組學(xué)技術(shù)在旋毛蟲(chóng)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

廖成水，陳耀華，王曉利，程相朝

人類(lèi)或動(dòng)物因生食或食用未熟含旋毛蟲(chóng)的肉類(lèi)及肉制品而感染引起旋毛蟲(chóng)病，主要臨床表現(xiàn)為胃腸道、發(fā)熱、眼瞼水腫和肌肉疼痛等癥狀。旋毛蟲(chóng)易感物種超過(guò)150多種，包括所有哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)及脊椎動(dòng)物，我國(guó)超過(guò)4 000萬(wàn)人存在旋毛蟲(chóng)感染的危險(xiǎn)[1]。感染初期不出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的臨床體征變化，不易進(jìn)行及時(shí)、正確的診斷和治療，重度感染可致死亡。旋毛蟲(chóng)病不僅給畜牧業(yè)產(chǎn)品帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。自1822年首次在人體報(bào)道旋毛蟲(chóng)至今已發(fā)現(xiàn)了14種旋毛蟲(chóng)[2]，然而目前尚未見(jiàn)旋毛蟲(chóng)病的有效防治方法，其根源在于旋毛蟲(chóng)致病機(jī)制不詳。

基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)是系統(tǒng)生命科學(xué)研究的重要手段。隨著高通量測(cè)序、質(zhì)譜、色譜、核磁共振和生物信息學(xué)等技術(shù)不斷發(fā)展和完善，組學(xué)技術(shù)在病原體-宿主互作研究中的應(yīng)用日益增加，對(duì)闡明病原體生物學(xué)、感染和宿主免疫以及早期診斷標(biāo)志物、藥物靶標(biāo)和候選疫苗的篩選等方面奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[3]。本文主要綜述了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)在旋毛蟲(chóng)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用及的研究進(jìn)展(表1)，以期為后續(xù)旋毛蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、感染以及致病機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

表1 組學(xué)技術(shù)在旋毛蟲(chóng)研究中的應(yīng)用進(jìn)展Tab.1 Summary of the application of omics technology in Trichinella research

1 基因組學(xué)

基因組學(xué)是對(duì)物種整個(gè)基因組(核、線粒體)進(jìn)行核苷酸序列結(jié)構(gòu)、基因定位及功能分析的研究。2011年Mitreva等首次公布了旋毛蟲(chóng)T1 ISS195株的基因組大小為64 Mb，顯著低于具有20 140個(gè)基因的秀麗隱桿線蟲(chóng)，可編碼蛋白15 808個(gè)基因，占26.6%[4]。旋毛蟲(chóng)T1、T2、T3、T5、T7、T10、T11、T12、基因型T6、基因型T8、基因型T9和偽旋毛蟲(chóng)T4的基因組大小為46.1～51.5 Mb，編碼11 006～16 067個(gè)蛋白，每個(gè)基因片段長(zhǎng)度為2 071～3 169 bp，重復(fù)序列占6.7%～21.8%[5]。基因型T9的重復(fù)率最低，只有6.7%。ISS3株基因組的核心必需基因、重復(fù)基因和GC含量與ISS195株基本相同，但I(xiàn)SS3株基因組為50 Mb，且只有14 745個(gè)基因。Liu等報(bào)道偽旋毛蟲(chóng)T4 ISS13株的基因組為68.90 Mb，但可編碼蛋白少于ISS195株，只有12 682個(gè)基因[6]。旋毛蟲(chóng)的染色體與非寄生線蟲(chóng)相比發(fā)生內(nèi)部重排，死亡相關(guān)蛋白質(zhì)家族多于出生相關(guān)蛋白。15%的秀麗隱桿線蟲(chóng)基因構(gòu)成操縱子，但旋毛蟲(chóng)基因組未發(fā)現(xiàn)操縱子。旋毛蟲(chóng)基因組的公布不僅為研究旋毛蟲(chóng)生物學(xué)特性提供了寶貴的資源，而且從中獲得了線蟲(chóng)譜系和物種進(jìn)化中起決定性作用的分子元素。

