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    腺花素對急性肺損傷模型小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制*

    2022-08-30 08:49:34司徒杰曾誠
    醫(yī)藥導(dǎo)報 2022年9期
    關(guān)鍵詞:肺泡多糖小鼠

    司徒杰,曾誠

    (1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,廣州 510405;2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心,廣州 510006)

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是指機(jī)體遭受到非心源性內(nèi)外致病因素,造成以急性呼吸困難和難治性低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)的一類疾病[1]。既往研究認(rèn)為,ALI發(fā)病機(jī)制的本質(zhì)是中性粒細(xì)胞異常激活、炎癥因子釋放及炎癥信號通路的活化等一系列炎癥反應(yīng)的失控,最終導(dǎo)致肺組織破壞[2]。目前臨床上主要以類固醇激素為主要藥物治療手段[3]。然而,類固醇激素藥物副作用大且影響患者預(yù)后生活質(zhì)量。因此,亟需尋找不良反應(yīng)小、效果良好新型藥物治療ALI。

    Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一種跨膜受體,在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用[4]。脂多糖與TLR4結(jié)合后,通過髓樣分化因子(myeloid differentiation factor,MyD88)途徑可激活核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號,從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤和炎癥因子“爆發(fā)”等一系列炎癥反應(yīng)[5]。多項研究表明,TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活與ALI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。

    腺花素是從天然腺花香茶菜植物中提取的一種呋喃二萜類化合物[7],可以抑制過氧化物還原酶Ⅰ/Ⅱ誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞分化且殺死肝癌細(xì)胞[8]。研究報道,腺花素可通過抑制NF-κB信號通路預(yù)防及治療自身免疫性腦脊髓炎[9],提示抑制NF-κB信號通路可能是腺花素治療疾病的潛在機(jī)制。但筆者目前未見腺花素對ALI治療作用的研究報道。

    本研究擬使用氣管滴注脂多糖構(gòu)建ALI作為動物模型和脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷作為細(xì)胞模型,從體內(nèi)外水平探究腺花素對ALI的作用,檢測其對NF-κB及其上游信號的影響以探究其作用機(jī)制,為治療ALI新藥研發(fā)提供新的科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1主要材料與試劑 細(xì)胞為小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);C57BL/6雄性小鼠,無特定病原體(SPF)級,年齡6~8周,體質(zhì)量22~25 g,廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2017-0125;脂多糖 (Escherichia coli 055:B5) 、噻唑藍(lán)(MTT)購于Sigma-Aldrich。TLR4、MyD88、p-NF-кB(Ser276)、NF-кB、Bcl-2、Bax及β-Tubulin購于Abclonal Technology;兔二抗IgG購于Cell Signaling Technology;Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide,PI) 雙染凋亡試劑盒購于貝博生物公司;瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液購于雷根生物公司;PierceTMBCA Protein Assay Kit購于Thermo scientific;白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購于聯(lián)科生物公司。

    1.2實驗方法

    1.2.1造模及分組 將30只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組:正常對照組、模型對照組、地塞米松組及腺花素小、中、大劑量組(腺花素 5,10,20 mg·kg-1)[10],每組5只。0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,正常對照組給予一定量的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS),其余組分別向氣管內(nèi)滴注1 mg·mL-1脂多糖造模,造模劑量為10 mg·kg-1[11],然后記錄體質(zhì)量。造模6 h后,地塞米松組腹腔注射地塞米松5 mg·kg-1[12],腺花素小、中、大組分別腹腔注射腺花素5,10和20 mg·kg-1[9]。18 h后用戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉,記錄體質(zhì)量,取肺泡灌洗液后處死小鼠取肺組織。

    1.2.2支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺組織樣本的收集 用4 ℃預(yù)冷的無菌PBS 0.8 mL進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,重復(fù)灌洗3次,BALF的回收率達(dá)75%為合格。BALF離心10 min(4 ℃,1000×g)。分別收集上清液和沉淀,上清液用二喹啉甲酸法進(jìn)行總蛋白含量測定。沉淀部分用無菌PBS 100 μL重懸,并利用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計數(shù)。取細(xì)胞沉淀涂片進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色,在低倍鏡下計數(shù)200個細(xì)胞,根據(jù)顏色和形態(tài)學(xué)特征計數(shù)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞百分比。支氣管肺泡灌洗后分離肺組織,左肺用于蘇木精-伊紅(HE)染色,右肺-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3小鼠肺組織濕/干質(zhì)量之比 用濾紙將小鼠右肺中葉組織表面血液和水分吸干,稱質(zhì)量,記錄為濕質(zhì)量(wet mass,W)。然后將右肺組織置于70 ℃烘箱內(nèi),烘烤48 h,再次稱質(zhì)量,記錄為干質(zhì)量(dry mass,D)。計算肺組織濕/干質(zhì)量之比(W/D),判斷肺部水腫情況。

