麻黃升麻湯對(duì)急性肺損傷大鼠微生物多樣性和碳水化合物酶譜的影響*

劉明燃，宋博，王琳，孟祥龍，劉必旺，高麗，彭濤，馬艷苗

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030619；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州 450046；3.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，太原 030013)

腸缺血-再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致黏膜損傷、屏障破壞和急性炎癥反應(yīng)，常繼發(fā)于腸道和腸系膜血管疾病[1]。其可引起急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，引發(fā)炎癥、活性氧生成、血管通透性增加、促炎細(xì)胞因子釋放、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺纖維化[2]。

人類(lèi)和動(dòng)物的消化道是由數(shù)萬(wàn)億微生物細(xì)胞組成的多樣化生態(tài)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物的內(nèi)在(由宿主基因組編碼)消化能力極度不足，而微生物的關(guān)鍵作用之一是幫助宿主消化大量復(fù)雜碳水化合物。近年來(lái)基于DNA的宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)，為人類(lèi)深入探究微生物群DNA 分類(lèi)學(xué)和功能譜提供了技術(shù)支持，并將微生物群與健康、疾病聯(lián)系起來(lái)[3]。

人類(lèi)與復(fù)雜的微生物組合共同進(jìn)化，其中人類(lèi)腸道微生物群(human gut microbiota，HGM) 是新陳代謝和全身健康的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。HGM組成的異常變化與嚴(yán)重的代謝、炎癥、腫瘤疾病有關(guān)。聚糖代謝是塑造腸道微生物群動(dòng)態(tài)和進(jìn)化的關(guān)鍵因素[4]，木聚糖結(jié)構(gòu)差異也可以影響腸道微生物的組成和生長(zhǎng)[5]。

中藥復(fù)方中大多含有較多的糖類(lèi)成分，多糖越復(fù)雜，其分解所需要的酶就越多。人類(lèi)基因組最多只編碼17種酶來(lái)消化食物聚糖，特別是淀粉、蔗糖和乳糖。高度復(fù)雜和可變的植物細(xì)胞壁多糖，如木聚糖、木葡聚糖和果膠的分解需要大量不同的糖苷酶的協(xié)同作用。中藥含有多種多糖，具有多重生物活性，能夠調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗炎和抗氧化，激活菌群與免疫系統(tǒng)間的信號(hào)通路，刺激免疫細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。例如麻黃中ESP-B4多糖可以改善H1N1病毒所致的ALI，并能顯著增加小鼠腸道菌群中有益菌的豐度，發(fā)揮治療作用[6]。腸道微生物不僅能降解中藥多糖釋放有機(jī)酸、氣體和短鏈脂肪酸等發(fā)酵產(chǎn)物，同時(shí)也能降解動(dòng)物源性多聚糖及腸上皮分泌的內(nèi)源性黏蛋白[7]。腸道微生物還可彌補(bǔ)人體自身編碼糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GHs)和糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，GTs)的不足[8]，增加人參皂苷等中藥多糖類(lèi)活性成分的生物利用度[9]。

ALI屬于中醫(yī)“喘脫”“結(jié)胸”“暴喘”等范疇。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)方麻黃升麻湯能夠降低ALI 動(dòng)物模型肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，抑制 Ager-RAGE、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)p65 的轉(zhuǎn)錄活性[10]。由于腸缺血-再灌注引起ALI是一種全身繼發(fā)性疾病，從腸道穩(wěn)態(tài)失衡入手探究其發(fā)病機(jī)制可能加深對(duì)急性肺損傷的理解。

本研究借助宏基因組測(cè)序，分析腸缺血-再灌注對(duì)ALI大鼠腸道微生物多樣性及碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZy)的特點(diǎn)及差異，將從“藥物微生物組學(xué)”角度為中藥復(fù)方治療ALI提供深入的數(shù)據(jù)支持與參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar雄性大鼠，5周齡，購(gòu)自維通利華(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0005。 飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23±2) ℃，濕度(50±10)%，24 h晝夜節(jié)律光照。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥物與試劑 麻黃升麻湯(由麻黃 、升麻 、當(dāng)歸、知母 、黃芩、玉竹、白芍、天冬、桂枝、茯苓、甘草、石膏、白術(shù)、干姜組成)藥材購(gòu)自晉中市同仁堂藥房連鎖有限公司，藥材經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院吉海杰副主任藥師鑒定為正品。飲片用純化水浸泡30 min，煎煮2 次后合并濾液，濃縮4 ℃?zhèn)溆?。醋酸地塞米松?gòu)自天藥藥業(yè)(天津)股份有限公司(批號(hào)：20200416)。