DNA甲基化在不同條件下調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著重要作用，是寄生線蟲(chóng)生命周期階段轉(zhuǎn)換的基礎(chǔ)。旋毛蟲(chóng)生活史包括寄生宿主腸道和肌肉的成蟲(chóng)、肌幼蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)3個(gè)時(shí)期。Gao等利用MethylC-seq技術(shù)證實(shí)了旋毛蟲(chóng)T1 ISS534株基因組存在DNA甲基化[7]，成蟲(chóng)、肌幼蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)分別存在1.59%、1.22%和0.01%的甲基化。DNA甲基化是旋毛蟲(chóng)生活史轉(zhuǎn)換的一種機(jī)制，從新生到成熟過(guò)程中DNA甲基化急劇增加。旋毛蟲(chóng)DNA甲基化是首次報(bào)道線蟲(chóng)的DNA甲基化現(xiàn)象，使人們重新認(rèn)識(shí)了線蟲(chóng)發(fā)展演化進(jìn)程。

正選擇基因是旋毛蟲(chóng)病藥物和疫苗開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn)，與豬鞭蟲(chóng)、馬來(lái)絲蟲(chóng)、錫蘭鉤蟲(chóng)和秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組相比，旋毛蟲(chóng)的986個(gè)基因?yàn)檎x擇基因[8]，其中57個(gè)正選擇基因參與代謝、信號(hào)和胞漿DNA傳感通路以及與低氧和宿主毒性代謝、肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期停滯、保姆細(xì)胞形成中的DNA修復(fù)過(guò)程、抗凋亡因子、免疫調(diào)節(jié)和表觀遺傳過(guò)程的調(diào)節(jié)等相關(guān)，從而改變宿主代謝，在宿主形成保姆細(xì)胞。這項(xiàng)研究解析了旋毛蟲(chóng)寄生宿主內(nèi)生物適應(yīng)進(jìn)化的機(jī)制。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究細(xì)胞中基因全部轉(zhuǎn)錄RNA(主要是mRNA、非編碼RNA、tRNA、rRNA)的總和，即從RNA水平研究基因的結(jié)構(gòu)、功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律及基因表達(dá)特征。表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)技術(shù)、基因表達(dá)譜芯片技術(shù)和RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的主要方法。劉明遠(yuǎn)等從成蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)cDNA表達(dá)文庫(kù)及差減文庫(kù)中獲得26條DNase Ⅱ家族基因，其中15條在新生幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)[9]。偽旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)焦性谷氨酰胺肽酶1樣基因和6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶樣基因高表達(dá)，而絲氨酸蛋白酶在新生幼蟲(chóng)高表達(dá)[10]。在肌幼蟲(chóng)中蛋白酶體激活物復(fù)合亞單位3樣基因和21 kDa分泌蛋白樣基因呈高表達(dá)，成為鑒別旋毛蟲(chóng)和偽旋毛蟲(chóng)的候選基因。

Makedonka Mitreva等利用EST技術(shù)得到10 130個(gè)旋毛蟲(chóng)ESTs，3個(gè)時(shí)期存在3 262個(gè)轉(zhuǎn)錄基因，成蟲(chóng)、肌幼蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)分別為995、1 908和1 046個(gè)[11]。與秀麗隱桿線蟲(chóng)存在大量反式剪接相比，旋毛蟲(chóng)ESTs僅有少量的反式剪接，且不含線蟲(chóng)經(jīng)典的SL1和SL2反式剪接前導(dǎo)RNA序列，但具有16種特異的反式剪接前導(dǎo)RNA[12]。旋毛蟲(chóng)T1 ISS534株1 500萬(wàn)個(gè)序列標(biāo)簽和9 969個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)中，45%以上基因編碼蛋白與入侵和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[13]。其中DNase Ⅱ、絲氨酸蛋白酶、蝦紅素蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制劑等蛋白酶基因占優(yōu)勢(shì)。

microRNAs(miRNAs)在基因調(diào)控和基因進(jìn)化保守分子中具有重要作用。Padmashree等從旋毛蟲(chóng)25 368條EST、1條基因組測(cè)序序列和35 787條核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)得到11種miRNAs[14]。與秀麗隱桿線蟲(chóng)相比，從115個(gè)sRNA得到11個(gè)保守miRNA。與馬來(lái)絲蟲(chóng)相比，從130個(gè)sRNA得到12個(gè)保守miRNA，多出的一個(gè)是Trs-miR-0001，屬于含有12個(gè)前體的新型miRNA[15]。miR-1和let-7分別是第1和第2大家族miRNAs，而miR-81和miR-82只有11和26拷貝數(shù)。miR-1、let-7、miR-72、miR-87和miR-124在肌幼蟲(chóng)時(shí)期具有較高拷貝數(shù)。旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清中共發(fā)現(xiàn)let-7、miR-9、miR-1和miR-7 4個(gè)旋毛蟲(chóng)miRNA[16]。Ma等發(fā)現(xiàn)感染30 d小鼠血清miR-467a-3p、miR-467d-3p、miR-376b-3p、miR-664-3p和miR-292a-5p顯著增高[17]，這些miRNAs對(duì)宿主旋毛蟲(chóng)病有特異性的血清學(xué)診斷價(jià)值。

