固相萃取法在蠔油風(fēng)味物質(zhì)定量檢測中的應(yīng)用

王泰，TIN Hoe Seng

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510641；2.華南師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣州 510631)

蠔油作為福建、廣東兩省的傳統(tǒng)調(diào)味品，現(xiàn)在也深受我國其他地區(qū)消費(fèi)者的喜愛。然而，不同生產(chǎn)廠家的蠔油產(chǎn)品，因原料、生產(chǎn)工藝的差異，其揮發(fā)性醛類、醇類、酮類、羧酸類、雜原子化合物等香氣成分的含量會發(fā)生大幅變化，對蠔油成品的風(fēng)味造成極大的影響。因此，蠔油風(fēng)味物質(zhì)的精確定量檢測方法，對蠔油風(fēng)味質(zhì)量的定向提升具有重要意義。

傳統(tǒng)的樣品處理技術(shù)經(jīng)歷了液固萃取、液液萃取、固相萃取幾個階段。固相萃取技術(shù)適用于大部分食品樣品基質(zhì)的揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物的萃取[1]，具有消耗溶劑少、重復(fù)性好、處理效率高以及樣品通量大等特性，方便與高選擇性、高靈敏度的檢測系統(tǒng)聯(lián)用[2-3]，因而適用于蠔油風(fēng)味物質(zhì)的精確定量檢測。隨著高靈敏度、高選擇性的色譜-單質(zhì)譜聯(lián)用儀以及串聯(lián)質(zhì)譜儀的快速發(fā)展，2003年，美、德兩國的科學(xué)家共同研發(fā)了一種用于蔬菜、水果中痕量農(nóng)藥殘留分析的QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)方法，將水溶液中的固體樣品加鹽后經(jīng)乙腈萃取，再通過基質(zhì)分散固相萃取(dispersive-SPE)去除乙腈中存在的大部分干擾物，最后進(jìn)行檢測分析。目前，QuEChERS方法得到了長足的發(fā)展，成為檢測水果、蔬菜中農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)樣品處理方法。由于蠔油中添加了羥丙基二淀粉磷酸酯、黃原膠、焦糖色等添加劑，基質(zhì)體系較為復(fù)雜，嚴(yán)重干擾特征風(fēng)味化合物的檢測，而由于QuEChERS方法的高靈敏度與高選擇性，以及對干擾物良好的去除能力，十分適合用于特征風(fēng)味化合物的精確定量檢測實驗中。

Nguyen等[4]對產(chǎn)自中國、泰國和越南的蠔油風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)研究顯示，檢出的風(fēng)味物質(zhì)主要以醛類、醇類、呋喃類、酯類、含硫化合物、吡嗪類、酮類、芳烴類、羧酸類等化合物為主，類似的化合物在生、熟牡蠣[5]以及牡蠣酶解液[6-7]中也有檢出。參照文獻(xiàn)中檢出的風(fēng)味物質(zhì)，選擇3-呋喃甲醇、5-甲基-2-乙?；秽?、3-(甲硫基)丙醛和2-甲基-2-丁烯醛作為本文的研究物質(zhì)。這幾種風(fēng)味物質(zhì)中，呋喃類物質(zhì)的香味特征性強(qiáng)，多存在于烘烤制品中，與堅果、烤肉、焦糖等香氣類似。而醛類物質(zhì)的氣味閾值一般較低，蠔油中的醛類物質(zhì)可能是亞油酸酯和亞麻酸酯的氫過氧化物降解的產(chǎn)物，提供具有清香、果香和堅果香的芳香特質(zhì)的氣味，其具體風(fēng)味特征見表1。

表1 蠔油中的風(fēng)味化合物

本研究通過使用固相萃取方法凈化蠔油基質(zhì)，考察和比較不同凈化方法對上述幾種風(fēng)味物質(zhì)回收率的影響，并形成完整的凈化、檢測蠔油中風(fēng)味物質(zhì)的方法，可以在針對大量蠔油樣品的風(fēng)味物質(zhì)檢測工作中加以應(yīng)用。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

