART-1020中，置于COOK培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。行常規(guī)體外受精的卵子，在獲卵3 h后采用微滴法進(jìn)行受精。調(diào)整精子濃度為1.0×106個·mL-1，制備成微滴皿，每個微滴含受精培養(yǎng)液50 μL，每個微滴中加入1個卵子，受精后4～6 h拆除顆粒細(xì)胞。行卵胞漿單精子注射的卵子在獲卵后3 h拆除顆粒細(xì)胞，獲卵后4～5 h行顯微注射。

1.3.2胚胎培養(yǎng)

1.3.2.1Time-lapse培養(yǎng)箱 卵子在IVF授精后4～6 h去除顆粒細(xì)胞或常規(guī)ICSI后，放入預(yù)先在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為6%的CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜的ESCO培養(yǎng)皿的ART-1026培養(yǎng)液微滴中，置入ESCO時差成像培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為6%、O2體積分?jǐn)?shù)為5%。受精后第3天，除移植和冷凍的胚胎外，剩余胚胎一對一的移入預(yù)先在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為6%的CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜的ART-1029培養(yǎng)液微滴中，置入ESCO培養(yǎng)箱行囊胚培養(yǎng)。設(shè)置拍攝間隔時間為5 min。

1.3.2.2傳統(tǒng)培養(yǎng)箱 卵子在IVF授精后4～6 h去除顆粒細(xì)胞或常規(guī)ICSI后，放入預(yù)先在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為6%的CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜的FALON培養(yǎng)皿的ART-1026培養(yǎng)液微滴中，置入COOK培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為6%、O2體積分?jǐn)?shù)為5%。受精后第3天，除移植和冷凍的胚胎外，剩余胚胎轉(zhuǎn)移入預(yù)先在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為6%的CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜的ART-1029培養(yǎng)液微滴中，置入COOK培養(yǎng)箱行囊胚培養(yǎng)。

1.4 胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)及胚胎選擇4組研究對象均于受精后16～18 h進(jìn)行原核評估，受精后第3天卵裂期胚胎依據(jù)Istanbul共識[7]進(jìn)行評分，細(xì)胞數(shù)為7～9個，碎片程度小于10%的胚胎視為優(yōu)質(zhì)胚胎，受精后5～6 d參考Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行囊胚評分，評分為3期及3期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層評分不含C的囊胚視為優(yōu)質(zhì)囊胚。TLT-SCT組及TLT-SBT組以IVF及ICSI受精時間為起點，人工標(biāo)注胚胎發(fā)育的動力學(xué)參數(shù)，發(fā)育至2細(xì)胞時間為t2，發(fā)育至3細(xì)胞時間為t3，以此類推為t4、t5、t6、t7和t8，并記錄異常卵裂事件。本研究TLT挑選胚胎首先排除非二倍性卵裂、逆卵裂、非對稱卵裂、發(fā)育阻滯等異常卵裂模式，其次基于動力學(xué)參數(shù)cc2≤11.5 h(cc2為t3與t2之差，即2細(xì)胞發(fā)育至3細(xì)胞所需時間)，s2≤0.75 h(s2為t4與t3之差，即3細(xì)胞發(fā)育至4細(xì)胞所需時間)。

1.5 妊娠隨訪行卵裂期單胚胎移植者，于取卵后第3天移植1枚最優(yōu)質(zhì)胚胎；行單囊胚移植者，于取卵后第5天移植1枚最優(yōu)質(zhì)囊胚，移植后常規(guī)行黃體支持。移植后14 d檢測血絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)，如β-hCG≥50 IU·L-1，4～6周B超檢查見孕囊及原始心管搏動視為臨床妊娠。臨床妊娠率為臨床妊娠周期數(shù)占移植周期數(shù)的百分?jǐn)?shù)，早期流產(chǎn)率為孕早期流產(chǎn)周期數(shù)占臨床妊娠周期數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料4組患者的年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、基礎(chǔ)卵泡刺激素、抗苗勒氏管激素、竇卵泡計數(shù)、雌二醇峰值、內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組患者一般資料比較

2.2 各組受精方式占比及胚胎發(fā)育指標(biāo)4組患者的受精方式占比、正常受精率、卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組受精方式占比及胚胎發(fā)育指標(biāo)比較

2.3 各組妊娠結(jié)局所有患者均移植1枚胚胎，妊娠隨訪中，4組患者均無多胎的發(fā)生，臨床妊娠率與種植率相同。4組間臨床妊娠率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，4組間早期流產(chǎn)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TLT-SCT組的臨床妊娠率高于CMA-SCT組(P<0.05)。TLT-SBT組的臨床妊娠率與CMA-SBT組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TLT-SCT組的臨床妊娠率低于CMA-SBT組及TLT-SBT組(P<0.05)。見表3。

表3 不同胚胎篩選方法的臨床結(jié)局比較[n(%)]