Liu等報(bào)道213個(gè)旋毛蟲(chóng)特有的新miRNA，其中21個(gè)保守的miRNA與后生動(dòng)物miRNA家族相似[18]。tsp-Novel-21、tsp-Novel-50a-3p和tsp-Novel-50b-3p主要分布在成蟲(chóng)，tsp-Novel-46主要集中肌幼蟲(chóng)，而tsp-Novel-108和tsp-Novel-83在3個(gè)時(shí)期均勻有較高豐度。tsp-Novel-46在成蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)表達(dá)量相對(duì)較低，但其調(diào)控6 d成蟲(chóng)ESPs中絲氨酸蛋白酶、顆粒蛋白和幾種假定蛋白的表達(dá)，如Tsp_04734、Tsp_04685和Tsp_04680[19]。旋毛蟲(chóng)3個(gè)時(shí)期發(fā)現(xiàn)少量?jī)?nèi)源性小干擾RNA，主要來(lái)源于天然反義轉(zhuǎn)錄物和轉(zhuǎn)座元件[18]，而ISS534株肌幼蟲(chóng)外泌體中鑒定出1 266個(gè)miRNAs[20]。這些研究對(duì)于了解寄生線蟲(chóng)miRNAs的分子調(diào)控和功能進(jìn)化具有重要作用。

單細(xì)胞測(cè)序是單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測(cè)序分析的一項(xiàng)新技術(shù)。Inclan-Rico等采用單細(xì)胞RNA測(cè)序從骨髓造血祖細(xì)胞鑒定得到碳酸酐酶1代謝酶[21]。碳酸酐酶1表達(dá)的骨髓造血祖細(xì)胞在旋毛蟲(chóng)感染時(shí)啟動(dòng)肥大細(xì)胞/紅細(xì)胞前體，促進(jìn)2型細(xì)胞因子反應(yīng)，減輕旋毛蟲(chóng)引起的失血。該研究揭示了宿主對(duì)抗旋毛蟲(chóng)感染過(guò)程中肥大細(xì)胞和紅細(xì)胞之間的發(fā)育關(guān)系。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)

某一個(gè)基因在不同組織、不同時(shí)間點(diǎn)、不同外界條件下表達(dá)成不同的蛋白質(zhì)，而蛋白組學(xué)是大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)化的研究基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的總和，從整體角度分析、量化蛋白質(zhì)組成成分、結(jié)構(gòu)、表達(dá)特征以及蛋白質(zhì)間相互作用、功能的動(dòng)態(tài)變化。蛋白質(zhì)組學(xué)在旋毛蟲(chóng)相關(guān)領(lǐng)域的研究主要集中在排泄分泌產(chǎn)物(Excretory-secretory products, ESPs)和蟲(chóng)體蛋白。

3.1 ESPs蛋白質(zhì)組 ESPs直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，參與核酸活性、DNA代謝、肽酶活性、離子結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程、碳水化合物代謝和蛋白修飾等，是蟲(chóng)體入侵、免疫逃避和包囊形成等互作過(guò)程的重要蛋白質(zhì)。旋毛蟲(chóng)基因組存在314～414個(gè)ESPs，而Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)顯示經(jīng)典途徑分泌蛋白和非經(jīng)典途徑分泌蛋白分別為414個(gè)和245個(gè)[22]。ESPs主要來(lái)源于桿狀細(xì)胞，3個(gè)時(shí)期ESPs組分相差較大，存在共有組分和期特異性組分。DNaseⅡ和絲氨酸蛋白酶是ESPs的主要蛋白家族，但在3個(gè)時(shí)期表達(dá)具有期特異性。