通過線上電商渠道，購買了6家不同生產(chǎn)廠商出品的6種蠔油，隱去具體生產(chǎn)廠商，僅以編號代稱，樣品信息見表2。

表2 蠔油樣品信息

1.2 試劑耗材

色譜純甲醇、乙腈、乙酸乙酯等：均購自美國ThermoFisher Scientific公司。

CNW Band HC-C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)、CNW Poly-Sery HLB Pro固相萃取柱(500 mg/6 mL)：上海安譜實驗科技股份有限公司；QuEChERS萃取試劑盒(產(chǎn)品編號：5982-5650)、QuEChERS通用分散試劑盒(產(chǎn)品編號：5982-0029)：美國Agilent公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：均購自上海源葉生物科技有限公司。分別用電子天平稱取一定量純品，以甲醇溶解，定容到25 mL容量瓶中。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的濃度，用移液槍分別移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，混合后用甲醇定容至10 mL，配制成濃度均為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：用甲醇稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度分別為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 主要儀器與設(shè)備

7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；HSE-12B固相萃取裝置 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；SQP Quintix 125D-1CN電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Eppendorf 5804R低溫高速冷凍離心機(jī) 艾本德中國有限公司。

1.4 方法

1.4.1 SPE小柱萃取

蠔油樣品的提?。悍Q取2.0 g樣品于離心管內(nèi)，加入20 mL高純水，渦旋混合均勻，用70 ℃水浴加熱10 min，待冷卻后，超聲提取20 min。離心管在4 ℃、10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液移入新離心管中待用。

固相萃取柱的活化、上樣和洗脫：先用6 mL甲醇活化，再用6 mL水淋洗平衡；吸取10 mL上清液過固相萃取柱上樣，以3 mL/min的流速通過填料層?；罨蜕蠘舆^程中應(yīng)始終保持填料層的濕潤。待上樣過程完成后，再用10 mL高純水淋洗填料層，抽干萃取柱內(nèi)的液體，棄去淋洗液，最后用10 mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液。

洗脫液用微弱氮?dú)饬鞔抵两?，用移液槍加?000 μL乙酸乙酯，重新復(fù)溶，過0.22 μm的尼龍濾膜后，進(jìn)GC/MS，采用SIM模式分析。

1.4.2 QuEChERS法

參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113—2018[8]的凈化步驟內(nèi)容進(jìn)行微調(diào)：稱取5 g蠔油樣品(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中。加入10 mL乙腈，同時加入Agilent 5982-5650中的鹽包1包及陶瓷均質(zhì)子1顆，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min。振蕩后，以4200 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。吸取6 mL上清液加到Agilent 5982-0029中的15 mL塑料離心管中(已經(jīng)預(yù)先加入了硫酸鎂、PSA、C18等)，再加入1顆陶瓷均質(zhì)子，搖勻后渦旋混勻1 min。以4200 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取1 mL上清液，過0.22 μm有機(jī)濾膜，用于GC-MS的測定。

1.4.3 GC/MS條件

色譜柱：DB-WAX熔融石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

氣相條件：初始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率加熱到200 ℃，再以10 ℃/min的速率加熱到230 ℃，保持3 min，最后以10 ℃/min的速率升至250 ℃并保持3 min。載氣He，流速1.2 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件: 離子源溫度設(shè)置為230 ℃，傳輸線溫度設(shè)置為250 ℃，四極桿溫度設(shè)置為150 ℃，EI離子源，電子能量為70 eV，溶劑延遲設(shè)置為4 min。SIM掃描參數(shù)見表3。

表3 風(fēng)味化合物的選擇離子掃描參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

4種風(fēng)味化合物的系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液濃度范圍為0.2～10.0 mg/L，使用GC/MS的選擇離子監(jiān)測模式采集數(shù)據(jù)，以各化合物系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為自變量，以各化合物峰的響應(yīng)值為因變量，進(jìn)行回歸分析，所得的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見表4。