1.1.3儀器 倒置熒光顯微鏡(NIKON公司，型號(hào)Ti2-U)，M220TM聚焦超聲儀(Covaris Inc.，Woburn，MA，USA)，Illumina基因組分析儀(HiseqPE150，Illumina公司)，CLC基因組工作臺(tái)(v7.0.3，CLC bio)，宏基因組圖譜統(tǒng)計(jì)分析(stampv.2.1.3)軟件。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥 將32只大鼠用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、地塞米松組(5 mg·kg-1)、麻黃升麻湯組(17 g·kg-1)，每組8只。造模前，假手術(shù)組、模型對(duì)照組給予純化水，地塞米松組、麻黃升麻湯組給予相應(yīng)藥物，灌胃，連續(xù)給藥3 d。腹腔注射10%水合氯醛0.2×10-2mL·g-1，仰臥位固定，消毒后腹部切口入腹，腸管向右撥向體外，0.9%氯化鈉溶液浸潤(rùn)的紗布濕潤(rùn)暴露腸管，暴露并游離腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery，SMA)，以無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉SMA造成小腸完全缺血后將小腸還納回腹腔，閉合腹部手術(shù)切口。持續(xù)缺血1 h后，去除無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾，恢復(fù)血供2 h，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組僅游離SMA不做夾閉。

1.2.2糞便樣本取材 治療結(jié)束后，每組隨機(jī)選取大鼠5只，結(jié)腸無(wú)菌采集糞便2～4粒，迅速置于滅菌凍存管，-80 ℃保存。

1.2.3一般情況 動(dòng)物處死后沿氣管完整取下全肺，結(jié)扎右肺上葉后用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗肺部，收集BALF 1 mL，鋪在6孔板中，30 min后，待肺泡巨噬細(xì)胞完全貼壁后，隨機(jī)選取5個(gè)視野在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)[11]。

1.2.4肺組織病理組織學(xué)觀察 冰上取左肺后，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察肺組織病理形態(tài)的變化。

1.2.5大鼠糞便總DNA提取與宏基因組建庫(kù) 利用糞便基因組DNA 提取試劑盒提取糞便樣品中微生物基因組DNA。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。將純化后的DNA隨機(jī)打斷成小片段長(zhǎng)度為350 bp，質(zhì)量達(dá)到建庫(kù)要求的樣本采用Illumina Hiseq平臺(tái)測(cè)序。

1.2.6宏基因組測(cè)序 ①數(shù)據(jù)評(píng)估及質(zhì)控。對(duì)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)通過(guò)FastQC軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，去除Illumina平臺(tái)的Fastq序列中的接頭，并根據(jù)堿基質(zhì)量值對(duì)Fastq進(jìn)行修剪。Raw Reads通過(guò)堿基識(shí)別的分析手段將原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為FASTQ文件格式存儲(chǔ)。使用FastQC評(píng)估樣本測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，通過(guò)Trimmomatic軟件的2種過(guò)濾模式，分別對(duì)應(yīng)SE和PE測(cè)序數(shù)據(jù)，過(guò)濾處理原始數(shù)據(jù)得到Clean數(shù)據(jù)。

②拼接組裝、預(yù)測(cè)及基因集構(gòu)建。使用IDBA_UD進(jìn)行組裝拼接成長(zhǎng)序列，根據(jù)reads間的overlap關(guān)系，獲得contigs，經(jīng)多次調(diào)整參數(shù)后獲得最優(yōu)組裝結(jié)果，選擇最佳組裝結(jié)果。采用Prodigal對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)，選擇長(zhǎng)度≥100 bp的基因，并將其翻譯成氨基酸序列。采用CD-HIT軟件進(jìn)行去冗余，獲得非冗余的基因集。

③生物信息學(xué)分析。該步驟以bowtie2工具進(jìn)行比對(duì)，將基因集和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、CAZy等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得基因的物種注釋信息和功能注釋信息、功能和物種豐度。

