乳酸菌菌株分離及益生效果評(píng)價(jià)

張琳，荊海曉

(1.西安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西安 710077；2.西安理工大學(xué)，西安 710048)

乳酸菌胞內(nèi)不含有過(guò)氧化氫酶，經(jīng)過(guò)其發(fā)酵之后的糖類也能被轉(zhuǎn)化為其他酸性代謝產(chǎn)物[1-2]。目前乳酸菌一共包含45個(gè)屬，383個(gè)種和亞種。近年來(lái)，乳酸菌的已知物種每年都會(huì)增加[3]。乳酸菌根據(jù)形態(tài)特征，可被劃分為乳酸鏈球菌和桿菌[4]；根據(jù)對(duì)氧氣的需求，又可被分為厭氧菌和兼性厭氧菌[5]。

乳酸菌是生物體內(nèi)十分重要的一類細(xì)菌，在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌出一些酸性(乳酸和乙酸)活性成分[6]，這些活性成分能夠抑制腸道中有害微生物群落、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力，在降血糖，降血脂、抗氧化和抗疲勞方面具有明顯的功效[7]。隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)功能性食品的渴求日益增加，不同乳酸菌物種之間功效不同，所以，近些年不同物種的乳酸菌功能效果也成為研究熱點(diǎn)。

乳酸菌能夠?qū)⒋蠓肿游镔|(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等分解成為小分子物質(zhì)，經(jīng)過(guò)乳酸菌的協(xié)助，這些小分子物質(zhì)易被人體吸收。食品在乳酸菌發(fā)酵的過(guò)程中，也會(huì)生成維生素、鈣、磷、鉀、鐵等多種微量元素，賦予食品更加豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[8]。此外，乳酸菌在乳制品加工、肉制品制作、果蔬和泡菜加工方面也被廣泛應(yīng)用。

我國(guó)獨(dú)特的地理位置和生態(tài)氣候[9]造就了豐富的乳酸菌資源，越來(lái)越多的分類學(xué)學(xué)者逐漸開(kāi)始對(duì)我國(guó)的乳酸菌資源進(jìn)行調(diào)查和分析[10]。在我國(guó)傳統(tǒng)的酸奶和活性菌粉中就含有豐富的乳酸菌菌種資源[11]，本研究旨在從這些產(chǎn)品中分離出具有較高活性功效的乳酸菌，從而增加我國(guó)乳酸菌菌種資源[12]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

云南大理發(fā)酵的乳酸產(chǎn)品、乳酸菌菌粉：市售。

1.2 試驗(yàn)試劑

葡萄糖、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、硫酸錳、牛肉膏、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、明膠、蛋白胨和瓊脂粉。

1.3 試驗(yàn)儀器

高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋、體視鏡、顯微鏡、高速離心機(jī)。

1.4 培養(yǎng)基的制備

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母粉3 g，葡萄糖 10 g，磷酸二氫鉀2 g，瓊脂8 g，蒸餾水1000 mL。

淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，淀粉2 g，牛肉膏5 g，瓊脂8 g，蒸餾水1000 mL。

1.5 乳酸菌自由基清除率的測(cè)定

取濃度為109CFU/mL和1010CFU/mL的5種乳酸菌各1 mL，在每個(gè)樣本中添加2 mL DPPH溶液[13]，并使用離心機(jī)在6000 r/min的條件下離心5 min，測(cè)定在波長(zhǎng)為517 nm條件下的吸光值，使用無(wú)菌水代替乳酸菌作為空白對(duì)照組[14]，用乙醇溶液代替DPPH作為對(duì)照組，每組樣品選取3個(gè)平行。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(X1-X2)/X3]×100。

式中：X1為空白組的吸光值；X2為樣品的吸光值；X3為對(duì)照組的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 乳酸菌形態(tài)學(xué)鑒定

從樣品中一共分離出23株乳酸桿菌。從傳統(tǒng)的酸奶中一共分離出10個(gè)菌株，菌株編號(hào)為CCSN-1～CCSN-10；從市場(chǎng)上購(gòu)買的活性菌粉中分離獲得10個(gè)菌株，菌株編號(hào)為SSJF-1～SSJF-10；從市場(chǎng)上購(gòu)買的酸奶中分離獲得3個(gè)菌株,菌株編號(hào)為SSSN-1～SSSN-3。經(jīng)過(guò)革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)有11株顯示革蘭氏陽(yáng)性，12株顯示革蘭氏陰性。菌落的形狀主要為白色、乳白色或者微白色。23株菌珠的形態(tài)特征結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株形態(tài)特征

2.1.2 分子生物鑒定

獲得菌株之后，在實(shí)驗(yàn)室獲得DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果回來(lái)之后，將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)[15-16]，當(dāng)菌株之間的相似度高于95%時(shí)，說(shuō)明這些菌株屬于一個(gè)屬；當(dāng)基因的相似率大于99%時(shí)，說(shuō)明屬于一個(gè)物種。

由表2可知，一共分離出5個(gè)物種，分別是Lactobacillusplantarum，L.paracasei，L.rhamnosus，L.rhamnosus和L.casei[17]。

表2 菌株16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

2.2 乳酸菌功效評(píng)價(jià)

2.2.1 菌株產(chǎn)酸能力及酸度評(píng)價(jià)