3 討論

胚胎選擇在單胚胎移植中至關(guān)重要，多年來，多數(shù)生殖中心仍是基于傳統(tǒng)的胚胎評估方法評價胚胎活力，即在特定的時間點對胚胎進(jìn)行觀察，依據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)指標(biāo)如原核數(shù)、卵裂球數(shù)目、卵裂球大小及均一性、胚胎碎片、胞質(zhì)空泡等進(jìn)行評分。然而，胚胎發(fā)育是一個連續(xù)性的動態(tài)過程，僅從特定時間點對胚胎進(jìn)行觀察并不能全面了解胚胎的發(fā)育情況。TLT的出現(xiàn)為實時觀察胚胎的發(fā)育提供了可能。TLT與培養(yǎng)箱的整合產(chǎn)生了新型的胚胎培養(yǎng)與監(jiān)測系統(tǒng)，即時差成像培養(yǎng)箱。它與傳統(tǒng)培養(yǎng)箱相比，在觀察胚胎時無需將胚胎取出，能更大程度地保證胚胎培養(yǎng)微環(huán)境的穩(wěn)定。已有文獻(xiàn)報道，時差成像培養(yǎng)系統(tǒng)對IVF的妊娠圍產(chǎn)結(jié)局無不良影響，是進(jìn)行胚胎培養(yǎng)安全有效的方法[4]。更為重要的是，TLT能夠獲得更多的胚胎發(fā)育相關(guān)信息，如雙極體出現(xiàn)的時間、原核出現(xiàn)及消失時間、細(xì)胞分裂時間、囊胚腔出現(xiàn)、囊胚擴張及孵化時間，并可記錄卵裂模式，為胚胎評估提供了更多可參考的指標(biāo)[2]。然而，通過TLT評估和篩選單胚胎進(jìn)行移植能否改善臨床妊娠結(jié)局，目前尚無定論。

本研究比較了2種胚胎評估及篩選方法在卵裂期單胚胎移植及單囊胚移植中的妊娠結(jié)局，結(jié)果顯示，在卵裂期單胚胎移植中，采用TLT篩選胚胎與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評分相比，能提高妊娠率。而在單囊胚移植中，2種方法妊娠結(jié)局無差異。此外，應(yīng)用TLT篩選胚胎行卵裂期單胚胎移植的妊娠結(jié)局雖優(yōu)于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評分，但其妊娠率及種植率仍低于單囊胚移植。

本研究所基于的動力學(xué)參數(shù)s2和cc2已被多中心報道能夠很好地預(yù)測胚胎發(fā)育潛能[9-10]，且有研究表明，非二倍性卵裂、逆卵裂、非對稱卵裂、發(fā)育阻滯等異常卵裂模式會影響胚胎的發(fā)育潛能，導(dǎo)致囊胚形成率降低[11]。本研究TLT組篩選胚胎排除了可能影響胚胎發(fā)育潛能的異常卵裂，并結(jié)合能夠預(yù)示早期胚胎發(fā)育能力的時間參數(shù)，這可能是TLT組卵裂期單胚胎移植妊娠率提高的原因。此外，本研究結(jié)果顯示，單囊胚移植中兩組妊娠結(jié)局差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與Revelli等[12]研究結(jié)果一致，即當(dāng)胚胎延長培養(yǎng)至第5天時，TLT在胚胎篩選方面的優(yōu)勢消失。

有文獻(xiàn)報道，早期胚胎在體外培養(yǎng)過程中存在阻滯現(xiàn)象[13]。而囊胚培養(yǎng)通過延長體外培養(yǎng)時間，可對胚胎起到一定的篩選作用，淘汰有缺陷的胚胎，從而篩選出發(fā)育潛力更好的胚胎[14]。并且胚胎經(jīng)體外進(jìn)一步培養(yǎng)至囊胚期行移植，與子宮內(nèi)膜的同步性更好[15]。國內(nèi)有研究通過meta分析發(fā)現(xiàn)，囊胚期胚胎移植與卵裂期胚胎移植相比，可獲得更高的臨床妊娠率[16]，這可能解釋了本研究結(jié)果中，無論是采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評分挑選胚胎還是TLT輔助胚胎選擇，卵裂期單胚胎移植的臨床妊娠率均低于單囊胚移植。

然而，囊胚移植雖有諸多優(yōu)勢，目前仍存在一些問題。例如，囊胚培養(yǎng)可能對出生嬰兒的性別比產(chǎn)生影響，有研究顯示囊胚移植的男嬰率高于卵裂期[17-18]，此外，目前多數(shù)生殖中心采用的冷凍策略通常是在第3天冷凍1～2枚評分較高的胚胎，剩余胚胎繼續(xù)養(yǎng)囊胚，這就可能導(dǎo)致部分患者行囊胚培養(yǎng)后無可利用囊胚形成，從而使周期取消率增高。

綜合利弊，在臨床診療過程中，醫(yī)生需結(jié)合患者的胚胎發(fā)育情況選擇合適的移植方案，單囊胚移植為降低多胎率并保證妊娠率的首選方案，行單囊胚移植時，無需使用TLT即能獲得良好的妊娠結(jié)局，但對于第5天囊胚形成可能性較小的患者，應(yīng)用TLT行卵裂期單胚胎移植，不失為一種改善妊娠結(jié)局的有效辦法。本研究所得到的結(jié)果對臨床移植方案的選擇有一定的參考意義，但本研究屬于單個中心的回顧性研究，一些可能影響妊娠結(jié)局的相關(guān)因素未納入研究，可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定的偏倚，故仍需前瞻性隨機對照研究進(jìn)行驗證。