基于以上結(jié)果進(jìn)行物種與功能組成分析、物種與功能差異分析、樣本比較分析等，對(duì)結(jié)果做可視化展示，挖掘數(shù)據(jù)中的有效信息，揭露隱含的規(guī)律，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)假設(shè)和發(fā)現(xiàn)新的問(wèn)題。數(shù)據(jù)分析由生工生物工程(上海)有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1大鼠肺巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及肺組織、結(jié)腸組織病理變化 通過(guò)麻黃升麻湯對(duì)ALI過(guò)度應(yīng)答反應(yīng)的干預(yù)發(fā)現(xiàn)，麻黃升麻湯能夠降低ALI致炎后肺泡巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量(P<0.05)(圖1)。

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.麻黃升麻湯組；D.地塞米松組。①與模型對(duì)照組比較，t=-11.452～4.514，P<0.05。圖1 4組大鼠肺巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況 A.sham group；B.model control group；C.Mahuang Shengma decoction group；D.dexamethasone group.①Compared with model control group，t=-11.452—4.514，P< 0.05.Fig.1 Pulmonary macrophage infiltration in four groups of rats

對(duì)大鼠肺、結(jié)腸遠(yuǎn)端組織進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠細(xì)支氣管、肺泡及小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)正常，肺泡間質(zhì)內(nèi)輕度充血；模型對(duì)照組可見(jiàn)細(xì)支氣管及肺泡擴(kuò)張充血，肺泡間炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；麻黃升麻湯組肺泡間質(zhì)內(nèi)輕度充血，細(xì)支氣管、肺泡及小動(dòng)脈未見(jiàn)異常；地塞米松組肺泡間見(jiàn)少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。結(jié)腸遠(yuǎn)端組織病理結(jié)果顯示，假手術(shù)組黏膜及黏膜以下肌層未見(jiàn)特殊；模型對(duì)照組黏膜皺襞擴(kuò)張，間質(zhì)疏松水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；麻黃升麻湯組黏膜未見(jiàn)著變，肌層及漿膜結(jié)構(gòu)正常；地塞米松組黏膜糜爛，黏膜下疏松水腫，少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。

2.2物種分布——微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1門(mén)(Phylum)水平分布 給藥治療后，各組大鼠的腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)構(gòu)成及相對(duì)豐度見(jiàn)圖3。腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門(mén)以厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)為主。其中模型對(duì)照組擬桿菌門(mén)較其余3組豐度顯著降低(P<0.01)，放線菌門(mén)相較于假手術(shù)組和麻黃升麻湯組豐度升高(P<0.05)，地塞米松組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度最高，為64%，高于其他3組(P<0.01)。 擬桿菌門(mén)是人或動(dòng)物腸道內(nèi)的常在菌，主要作用于類(lèi)固醇、膽汁酸及多糖的代謝，也可以幫助宿主對(duì)多糖的吸收及蛋白質(zhì)的合成，但有時(shí)也會(huì)成為病原菌[12]。假手術(shù)組、模型對(duì)照組和麻黃升麻湯組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度分別為45%，47%，57%。變形菌門(mén)是細(xì)菌門(mén)中最龐大的一門(mén)，包括很多致病性細(xì)菌，如大腸埃希菌、幽門(mén)螺桿菌、沙門(mén)菌、霍亂弧菌等。地塞米松組變形菌門(mén)相對(duì)豐度最高，占比為 6%，與地塞米松組比較，其余3組均降低，其中 麻黃升麻湯組最低，為1%。

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.麻黃升麻湯組；D.地塞米松組。圖2 4組大鼠肺組織和腸組織病理形態(tài)學(xué)改變(×100) A.sham group；B.model control group；C.Mahuang Shengma decoction group；D.dexamethasone group.Fig.2 Pathomorphological changes of lung and intestine in four groups of rats(×100)

2.2.2屬(Genus)水平分布 各組大鼠腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌屬構(gòu)成及相對(duì)豐度見(jiàn)圖 3。正常菌群優(yōu)勢(shì)菌屬包括：擬桿菌屬(Bacteroides)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等；與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組擬桿菌屬、普雷沃菌屬(Prevotella)和乳桿菌屬(Lactobacillus)相對(duì)豐度均有所下降(P<0.05)；假手術(shù)組乳桿菌屬相對(duì)豐度為 11%，模型對(duì)照組、地塞米松組、麻黃升麻湯組分別為 5%，7%，6%，表明麻黃升麻湯能在一定程度上提升大鼠腸道乳桿菌比例。