    1.2.4ELISA法檢測肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量 選用聯(lián)科生物公司ELISA試劑盒,檢測TNF-α[13]、IL-6[14]。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作,根據(jù)吸光度值(A)分別計算含量。

    1.2.5HE染色 對分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液進(jìn)行固定,然后對左肺組織進(jìn)行脫水,透明,石蠟包埋后切片(厚5 μm),進(jìn)行HE染色,觀察肺組織病理學(xué)改變。評分標(biāo)準(zhǔn)如下:①肺間質(zhì)水腫;②肺泡水腫;③炎癥細(xì)胞浸潤;④肺泡出血;⑤肺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞。根據(jù)每項標(biāo)準(zhǔn)按無、輕、中、重分別記為0,1,2,3分,計算平均分為肺組織的病理評分。

    1.2.6細(xì)胞活力檢測 采用MTT法檢測腺花素對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響。以5×103個細(xì)胞每孔的密度接種到96孔板中,用不同濃度腺花素(0,2,4,8,12,16,20,24和28 μmol·L-1)處理24 h。藥物干預(yù)結(jié)束后,每孔中加入無血清培養(yǎng)基180 μL和 0.5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,并37 ℃下避光孵育4 h。最后,吸去96孔板中液體,每孔加入二甲亞砜150 μL,并用酶標(biāo)儀在570 nm下測量每孔A值。細(xì)胞活力=(A實驗組-A正常對照組)/(A模型對照組-A正常對照組)。

    1.2.7細(xì)胞凋亡 將巨噬細(xì)胞RAW 264.7接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,正常對照組、模型對照組[15]及腺花素小、中、大劑量組[9]分別給予藥物處理12 h。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,用流式細(xì)胞儀檢測。

    1.2.8免疫印跡法(Western blotting)檢測細(xì)胞和肺組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2及Bax含量 將巨噬細(xì)胞RAW 264.7接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,正常對照組、模型對照組及腺花素小、中、大劑量組分別給予藥物處理12 h進(jìn)行制樣。將各組小鼠麻醉處死后,取100 mg左肺部組織勻漿進(jìn)行制樣。所得細(xì)胞和小鼠肺組織樣品經(jīng)過電泳、電轉(zhuǎn)及封閉過程后,分別在4 ℃下孵育抗體(稀釋倍數(shù)1:1000)過夜,次日加入兔二抗(稀釋倍數(shù)1:10 000)孵育,最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照,采用Image J 1.47v統(tǒng)計灰度值,計算TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2及Bax相對表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1小鼠基本狀態(tài) 與正常對照組比較,模型對照組活躍度降低,呼吸不順暢,體質(zhì)量明顯減輕,肺組織濕干比顯著增大,BALF中總蛋白濃度明顯升高(P<0.05);與模型對照組比較,地塞米松組和腺花素小、中、大劑量組小鼠基本狀態(tài)改善,體質(zhì)量減輕較小,肺組織濕干比明顯減小,BALF中總蛋白濃度顯著降低(P<0.05)(表1、圖1)。HE染色結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型對照組肺組織損傷嚴(yán)重,肺泡間隔增寬,肺組織間質(zhì)及肺泡腔可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,地塞米松組及腺花素小、中、大劑量組肺組織損傷改善,肺泡間隔清晰,肺泡結(jié)構(gòu)完整度較高(圖2)。對HE切片進(jìn)行評分,與正常對照組比較,模型對照組得分較高(P<0.05),肺組織損傷嚴(yán)重;與模型對照組比較,地塞米松組及腺花素小、中、大劑量均得分降低,肺組織損傷顯著改善(P<0.05)(表2)。

    表1 6組小鼠治療前后體質(zhì)量的變化比較 Tab.1 Comparison of changes of mass among six groups of mice before and after treatments

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.地塞米松組;D.腺花素小劑量組;E.腺花素中劑量組;F.腺花素大劑量組。圖2 6組小鼠肺組織HE染色 A.normal control group;B.model control group;C.dexamethasone group;D.adenanthin low dose group;E.adenanthin middle dose group;F.adenanthin high dose group.