3.1.1 成蟲(chóng)ESPs蛋白質(zhì)組 ISS534株3 d成蟲(chóng)ESPs大小為16～109 kDa，但只有33 kDa可被旋毛蟲(chóng)感染8 d小鼠血清識(shí)別[23]。鑒定出的23種蛋白質(zhì)為28.13～71.62 kDa，包括絲氨酸蛋白酶、成蟲(chóng)特異性DNase II、肽酶S1A亞家族和多胱抑素樣結(jié)構(gòu)域蛋白。ISS534株3 d成蟲(chóng)ESPs中36、44、45、48/50和55 kDa蛋白可被旋毛蟲(chóng)感染19 d病人血清識(shí)別。鑒定出大小為30～60 kDa的185種蛋白質(zhì)[24]。成蟲(chóng)特異性DNase II、絲氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑是旋毛蟲(chóng)病的侵襲相關(guān)蛋白。重組絲氨酸蛋白酶rTsSP-ZH68可分別被旋毛蟲(chóng)感染8～10 d小鼠和19 d病人血清識(shí)別，可作為旋毛蟲(chóng)病早期血清診斷和疫苗候選抗原。河南豬源旋毛蟲(chóng)3.5 d成蟲(chóng)ESPs具有280個(gè)蛋白，大小為15～116 kDa，鑒定出96種蛋白質(zhì)，具有催化活性和水解酶活性的分別為51種和37種[25]。其中，半胱氨酸蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶、53 kDa和谷胱氨肽轉(zhuǎn)移酶等4種蛋白與人炎癥性腸炎的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。

旋毛蟲(chóng)ISS003株和布氏旋毛蟲(chóng)ISS002株4 d成蟲(chóng)ESPs分別具有394個(gè)和253個(gè)蛋白，大小為12～250 kDa，其中12個(gè)和9個(gè)蛋白分別可被旋毛蟲(chóng)感染和布氏旋毛蟲(chóng)感染豬血清識(shí)別，2種旋毛蟲(chóng)均包含多聚泛素B、烯酰輔酶水合酶/異構(gòu)酶YngF和多聚泛素樣蛋白[26]。偽旋毛蟲(chóng)ISS13株6 d成蟲(chóng)ESPs具有400個(gè)蛋白，28個(gè)蛋白可被偽旋毛蟲(chóng)感染26 d豬血清識(shí)別，大小為20～40 kDa，包括成蟲(chóng)特異DNase Ⅱ、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、烯醇化酶、糜蛋白酶樣彈性蛋白酶、肽酶抑制劑等[27]。偽旋毛蟲(chóng)T4 RUS 6 d成蟲(chóng)ESPs中26個(gè)免疫反應(yīng)蛋白被偽旋毛蟲(chóng)感染26 d豬血清識(shí)別，大小為20～130 kDa，得到12個(gè)蛋白質(zhì)，主要具有DNase II和絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性，參與入侵宿主、抑制宿主免疫反應(yīng)、新生幼蟲(chóng)的組織遷移、運(yùn)輸或儲(chǔ)存金屬離子等[28]。大理豬源旋毛蟲(chóng)7 d成蟲(chóng)ESPs具有17條蛋白，大小為14～120 kDa，33、35、40、43、64和120 kDa豐度較高，但只有18、27、40和43 kDa與旋毛蟲(chóng)感染42 d大鼠血清具有較強(qiáng)反應(yīng)原性[29]。

3.1.2 肌幼蟲(chóng)ESPs蛋白質(zhì)組 ISS534株6 h腸道感染性幼蟲(chóng)ESPs中29、32、35、45、52和92 kDa可被感染10 d小鼠血清識(shí)別，鑒定出54個(gè)蛋白，其中絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、DNase II家族蛋白等可作為早期診斷抗原[30]。而旋毛蟲(chóng)ISS533株6 h腸道感染性幼蟲(chóng)ESPs中發(fā)現(xiàn)45、118和165 kDa 3條蛋白酶活性帶，共鑒定出30種蛋白質(zhì)，包括絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶，并且表達(dá)量明顯高于肌幼蟲(chóng)時(shí)期[31]。

偽旋毛蟲(chóng)T4 RUS、T4 AUS和T4 USA株以及ISS534株30 d肌幼蟲(chóng)ESPs共鑒定出2 591個(gè)蛋白，其中T4 RUS：T4 USA、T4 AUS：T4 USA、T4 RUS：T4 AUS和T1：T4 USA共有65 (146)、72 (98)、43 (103)和28(147)個(gè)顯著上調(diào)(下調(diào))差異表達(dá)蛋白。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了旋毛蟲(chóng)宿主免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗壓力和信號(hào)傳導(dǎo)的功能蛋白以及調(diào)節(jié)宿主炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白[28]。ISS534株和偽旋毛蟲(chóng)ISS013株28 d肌幼蟲(chóng)ESPs共鑒定到蛋白1 027個(gè)，分別有163和31個(gè)表達(dá)上調(diào)，其中彈性蛋白酶、腸肽酶、胱抑素、鐵硫簇結(jié)合蛋白、絲氨酸蛋白酶家族蛋白、plancitoxin-1、熱休克蛋白70等參與包囊形成和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[32]。