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.麻黃升麻湯組；D.地塞米松組。圖3 大鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌在門(mén)和屬水平的構(gòu)成及相對(duì)豐度 A.sham group；B.model control group；C.Mahuang Shengma decoction group；D.dexamethasone group.Fig.3 Composition and relative abundance of dominant bacteria in rat gut at phylum and genus levels

2.2.3α多樣性指數(shù)分析 與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組香農(nóng)指數(shù)降低，辛普森指數(shù)升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，其余3組香農(nóng)指數(shù)均顯著升高，辛普森指數(shù)均顯著降低(P<0.01)(圖4)；上述結(jié)果提示，模型對(duì)照組大鼠腸道菌群豐富度和多樣性明顯降低，麻黃升麻湯能恢復(fù)大鼠腸道菌群豐富度和多樣性。

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.麻黃升麻湯組；D.地塞米松組。①與模型對(duì)照組比較，t=-15.542～6.482，P<0.05。圖4 4組大鼠α多樣性指數(shù)比較 A.sham group；B.model control group；C.Mahuang Shengma decoction group；D.dexamethasone group.①Compared with model control group，t=-15.542—6.482，P< 0.05.Fig.4 Comparison of α diversity index among four groups of rats

2.2.4Beta多樣性分析 Beta多樣性分析常用PCoA(principal co-ordinates analysis)觀察個(gè)體或群體間的差異。結(jié)果見(jiàn)圖5。模型對(duì)照組樣品點(diǎn)與其他各組樣品點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，表明細(xì)菌群落組成存在明顯差異，顯示進(jìn)行造模干預(yù)后可以影響正常大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)及多樣性。各治療組坐標(biāo)點(diǎn)與假手術(shù)組樣品點(diǎn)距離接近，且明顯偏離于模型對(duì)照組，提示藥物組群落組成與假手術(shù)組更相似。說(shuō)明麻黃升麻湯、地塞米松均可以調(diào)節(jié)感染后大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)。

圖5 4組大鼠不同維度菌群多樣性分布的PCoA圖 Fig.5 PCoA diagram of flora diversity distribution from different dimensions in four groups of rats

2.2.5組間差異物種的篩選 采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)篩選組間顯著差異菌種。LDA 值(2～4)可得出兩組間顯著差異菌。 顯著差異菌在假手術(shù)組、模型對(duì)照組、麻黃升麻湯組中豐度對(duì)比，見(jiàn)圖6。由差異菌在種和屬豐度對(duì)比發(fā)現(xiàn)，麻黃升麻湯組的g_Prevotella、g_Bacteroides、g_Lactobacillus、g_Ruminococcus較模型對(duì)照組升高；模型對(duì)照組s_Lactobacillus_reuteri較假手術(shù)組有所升高。

圖6 3組大鼠差異菌的種和屬豐度比較 Fig.6 Comparison of species and genus abundance of differential bacteria among three groups of rats

2.2.6KEGG功能注釋 KEGG通路中共展示6個(gè)板塊的一級(jí)信號(hào)通路注釋信息，由圖7可知，顯示新陳代謝通路的注釋水平較高，二級(jí)代謝通路中碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)表達(dá)最為顯著。進(jìn)一步注釋碳水化合物三級(jí)通路，富集表達(dá)較為顯著為蔗糖和淀粉代謝(starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、糖酵解/糖異生(glycolysis gluconeo-genesis)等是麻黃升麻湯干預(yù)ALI的主要代謝途徑。

圖7 KEGG 通路和碳水化合物通路三級(jí)注釋結(jié)果 Fig.7 Result of KEGG Pathway and three-level annotation of carbohydrate pathway

2.2.7碳水化合物活性酶注釋 CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)約有300種酶，其主要包含 GHs、 GTs、多糖裂解酶(polysaccharide lyases，PLs)等?；蚣鞍仔蛄信cCAZy數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，可得到對(duì)應(yīng)的碳水化合物活性酶注釋信息。篩選條件為E-value<1e-5。并統(tǒng)計(jì)CAZy各功能層級(jí)的豐度。GH、GT和糖類(lèi)酯解酶(carbohydrate esterase，CE)在各組中豐度較為富集，各組在GH和GT酶類(lèi)家族顯著富集的豐度對(duì)比見(jiàn)圖8。