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.地塞米松組;D.腺花素小劑量組;E.腺花素中劑量組;F.腺花素大劑量組。①與正常對照組比較,t=16.81,18.09,P<0.05;②與模型對照組比較,t=6.56~12.70,P<0.05。圖1 6組小鼠肺組織濕干比及BALF中總蛋白A.normal control group;B.model control group;C.dexamethasone group;D.adenanthin low dose group;E.adenanthin middle dose group;F.adenanthin high dose group. ①Compared with normal control group,t=16.81,18.09,P<0.05;②Compared with model control group,t=6.56—12.70,P<0.05.Fig.1 Wet-dry ratio of lung tissue and total protein in BALF in six groups of

    表2 6組小鼠肺組織病理損傷評分比較

    2.2腺花素對ALI小鼠炎癥反應(yīng)的影響 與正常對照組比較,模型對照組小鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量均顯著上升(P<0.05)(圖3),巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例顯著增大(表3);與模型對照組比較,地塞米松和腺花素中、大劑量組TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量均顯著降低(圖3)、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞比例(表3)明顯減小(P<0.05)。

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.地塞米松組;D.腺花素小劑量組;E.腺花素中劑量組;F.腺花素大劑量組。 ①與正常對照組比較,t=20.22,33.15,28.23,P<0.05;②與模型對照組比較,t=5.24~27.94,P<0.05。圖3 6組小鼠肺組織IL-1β、IL-6及TNF-α含量A.normal control group;B.model control group;C.dexamethasone group;D.adenanthin low dose group;E.adenanthin middle dose group;F.adenanthin high dose group. ①Compared with normal control group,t=20.22,33.15,28.23,P<0.05;②Compared with model control group,t=5.24—27.94,P<0.05.Fig.3 Contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α in lung tissues of six groups of

    表3 6組小鼠BALF中總細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量比較 Tab.3 Comparison of number of total cells,macrophages and neutrophils in BALF among six groups of mice

    2.3腺花素對巨噬細(xì)胞RAW264.7生長的影響 MTT結(jié)果顯示,0~12 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)腺花素對巨噬細(xì)胞RAW264.7生長無明顯抑制作用(圖4)。

    ①與0 μmol·L-1比較,t=4.42~14.14,P<0.05。圖4 腺花素對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 ①Compared with 0 μmol·L-1,t=4.42—14.14,P<0.05.Fig.4 Effect of adenanthin on RAW264.7 cell viability

    2.4腺花素對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW 264.7凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型對照組凋亡率顯著上升;與模型對照組比較,地塞米松組和腺花素小、中、大劑量組凋亡率顯著下降,表明腺花素可抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡(P<0.05)(圖5)。

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.腺花素小劑量組;D.腺花素中劑量組;E.腺花素大劑量組。①與正常對照組比較,t=22.77,P<0.05;②與模型對照組比較,t=8.20,13.49,19.21,P<0.05。圖5 5組RAW 264.7細(xì)胞凋亡率A.normal control group;B.model control group;C.adenanthin low dose group;D.adenanthin middle dose group;E.adenanthin high dose group.①Compared with normal control group,t=22.77,P<0.05;②Compared with model control group,t=8.20,13.49,19.21,P<0.05.Fig.5 Apoptosis rate of RAW 264.7 cells in five

    2.5腺花素對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路及凋亡相關(guān)蛋白的影響 Western blotting結(jié)果顯示,腺花素能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞NF-κB的磷酸化以及TLR4和MyD88蛋白的表達(dá),并伴隨促凋亡蛋白Bax顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增多(P<0.05)(圖6和表4)。上述實驗證明,腺花素可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路并降低脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡率。

    表4 5組RAW 264.7細(xì)胞TLR4、 MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白相對表達(dá)量比較 Tab.4 Comparison of relative expression of TLR4,MyD88,p-NF-κB,NF-κB,Bcl-2 and Bax in RAW 264.7 cells among five groups

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.腺花素小劑量組;D.腺花素中劑量組;E.腺花素大劑量組。圖6 5組RAW 264.7細(xì)胞TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白的表達(dá)(n=3) A.normal control group;B.model control group;C.adenanthin low dose group;D.adenanthin middle dose group;E.adenanthin high dose group.Fig.6 Expression of TLR4, MyD88,p-NF-κB,NF-κB,Bcl-2 and Bax in five groups of RAW 264.7 cells(n=3)