5個(gè)種的乳酸菌生長(zhǎng)及酸度檢測(cè)見(jiàn)表3。

表3 菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力比較

由表3可知，不同物種的乳酸菌在生長(zhǎng)速度和增殖水平上具有很大差異，CCSN-2和CCSN-3在培養(yǎng)24 h之后，OD600 nm較其他菌株高，接近4.0；其他的3個(gè)菌株CCSN-1、CCSN-10和SSJF-8生長(zhǎng)速率都較慢，培養(yǎng)24 h之后，生長(zhǎng)速率(OD600 nm)仍然低于3.0。按照一般情況來(lái)看，生物量增高對(duì)應(yīng)的pH值也會(huì)增高，本研究中的CCSN-1雖然生長(zhǎng)速率最慢，但是產(chǎn)酸量卻不是最低的。

乳酸菌能夠產(chǎn)生多種有機(jī)酸，從而改善食物中的味道顏色和品質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)食品中的酸度來(lái)指導(dǎo)乳酸菌的發(fā)酵程度。先前的研究數(shù)據(jù)表明，發(fā)酵24 h后，乳酸菌產(chǎn)生的酸度為80～90 °T時(shí)，人們感覺(jué)到的酸度值較為適宜，可以得出，除了SSJF-8菌株，其他菌株均有較為適宜的酸度和口感。

2.2.2 菌株對(duì)膽鹽的耐受性

膽汁中含有75%的甘氨膽酸鈉和25%的?；撬徕c。高濃度的膽鹽會(huì)造成微生物中的細(xì)胞膜和DNA中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷或者死亡[18-19]。腸道中含有較高的膽鹽濃度，本研究通過(guò)對(duì)菌株中膽鹽耐受性進(jìn)行評(píng)價(jià)，人們剛剛進(jìn)食之后，消化道內(nèi)的膽鹽濃度大致為15 g/L，4 h后的膽鹽濃度大致降為3 g/L。設(shè)置膽鹽濃度為0.5%、1%和1.5%，研究5個(gè)菌株在不同的膽鹽濃度下的存活率。

由表4可知，CCSN-3在高濃度的膽鹽中具有較高的存活率，菌株還出現(xiàn)了生長(zhǎng)的情況，這表明CCSN-3菌株具有較高的膽鹽耐受性，且在高鹽濃度下能夠進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育[20]。先前的研究結(jié)果表明CCSN-3菌株的膽鹽耐受性高于鼠李糖乳酸桿菌的耐受性，具有較高的使用和研究?jī)r(jià)值。

表4 菌株在高膽鹽條件下的存活情況

2.2.3 菌株低溫耐受性評(píng)價(jià)

在低溫的環(huán)境條件下，乳酸桿菌的代謝反應(yīng)速度較慢，代謝功能容易喪失甚至出現(xiàn)死亡的情況。在4 ℃的條件下，乳酸菌內(nèi)的酶活性會(huì)降低，影響酶活性，進(jìn)而改變代謝產(chǎn)物。當(dāng)溫度低于-20 ℃時(shí)，低溫會(huì)造成乳酸菌孢內(nèi)形成冰體，從而影響細(xì)胞膜流動(dòng)性。乳酸菌需要長(zhǎng)期保存在-20 ℃，所以，選取-20 ℃作為低溫脅迫處理，并檢測(cè)冷卻過(guò)程中乳酸菌活性的變化。

由圖1可知，隨著存放時(shí)間的增長(zhǎng)，乳酸菌的活菌數(shù)逐漸減少。在-20 ℃的條件下存放10 d，CCSN-3的乳酸菌活菌數(shù)保持了較高的活性，CCSN-2和CCSN-10的菌株失活較為明顯。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在-20 ℃條件下，不同的菌株存活率存在顯著的區(qū)別，存活率較高的菌株對(duì)低溫存在明顯的脅迫抗性。

圖1 不同的乳酸桿菌在-20 ℃條件下存活率的變化

2.2.4 菌株抗氧化能力評(píng)價(jià)

乳酸菌的代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，作為一種新型的抗氧化劑，乳酸菌本身具有安全、無(wú)副作用的優(yōu)點(diǎn)。乳酸菌不僅能清除游離基，次生代謝物也具有一定的抗氧化作用。本試驗(yàn)中采用乳酸菌對(duì)DPPH自由基清除率作為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)不同的菌株對(duì)DPPH自由基的清除能力。

由圖2可知，不同的菌株抗氧化能力不同，且同一個(gè)菌株中，菌液的濃度越大，則抗氧化能力越強(qiáng)。在測(cè)試的5個(gè)菌株中，CCSN-1無(wú)論是在菌液濃度109CFU/mL還是1010CFU/mL條件下，DPPH自由基清除率都是5個(gè)菌株中最高的(65%)。CCSN-2和SSJF-8受菌液濃度影響最大，菌液濃度從109CFU/mL增大至1010CFU/mL時(shí)，DPPH自由基清除率也明顯增大。

圖2 不同濃度、不同菌株的乳酸菌的DPPH自由基清除率比較

3 小結(jié)

隨著生活水平的提高，人們對(duì)健康食品的要求也逐漸增高，為了滿足目前市場(chǎng)的要求，乳酸菌的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用在我們的生活中也開(kāi)啟了新的篇章。乳酸菌普遍存在于我們生活中，是一類對(duì)人體有益的微生物，食品中添加乳酸菌，不僅能夠延長(zhǎng)食品的保質(zhì)時(shí)間，也能讓食物擁有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

當(dāng)代的生活和乳酸菌存在著密不可分的聯(lián)系，乳酸菌是生物體內(nèi)重要的細(xì)菌群落，在人體的健康方面發(fā)揮著重要的生理功能，在增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗氧化、抑制病原真菌生長(zhǎng)、減少心血管疾病、降低血脂等方面發(fā)揮著重要的作用。近些年，隨著人們生活水平的提高，乳酸菌的功能性差異顯得更加重要，不同菌株之間的差異和怎樣有效地利用乳酸菌的益生功能逐漸成為研究重點(diǎn)。