3 討論

腸缺血-再灌注不僅會(huì)損傷腸道，還會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷遠(yuǎn)端器官，特別是引起肺損傷。缺血-再灌注誘導(dǎo)ALI的一個(gè)顯著特征是過(guò)度炎癥反應(yīng)，釋放促炎癥細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)菌源性?xún)?nèi)毒素[13]。然而，缺血-再灌注誘導(dǎo)ALI的機(jī)制尚未闡明。本研究對(duì)缺血-再灌注腸道內(nèi)容物進(jìn)行了宏基因組測(cè)序，研究了腸道微生物組成和CAZy注釋?zhuān)瑸檠芯恐兴帍?fù)方的大分子碳水化合物提供參考。

麻黃升麻湯方證的主要表現(xiàn)為咽喉不利、唾膿血、泄利不止、手足厥寒、發(fā)熱，脈沉遲，有肺閉之危，氣脫之象，臨床常用于治療間質(zhì)性肺病、肺纖維化等復(fù)雜疾病[14]。通過(guò)對(duì)麻黃升麻湯組腸道微生物組成分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為其優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。厚壁菌門(mén)可以降解和發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生丁酸鹽、乙酸鹽和丙酸鹽等短鏈脂肪酸，可調(diào)節(jié)抗炎調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)數(shù)量和功能以及上皮完整性[15]，從而降低炎癥性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[16]。擬桿菌門(mén)能夠降解蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪，氨基酸可被腸道細(xì)菌用于產(chǎn)生短鏈脂肪酸 和支鏈氨基酸[17]。大部分(> 90%)碳水化合物降解酶主要來(lái)源于隸屬于厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的微生物[18]。

本研究結(jié)果顯示，麻黃升麻湯干預(yù)后屬水平的厚壁菌屬(Firmicutes)、擬桿菌屬(Bacteroides)、普雷沃菌屬(Prevotella)及乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度較高。擬桿菌是腸道微生物群中的優(yōu)勢(shì)屬，腸道中碳水化合物的主要來(lái)源淀粉、多糖是擬桿菌的易發(fā)酵底物[19]。乳桿菌屬(Lactobacillus)能夠利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸，降低胃腸道pH值，防止致病菌的入侵和定植[20]，普雷沃菌可以合成丁酸鹽，調(diào)節(jié)宿主的代謝和免疫反應(yīng)，改善上皮細(xì)胞的完整性和屏障功能，從而預(yù)防炎癥[21]，這可能是麻黃升麻湯抑制腸缺血-再灌注過(guò)度炎癥反應(yīng)引起的肺內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)趨化、肺毛細(xì)血管損傷，保護(hù)遠(yuǎn)端靶器官的作用機(jī)制。

①與模型對(duì)照組比較，t=-10.251～3.128，P<0.05。圖8 各組大鼠碳水化合物活性酶豐度比較 ①Compared with model control group，t=-10.251—3.128，P< 0.05.Fig.8 Comparison of abundance of carbohydrate active enzymes in each group

KEGG功能注釋中，碳水化合物三級(jí)注釋發(fā)現(xiàn)蔗糖和淀粉代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、糖酵解/糖異生是麻黃升麻湯干預(yù)ALI的主要代謝途徑，這些途徑通常與碳水化合物降解的短鏈脂肪酸有關(guān)，是影響腸道微生物群組成和平衡的重要決定因素。

腸道中的碳水化合物組成對(duì)塑造腸道微生物群多樣性具有深遠(yuǎn)的影響，并通過(guò)防止病原體定植和提供次生代謝物來(lái)維持人類(lèi)健康。這種環(huán)境刺激了編碼CAZy 的復(fù)雜微生物基因庫(kù)的進(jìn)化，因?yàn)橹挥卸痰木厶腔撞拍艽┩讣?xì)菌的細(xì)胞壁。人類(lèi)擬桿菌屬通過(guò)離散的多糖利用位點(diǎn)[22]切割聚糖中的大多數(shù)糖苷鍵，來(lái)獲取和降解最復(fù)雜的聚糖[23]，產(chǎn)生SCFAs，從而被腸道內(nèi)皮吸收[24]。