大理豬源旋毛蟲(chóng)40 d肌幼蟲(chóng)ESPs的20條蛋白大小為10～112 kDa，豐度較高的43、45、49、53、55、56、66和112 kDa 8條蛋白與旋毛蟲(chóng)感染42 d大鼠血清具有較強(qiáng)反應(yīng)原性[29]。而河南豬源旋毛蟲(chóng)40 d肌幼蟲(chóng)ESPs大小為10～142 kDa[33]。其中，原肌球蛋白、組蛋白H2A、剪切聚腺苷酸化特異因子亞基2、Kazal4型絲氨酸蛋白酶抑制劑、犰狳極性蛋白和真核起始因子4A等是抗腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)。李美辰等用豬源旋毛蟲(chóng)35 d肌幼蟲(chóng)ESP作用于小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞，鑒定出了組蛋白H2A[34]。此外，DNase II、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、原肌球蛋白、真核起始因子4A等5種蛋白質(zhì)與自身免疫性疾病有關(guān)[35]。

pI 3～10膠條從ISS534株42 d肌幼蟲(chóng)ESPs得到150個(gè)蛋白，主要為30～60 kDa[36]。10個(gè)大小為30～40 kDa的蛋白可被旋毛蟲(chóng)感染18 d小鼠血清識(shí)別，分別為絲氨酸蛋白酶、保護(hù)性抗體靶向抗原(antigen targeted by protectiveantibodies，ATPA)、DNase II和保守假定蛋白。而pI 4～7膠條只獲得33個(gè)蛋白，大小為40～60 kDa[37]。絲氨酸蛋白酶、DNase II和胰蛋白酶等21個(gè)蛋白可被旋毛蟲(chóng)感染18 d小鼠血清識(shí)別。絲氨酸蛋白酶、DNase II、胰蛋白酶和ATPA均具有催化和水解活性。ATPA基因在3個(gè)時(shí)期均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，主要位于蟲(chóng)體表皮與桿狀體[38]。感染旋毛蟲(chóng)小鼠和病人血清對(duì)重組ATPA抗體具有良好的敏感性與特異性，可用于旋毛蟲(chóng)T1、T2、T3和T7株的ELISA早期特異性血清學(xué)診斷。

ISS003株和ISS002株肌幼蟲(chóng)ESPs共有150～200個(gè)蛋白，22種蛋白具有差異，主要包括5′-核苷酸酶、絲氨酸蛋白酶/蛋白酶、gp43和p49等糖基化和蛋白質(zhì)水解相關(guān)的蛋白[39]。其中14個(gè)為旋毛蟲(chóng)特有，8個(gè)為布氏旋毛蟲(chóng)特有(5′-核苷酸酶)，p43和蛋白酶為共有抗原。Grzelak等也發(fā)現(xiàn)22個(gè)ISS003株和18個(gè)ISS002株42 d肌幼蟲(chóng)ESPs均可被旋毛蟲(chóng)感染49 d人血清識(shí)別，大小為50～60 kDa[40]。2種旋毛蟲(chóng)都具有跨膜絲氨酸蛋白酶9、絲氨酸蛋白酶、ATPA和肌動(dòng)蛋白1，T01_7775和p49為旋毛蟲(chóng)特有，DNase IIα和T03_17187/T12_7360為布氏旋毛蟲(chóng)特有。

ISS534株42 d肌幼蟲(chóng)感染HCT-8腸上皮細(xì)胞，其中24、35和61 kDa可被旋毛蟲(chóng)感染小鼠的血清識(shí)別，共鑒定出64個(gè)蛋白質(zhì)，43個(gè)具有結(jié)合活性，23個(gè)具有水解酶、轉(zhuǎn)移酶等活性[41]。另一項(xiàng)研究報(bào)道，旋毛蟲(chóng)感染HCT-8腸上皮細(xì)胞后21、28、30、36、58、77和123 kDa分別可被旋毛蟲(chóng)感染小鼠的血清識(shí)別。從21、36和58 kDa鑒定出211個(gè)蛋白質(zhì)，其中金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶高度表達(dá)，與旋毛蟲(chóng)入侵腸上皮細(xì)胞有關(guān)[42]。