    2.6腺花素對脂多糖所致ALI小鼠肺組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響 Western blotting結(jié)果顯示,腺花素可抑制NF-κB的磷酸化以及TLR4和MyD88蛋白的表達(dá),并伴隨促凋亡蛋白Bax顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增多(P<0.05)(表5和圖7)。上述實驗證明,腺花素抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路并改善ALI。

    表5 5組小鼠肺組織中TLR4、 MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白相對表達(dá)量比較 Tab.5 Comparison of relative expression of TLR4, MyD88,p-NF-κB,NF-κB,Bcl-2 and Bax in lung tissues among five groups of mice

    3 討論

    隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展,治療ALI的新方法不斷涌現(xiàn),但ALI的病死率30%~50%,依然很高[16]。ALI患者接受類固醇藥物治療后,藥物引起的全身不良反應(yīng)嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[17]。因此亟需研發(fā)治療效果好、不良反應(yīng)小和價格適宜的有效藥物。本研究發(fā)現(xiàn),與脂多糖誘導(dǎo)的ALI小鼠模型對照組比較,腺花素組小鼠的基本狀態(tài)得到改善,肺組織的濕干比及BALF中總蛋白濃度明顯降低。HE染色結(jié)果顯示,腺花素各組ALI小鼠的肺組織病理損傷均改善,肺泡間隔清晰,肺泡結(jié)構(gòu)完整度較高。腺花素大劑量組的治療效果與地塞米松組接近。上述結(jié)果表明,腺花素能有效改善ALI。

    ALI具有炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子爆發(fā)等特點,導(dǎo)致彌散性功能受損、肺泡順應(yīng)性下降等臨床表現(xiàn)[18]。研究報道,腺花素可通過抑制炎癥細(xì)胞的浸潤及降低TNF-α和IL-6等炎癥因子分泌,從而預(yù)防和治療自身免疫性腦脊髓炎[9]。本實驗結(jié)果顯示,腺花素能顯著減少小鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的分泌及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。在脂多糖誘導(dǎo)的ALI體外實驗中,在0~12 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)腺花素對巨噬細(xì)胞RAW264.7生長無明顯抑制作用,且能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的凋亡,表明小劑量腺花素對細(xì)胞無毒性作用且能有效抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺部組織炎癥反應(yīng)及炎癥細(xì)胞的凋亡。

    研究表明,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化后可進(jìn)入細(xì)胞核與B細(xì)胞免疫球蛋白κ鏈啟動子結(jié)合,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[19]。作為NF-κB的上游蛋白,TLR4也有助于先天免疫反應(yīng)中炎癥遞質(zhì)的釋放[20],并且可通過激活下游MyD88和NF-κB信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[21]。為了進(jìn)一步驗證腺花素是否通過NF-κB信號通路改善脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷,本實驗分別開展了相應(yīng)的體內(nèi)外實驗。Western blotting結(jié)果顯示,腺花素抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NF-κB的磷酸化及其NF-κB信號通路上游TLR4和MyD88蛋白的表達(dá),并伴隨促凋亡蛋白Bax表達(dá)的顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增多。進(jìn)一步的體內(nèi)實驗顯示,NF-κB信號通路及凋亡相關(guān)蛋白的改變與體外細(xì)胞實驗結(jié)果一致。此外,YIN等[9]也報道腺花素可以通過抑制NF-κB信號通路預(yù)防及治療自身免疫性腦脊髓炎。因此,TLR4/MyD88/NF-κB信號級聯(lián)可能是腺花素治療ALI的重要炎癥信號通路。既往研究顯示,腺花素能靶向抑制硫氧還原蛋白-硫氧還原蛋白還原酶系統(tǒng)[22]。本實驗結(jié)果提示TLR4/MyD88/NF-κB可能是腺花素另一個重要的靶向信號。然而,腺花素抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

    A.正常對照組;B.模型對照組;C.腺花素小劑量組;D.腺花素中劑量組;E.腺花素大劑量組。圖7 5組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白的表達(dá)(n=5) A.normal control group;B.model control group;C.adenanthin low dose group;D.adenanthin middle dose group;E.adenanthin high dose group.Fig.7 Expression of TLR4,MyD88,p-NF-κB,NF-κB,Bcl-2,and Bax in lung tissues among five groups of mice(n=5)

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