從腸道微生物CAZy注釋的結(jié)果來(lái)看，各組在GHs、GTs類(lèi)家族呈現(xiàn)顯著富集的豐度對(duì)比，麻黃升麻湯組的GH2、GH13、GH43、GT4的表達(dá)顯著高于急性肺損傷組，提示麻黃升麻湯中的碳水化合物活性酶利用率較高，這可能是其促進(jìn)腸道菌群轉(zhuǎn)化吸收抗炎類(lèi)小分子物質(zhì)，發(fā)揮抗氧化、調(diào)節(jié)免疫平衡的基礎(chǔ)。

GHs用于水解碳水化合物底物(如植物細(xì)胞壁、淀粉顆粒和粘蛋白)的糖苷鍵。GH13 是主要的 α-淀粉酶家族，可水解淀粉相關(guān)碳水化合物的內(nèi)部 α-1，4-糖苷鍵，是GHs 中最大的家族，執(zhí)行淀粉或其他碳水化合物的降解，在葡萄糖循環(huán)中具有關(guān)鍵作用。GH43家族存在于許多植物細(xì)胞壁降解的微生物中，GHs通過(guò)清除機(jī)制切割復(fù)雜的碳水化合物，誘導(dǎo)自噬、DNA修復(fù)和抗氧化酶的表達(dá)[25]，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。GH2和GH3家族的酶則參與植物細(xì)胞壁的解構(gòu)[26]。GTs家族與雙糖、寡糖及多糖的合成有關(guān)，負(fù)責(zé)催化糖苷鍵斷裂，在人體微生物的適應(yīng)性和致病性方面起著重要作用。

植物乳桿菌和擬桿菌屬編碼大量 β-半乳糖苷酶[27]，瘤胃菌能夠作用于碳水化合物降解酶系統(tǒng)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組織[28]，厚壁菌門(mén)中的梭狀芽孢桿菌屬可能是復(fù)合碳水化合物的主要降解物。普雷沃菌能夠產(chǎn)生針對(duì)植物基多糖和木聚糖降解的CAZy，包括GH3家族的xylan-1、4-β-木糖苷酶、GH43的β-木糖苷酶和GH13家族的淀粉水解酶。經(jīng)過(guò)酶促作用后存在的大量未消化的淀粉能夠被屬于GH13家族的微生物酶降解。擬桿菌門(mén)編碼來(lái)自許多家族的GHs和PLs，能靶向包含目標(biāo)聚糖的所有或大部分連接[29]，本研究結(jié)果與之一致。

相同藥物在不同個(gè)體中表現(xiàn)出顯著不同的療效和毒性，影響患者的治療效果。不同α/β葡萄糖苷酶活性和微生物生物轉(zhuǎn)化潛力的個(gè)體特異性腸道微生物群，與人類(lèi)的個(gè)體差異密切相關(guān)，并與中醫(yī)的“體質(zhì)”學(xué)說(shuō)不謀而合，也就是說(shuō)微生物可能通過(guò)生物轉(zhuǎn)化或調(diào)節(jié)宿主酶影響藥物代謝。而腸道微生物群在微生物組成和代謝功能方面的可塑性將成為提高藥物療效和安全性的潛在目標(biāo)。在腸生態(tài)系統(tǒng)中，益生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌已進(jìn)化產(chǎn)生多種糖基水解酶，包括β-葡萄糖苷酶，有助于人參皂苷釋放苷元[30]。研究表明，人參多糖和大建中湯[31]可以塑造腸道微生物群結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)療效[32]。

系統(tǒng)生物學(xué)能夠揭示疾病中多組分和多靶點(diǎn)之間的潛在的復(fù)雜關(guān)聯(lián)，將為研究經(jīng)方麻黃升麻湯提供更廣闊的平臺(tái)和新穎的視角。CAZy可能代表了人類(lèi)腸道微生物群功能多樣性的一個(gè)有用的生物標(biāo)志物，有助于指導(dǎo)治療腸缺血-再灌注等黏膜屏障障礙引發(fā)的繼發(fā)感染性疾病策略，通過(guò)靶向腸道微生物群的代謝功能可能會(huì)優(yōu)化傳統(tǒng)藥物及復(fù)方的整體功效。