3.2 蟲(chóng)體蛋白質(zhì)組

3.2.1 成蟲(chóng)蟲(chóng)體蛋白質(zhì)組 布氏旋毛蟲(chóng)4 d成蟲(chóng)蟲(chóng)體提取物存在261個(gè)蛋白，旋毛蟲(chóng)感染10 d豬血清篩選到31個(gè)免疫反應(yīng)蛋白，大小為10～150 kDa，鑒定出29個(gè)蛋白質(zhì)，主要包括肌球蛋白-4、肌動(dòng)蛋白解聚因子1、熱休克蛋白70 kDa、應(yīng)激70蛋白、Rho GDP-解離抑制劑1、副肌球蛋白和富含絲氨酸/精氨酸剪接因子1[43]。ISS003株成蟲(chóng)粗提物的蛋白大小為15～75 kDa，用感染15 d豬血清鑒定出5′-核苷酸酶、熱休克蛋白(伴侶蛋白DnaK)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖二磷酸酶、ATP合成酶F1氨基肽酶A/I、烯醇化酶、NADP依賴型異檸檬酸脫氫酶和副肌球蛋白[44]。旋毛蟲(chóng)ISS533株7 d成蟲(chóng)蟲(chóng)體提取物存在300多個(gè)大小為10～150 kDa的蛋白[45]。旋毛蟲(chóng)感染7 d豬和鼠血清篩選到55個(gè)免疫反應(yīng)蛋白，共55種蛋白質(zhì)，其中熱休克蛋白70、14-3-3蛋白、半胱氨酸蛋白酶等可作為免疫診斷或疫苗抗原。14-3-3蛋白在成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)期均有表達(dá)，重組Ts14-3-3可被旋毛蟲(chóng)早期感染豬血清識(shí)別，可用于感染早期免疫診斷。

3.2.2 肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體蛋白質(zhì)組 ISS534株肌幼蟲(chóng)和10 h腸道感染性幼蟲(chóng)有2 885個(gè)蛋白，其中323個(gè)差異蛋白，與角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)元件、角質(zhì)層合成的調(diào)節(jié)、重塑和降解和蛻皮時(shí)激素調(diào)節(jié)以及脂肪酸生物合成、花生四烯酸代謝和粘蛋白型O-聚糖生物合成[46]。表皮膠原蛋白14、Domon結(jié)構(gòu)域蛋白、谷氨酰胺合成酶、組織蛋白酶F和NADP依賴型異檸檬酸脫氫酶是旋毛蟲(chóng)蛻皮相關(guān)蛋白，在腸道感染性幼蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平顯著高于肌幼蟲(chóng)。旋毛蟲(chóng)MSUS/MEX/91/CM株肌幼蟲(chóng)和6、18和30 h腸道感染性肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體抗原分別為106、165、59和96個(gè)，32個(gè)差異表達(dá)的蛋白大小為13～224 kDa[47]，包括過(guò)氧化物酶、小分子熱休克蛋白、肌球蛋白、ATPase AAA家族蛋白、副肌球蛋白、烯酰輔酶A水合酶等27個(gè)蛋白質(zhì)。肌幼蟲(chóng)蛋白參與氧化還原過(guò)程、肌動(dòng)蛋白絲解聚、蛋白質(zhì)肽基脯氨酸異構(gòu)化和蛋白質(zhì)折疊等生物學(xué)過(guò)程。6 h腸道感染性肌幼蟲(chóng)蛋白參與氧化還原、新陳代謝、應(yīng)激反應(yīng)和翻譯延長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程。18 h腸道感染性肌幼蟲(chóng)蛋白參與催化活性、鈣鎂結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)折疊和糖酵解等生物學(xué)過(guò)程。30 h腸道感染性肌幼蟲(chóng)蛋白參與ATP合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、翻譯延長(zhǎng)、三羧酸循環(huán)和代謝等生物學(xué)過(guò)程。這些研究為進(jìn)一步了解幼蟲(chóng)蛻皮的調(diào)控機(jī)制和蛻皮相關(guān)蛋白的功能提供重要的基礎(chǔ)。