表4 風(fēng)味化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

回歸曲線的結(jié)果表明，對于4種風(fēng)味化合物而言，使用SIM法掃描采集數(shù)據(jù)，獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r大于0.999，線性范圍接近兩個數(shù)量級，可以滿足后續(xù)分析檢測的要求。

2.2 SPE小柱萃取實驗

對C18和HLB兩種填料的SPE小柱進(jìn)行凈化實驗，分別檢測蠔油1的空白樣及加標(biāo)樣。空白樣按照1.4.1所述進(jìn)行處理，加標(biāo)樣在稱量樣品之后，分別加入4種風(fēng)味化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 μL，再依照1.4.1所述進(jìn)行處理?？瞻讟雍图訕?biāo)樣重復(fù)3個平行樣，實驗結(jié)果見表5。

表5 C18柱空白與加標(biāo)實驗結(jié)果比對

HLB固相萃取柱的空白與加標(biāo)實驗結(jié)果比對見表6。

表6 HLB柱空白與加標(biāo)實驗結(jié)果比對

從C18和HLB兩種SPE小柱凈化蠔油空白樣與加標(biāo)樣的實驗結(jié)果來看，加標(biāo)回收率均值的結(jié)果低于理論回收率，且RSD值較大?；厥章示档偷脑驊?yīng)是前處理過程復(fù)雜，且在不同容器之間轉(zhuǎn)移的次數(shù)較多；RSD值大意味著實驗結(jié)果的波動，樣品的平行性差，難以將SPE小柱應(yīng)用于蠔油樣品的凈化過程。

2.3 QuEChERS萃取實驗

對QuEChERS方法的凈化實驗，仍采用分別檢測蠔油空白樣及加標(biāo)樣的方法?？瞻讟蛹凹訕?biāo)樣的制備方法同2.2所述，實驗結(jié)果見表7。

表7 QuEChERS前處理空白與加標(biāo)實驗結(jié)果比對

由表7可知，QuEChERS前處理方法用于蠔油樣品的凈化，其穩(wěn)定性較SPE小柱法好，平行樣結(jié)果的RSD<15%，說明該凈化方法的波動性小。加標(biāo)回收率實驗的結(jié)果顯示，風(fēng)味化合物在蠔油樣品中的回收率在92%～110%之間，說明該凈化方法在回收率指標(biāo)方面也能夠滿足后續(xù)檢測實驗的要求。

2.4 蠔油中風(fēng)味物質(zhì)的檢測

應(yīng)用2.3中的QuEChERS方法對6種蠔油中的風(fēng)味化合物進(jìn)行凈化，并上機(jī)分析，風(fēng)味化合物的檢測結(jié)果見表8。

表8 6種蠔油中風(fēng)味化合物的檢測

由表8可知，在6種蠔油中，各種風(fēng)味化合物均有檢出，其中3-呋喃甲醇的含量在28.2～64.4 ng/g之間，有約2.3倍的差距；5-甲基-2-乙?；秽暮吭?8.2～55.7 ng/g之間，有約3.1倍的差距；3-(甲硫基)丙醛的含量在18.7～40.9 ng/g之間，有約2.2倍的差距；2-甲基-2-丁烯醛的含量在27.4～86.9 ng/g之間，有約3.2倍的差距。不同生產(chǎn)廠家的各蠔油中風(fēng)味化合物的含量、所占比例有較大差別，推測可能是所用原料產(chǎn)地、生產(chǎn)工藝的不同所致。

3 結(jié)論

本研究通過比較SPE小柱法與QuEChERS法在凈化蠔油基質(zhì)、檢測風(fēng)味物質(zhì)的前處理過程中的差別，確定了QuEChERS法是更適合蠔油風(fēng)味物質(zhì)檢測的前處理方法，結(jié)合GC/MS選擇離子檢測模式采樣，檢測方法的整體回收率在92%～110%之間，能夠滿足大量、快速檢測的需要。利用該前處理方法，對6種不同生產(chǎn)廠家的市售蠔油樣品中的風(fēng)味化合物進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示：該研究選擇的各風(fēng)味物質(zhì)均有檢出，含量在18.2～86.9 ng/g之間，濃度差別在2～3倍左右。