常用麻醉劑對壓力超負荷的心衰小鼠心功能檢測的影響

唐富琴，任梅影，朱 雨，蹇 朝，肖穎彬

400037 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第二附屬醫(yī)院心血管外科，全軍心血管外科研究所，血管損傷與修復軍隊專業(yè)實驗室

心導管評估小鼠心功能是最準確和有效的手段，已成為明確小鼠心臟功能表型的標準方法。麻醉劑的使用可使動物在心導管操作期間保持鎮(zhèn)靜，易于操作，但麻醉劑可能對心血管功能存在較為顯著的影響。目前實驗中常用麻醉劑包括腹腔注射氯胺酮(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)、三溴乙醇(tribromoethanol)、巴比妥類(barbiturates)或吸入性麻醉劑，如異氟烷(isoflurane)。這些藥物具有不同的藥理學特征，在小鼠麻醉過程中產生不同的心血管效應。近年來研究多關注麻醉劑對正常小鼠心功能的影響，但對心臟疾病模型小鼠心功能檢測的影響鮮有報道。因此，本研究旨在探討不同麻醉劑對心衰小鼠心功能檢測的影響，研究結果有助于為心衰模型小鼠心功能評估實驗中麻醉劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗動物由陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第二附屬醫(yī)院動物中心提供(AMUWEC20201478)，所有操作程序符合陸軍軍醫(yī)大學動物倫理委員會關于動物實驗的要求及使用指南。選用8周齡、體質量20～25 g的雄性C57/BL6小鼠120只，隨機分為2部分，每部分60只，實驗小鼠置于聚丙烯籠子中(每只籠子5只小鼠)，并提供食物和水，每天保持12 h的暗光周期。根據實際經驗總結設置麻醉劑的濃度，戊巴比妥鈉：1.0%水溶液；三溴乙醇：1.2%水溶液；異氟烷：4.5%麻醉誘導，2.0%維持麻醉。

1.2 實驗方案

實驗分為2部分。第一部分共60只小鼠，隨機分為4組，每組15只小鼠，其中主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)10只，主動脈弓縮窄假手術組(Sham組)5只。第一組異氟烷吸入麻醉(2.0%體積分數(shù))，第二組腹腔注射三溴乙醇(0.2 mL/10 g)，第三組腹腔注射戊巴比妥鈉(0.05 mL/10 g)，第四組氯胺酮(0.016 mL/10 g)。

第二部分共60只小鼠，隨機分為9組；第1～3組，每組4只，行主動脈弓縮窄假手術，分別用濃度為2%、4%、6%的異氟烷麻醉；第4～6組，每組8只，行主動脈弓縮窄手術，分別用濃度為0.20 mL/10 g、0.18 mL/10 g、0.15 mL/10 g三溴乙醇麻醉；第7～9組，每組8只，行主動脈弓縮窄手術，分別用濃度為1.0%、1.5%和2.0%(體積分數(shù))的異氟烷進行麻醉。比較不同麻醉劑不同劑量下小鼠心功能的變化。

1.3 實驗方法

主動脈弓縮窄模型：C57/BL6小鼠(體質量20～25 g；年齡8～10周)異氟烷麻醉誘導后，放置于溫度可控的動物恒溫毯上。氣管插管連接呼吸機(呼吸頻率120次/min，潮氣量0.2 mL/次)。將小鼠仰臥固定后，胸前正中切開皮膚，上至胸骨上窩，下至第二肋骨水平。用顯微鑷分離胸腺暴露主動脈弓，并游離出右頸總動脈，以27 G針頭直徑縮窄主動脈弓，建立主動脈弓縮窄小鼠模型。操作完成后逐層關胸，縫皮，關閉麻醉。術后每只小鼠皮下注射0.5 mL生理鹽水補充血容量。待小鼠恢復自主呼吸后脫機拔管。Sham組開胸后不做結扎。所有小鼠飼養(yǎng)8周。觀測小鼠心臟體質量比和心臟射血分數(shù)(ejection fraction, EF)。

心導管測定心功能：將小鼠置于10倍解剖放大顯微鏡(德國萊卡體式顯微鏡M80)下行顯微手術操作以監(jiān)測平均動脈壓力。分離并暴露右頸總動脈，5-0絲線結扎近心端和遠心端，眼科剪在動脈上剪一小口，Millar導管從開口處進入右頸總動脈，打開近心端結扎線，將導管送入左心室，檢測器上顯示出壓力容積信號，固定導管。觀察波形和壓力-容積環(huán)的形態(tài)，記錄左心室內壓最大上升速率(dp/dt max)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)和左心室收縮末期壓力(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)。使用肝素生理鹽水，以防止動脈線凝血并維持血容量。