ISS003株肌幼蟲(chóng)粗提物的大小為10～100 kDa，感染45 d豬血清鑒定出保護(hù)性抗體、53 kDa抗原、絲氨酸蛋白酶、烯醇化酶、5′-核苷酸酶、胰蛋白酶、熱休克蛋白70和副肌球蛋白靶向抗原[44]。布氏旋毛蟲(chóng)42 d肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體提取物具有272個(gè)蛋白，旋毛蟲(chóng)感染60 d豬血清篩選到30個(gè)免疫反應(yīng)蛋白，包括14-3-3蛋白、40S核糖體蛋白SA、鈣調(diào)理樣蛋白OV9M、丙?；?CoA羧化酶α鏈、Rab GDP解離抑制劑α、Secernin-3和絲氨酸蛋白酶30等25個(gè)蛋白質(zhì)[45]。ISS003株和ISS002株42 d肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體共有196個(gè)蛋白，其中23個(gè)旋毛蟲(chóng)特異，具有水解內(nèi)肽酶、核酸內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)移酶等活性，8個(gè)布氏旋毛蟲(chóng)特異，具有具有裂解酶、水解酶、異構(gòu)酶和肽酶等活性[48]。旋毛蟲(chóng)ISS62株、偽旋毛蟲(chóng)ISS13株和巴布亞旋毛蟲(chóng)ISS4120株45 d肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體蛋白大小為27～81 kDa，用旋毛蟲(chóng)感染人血清共篩選出15條免疫反應(yīng)蛋白帶，分別為7、4和4條，大小為33～67 kDa[49]。鑒定出與催化、結(jié)合和結(jié)構(gòu)活性有關(guān)的17種蛋白，參與細(xì)胞和代謝過(guò)程，有助于入侵宿主組織和幼蟲(chóng)蛻皮過(guò)程，其中延伸因子1 α、DNase IIα和線粒體反式2-烯酰輔酶A還原酶為3種旋毛蟲(chóng)共有抗原。

阿苯達(dá)唑可用于治療和預(yù)防旋毛蟲(chóng)病，ISS534株肌幼蟲(chóng)經(jīng)10 μg/mL阿苯達(dá)唑亞砜處理后檢測(cè)到3 795個(gè)蟲(chóng)體蛋白質(zhì)，417種蛋白質(zhì)存在差異表達(dá)，其中上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)分別為213種和204種[50]。阿苯達(dá)唑亞砜通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡、信號(hào)通路、氨基酸代謝和蛋白質(zhì)合成、組裝、降解等生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮殺蟲(chóng)作用。NO是一種可限制旋毛蟲(chóng)在感染宿主中生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，ISS533株肌幼蟲(chóng)經(jīng)硝普鈉脅迫后檢測(cè)到1 476個(gè)蛋白，121個(gè)蛋白差異表達(dá)，其中50個(gè)上調(diào)，71個(gè)下調(diào)[51]，與催化活性、免疫系統(tǒng)的生物學(xué)過(guò)程、代謝、細(xì)胞組成、生物粘附和大分子復(fù)合體的細(xì)胞組成相關(guān)。其中，F(xiàn)RMD5和CUT-1基因表達(dá)水平明顯升高，COX2基因表達(dá)明顯降低。

3.2.3 新生幼蟲(chóng)蟲(chóng)體蛋白質(zhì)組 ISS534株成蟲(chóng)、肌肉幼蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)3個(gè)時(shí)期蟲(chóng)體一共存在4 691個(gè)蛋白質(zhì)，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)為1 067個(gè)。新生幼蟲(chóng)上調(diào)蛋白的數(shù)量高于其他2個(gè)時(shí)期[52]。這些蛋白質(zhì)參與性成熟、代謝、碳水化合物、脂類(lèi)和核苷酸的利用等功能。其中主要精子蛋白、絲氨酸蛋白酶、鋅指蛋白等差異表達(dá)蛋白參與發(fā)育調(diào)控和宿主-寄生蟲(chóng)相互作用。

3.3 表面蛋白蛋白質(zhì)組 旋毛蟲(chóng)感染的關(guān)鍵步驟是肌幼蟲(chóng)發(fā)育成腸道感染性幼蟲(chóng)，并侵入腸道上皮細(xì)胞。表面蛋白對(duì)幼蟲(chóng)的入侵和發(fā)育至關(guān)重要?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)和腸道感染性幼蟲(chóng)分別有287和402個(gè)表面蛋白。ISS534株42 d肌幼蟲(chóng)和6 h腸道感染性幼蟲(chóng)的共有41種表面蛋白，而肌幼蟲(chóng)和腸道感染性幼蟲(chóng)分別有85種和113種特有蛋白[53]。富含半胱氨酸的清道夫受體蛋白和onchocystatin的結(jié)合和催化活性較高，與前體代謝物和能量產(chǎn)生相關(guān)，在幼蟲(chóng)入侵和發(fā)育中起重要作用。腸道感染性幼蟲(chóng)核堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝水平較高，其中SODC、DNase Ⅱ、LDLRA和SR的表達(dá)水平顯著高于肌幼蟲(chóng)，而PPIB和PKDP表達(dá)量較低。采用CTAB和脫氧膽酸鈉從ISS534株42 d肌幼蟲(chóng)表面蛋白質(zhì)分離得到12條蛋白帶。16、18、38、39、42、47和53 kDa可被感染18 d和42 d小鼠血清識(shí)別[54]。雙向電泳共檢測(cè)到33個(gè)蛋白，大小為10～66 kDa，屬于15種與代謝過(guò)程有關(guān)的蛋白質(zhì)，其中P49抗原、DNase Ⅱ家族蛋白和絲氨酸蛋白酶具有催化和水解酶活性。而ISS534株45 d肌幼蟲(chóng)具有33個(gè)表面蛋白，大小為10～66 kDa[55]。感染42 d小鼠血清識(shí)別出14個(gè)蛋白，屬于8種不同蛋白質(zhì)，其中P49抗原、DNase Ⅱ家族蛋白和絲氨酸蛋白酶具有催化和水解酶活性。感染18 d小鼠血清識(shí)別的DNase Ⅱ家族蛋白、絲氨酸蛋白酶、53 kDa抗原和Tsp_08444蛋白等可能是旋毛蟲(chóng)病早期診斷抗原。而狗源旋毛蟲(chóng)Z1、Z2、Z3、Z4株和豬源旋毛蟲(chóng)MSUS/MEX/91/CM株的表面蛋白大小為28～200 kDa，其中43、45和47 kDa是免疫反應(yīng)抗原[56]。

3.4 賴氨酸乙?；揎?賴氨酸乙?；且环N動(dòng)態(tài)且高度保守的翻譯后修飾，在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程中起關(guān)鍵作用。1 592種旋毛蟲(chóng)蛋白質(zhì)中3 872賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生乙?；揎梉57]，43.8%和13.2%位點(diǎn)分別發(fā)生在α螺旋和β折疊，43.2%未分型蛋白區(qū)域，乙?；稽c(diǎn)區(qū)域下游存在絲氨酸殘基。細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞外蛋白質(zhì)中參與生物合成和代謝等生物學(xué)過(guò)程的大量具有催化活性的蛋白被乙?；?，其中29個(gè)乙酰化蛋白與吞噬作用相關(guān)。賴氨酸乙?；?10-+10周?chē)嬖?5個(gè)保守乙酰化基序，KacS、KacR、KacH和KacN是頻率最高的基序[58]。

4 展 望

旋毛蟲(chóng)是一類(lèi)食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病病原體。基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)分析逐漸在旋毛蟲(chóng)研究領(lǐng)域中應(yīng)用。但旋毛蟲(chóng)組學(xué)的研究仍處于初級(jí)階段，應(yīng)用的技術(shù)主要為基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，并且研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)單和單一，旋毛蟲(chóng)具有14個(gè)亞種，當(dāng)前旋毛蟲(chóng)組學(xué)的研究主要集中在旋毛蟲(chóng)T1，其他13亞種的研究涉及較少或根本沒(méi)有相關(guān)研究。旋毛蟲(chóng)在宿主內(nèi)存在3個(gè)完全不一樣的時(shí)期，基因、蛋白質(zhì)水平具有很大差異性，并且蟲(chóng)體蛋白和ESPs組分相差也較大，已有研究數(shù)據(jù)并未闡明這種差異性的根本機(jī)制。同時(shí)，組學(xué)對(duì)旋毛蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、感染及致病等方面具體的調(diào)控機(jī)制研究還較少，而且在旋毛蟲(chóng)調(diào)控宿主細(xì)胞增殖、遷移等機(jī)制研究方面的應(yīng)用也有待加強(qiáng)。此外，單細(xì)胞測(cè)序等新組學(xué)技術(shù)在旋毛蟲(chóng)研究中相對(duì)較少，而多種聯(lián)合組學(xué)技術(shù)并未應(yīng)用。因此，今后將要采用新組學(xué)技術(shù)以及聯(lián)合兩種或兩種組學(xué)技術(shù)獲得更有意義、有價(jià)值的數(shù)據(jù)，從而更全面解釋旋毛蟲(chóng)基因、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為完全闡明旋毛蟲(chóng)致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：廖成水，陳耀華，王曉利，等. 組學(xué)技術(shù)在旋毛蟲(chóng)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(8)：730-732. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.101