麻醉誘導時間和蘇醒時間的定義：①當小鼠麻醉給藥后即開始計時，為T0；②小鼠麻醉后仰臥體位下心跳及呼吸均勻，肌肉松弛，四肢無活動，胡須無觸碰反應，踏板反射消失，即視為達到完全麻醉狀態(tài)，此時為T1；③小鼠完全麻醉后，若小鼠的前肢開始抖動，即判定為開始復蘇，此時為T2。麻醉誘導時間= T1-T0，蘇醒時間=T2-T0。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠壓力負荷模型構建與鑒定

主動脈弓縮窄術構建小鼠壓力負荷下心力衰竭模型是一種較為經典的小鼠心衰模型。小鼠TAC術后8周，心臟代償性肥大(圖1A)，心功能顯著下降與Sham組相比，TAC術后8周小鼠心臟體質量比顯著增加(

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<0.01)，見圖1B。心臟射血分數(shù)顯著降低(

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<0.01)，見圖1C。

A：心衰小鼠(右)與正常小鼠(左)心臟大??；B：兩組小鼠心臟/身體質量比 a：P<0.05，與Sham組比較；C：兩組小鼠的EF值 a：P<0.05，與Sham組比較

2.2 不同麻醉劑對TAC和Sham小鼠麻醉效果的比較

異氟烷吸入性麻醉的誘導時間最短，10～20 s即可進入麻醉狀態(tài)。Sham組小鼠的異氟烷誘導時間為(18.20±3.11)s，TAC組小鼠的異氟烷誘導時間為(19.10±3.96)s，兩組差異無統(tǒng)計學意義，見圖2A。與異氟烷吸入性麻醉相比，其他幾種腹腔注射的麻醉藥物的誘導時間顯著延長，但其在正常小鼠和心衰小鼠中的誘導時間均無顯著差異，見圖2A。在進行心導管測量過程中，導管進入右側頸總動脈后記錄頸動脈壓力，心衰小鼠麻醉后的壓力為(93±10)mmHg(收縮壓)、(62±8)mmHg(舒張壓)(不同麻醉方式下，頸動脈壓力無顯著差異)。對心衰小鼠麻醉時，按照既往參考劑量易導致心衰小鼠在麻醉過程中出現(xiàn)死亡：異氟烷組10%(10只小鼠有1只死亡)，三溴乙醇組30%(10只小鼠有3只死亡)，戊巴比妥鈉組40%(10只小鼠有4只死亡)，氯胺酮組30%(10只小鼠有3只死亡)。心衰小鼠麻醉后的蘇醒時間明顯延長。停用異氟烷后，心衰小鼠的清醒時間為(19.70±4.06)min，顯著高于Sham組的清醒時間(

P

<0.05)。幾種腹腔注射的麻醉藥物也不同程度延長了心衰小鼠麻醉后清醒時間(

P

<0.05)，見圖2B。

A：不同麻醉劑誘導時間的比較；B：不同麻醉劑清醒時間的比較 a：P<0.05，與Sham組比較

2.3 不同麻醉劑對TAC組小鼠和Sham組小鼠的心率和心功能的影響

Sham組小鼠用異氟烷麻醉后，其心率和心功能均發(fā)生不同程度的變化。分別用2%、4%、6%的濃度進行麻醉，隨著麻醉劑量的增加，小鼠心功能指標顯著下降(圖3)。

圖3 不同濃度的異氟烷麻醉Sham組小鼠的左心室壓力-容積環(huán)

Sham組小鼠麻醉30 min后，其心率和心功能與麻醉早期(10 min)無顯著差異(

P

>0.05，圖4A、B)。但是，在心衰小鼠麻醉中，戊巴比妥鈉和氯胺酮顯著降低了小鼠麻醉30 min后的心率(

P

<0.05，圖4C)。與之相比，異氟烷吸入麻醉和三溴乙醇腹腔注射麻醉的TAC組小鼠，在麻醉過程中心率變化無差異(

P

>0.05)。戊巴比妥鈉和氯胺酮麻醉的心衰小鼠其心臟射血分數(shù)在麻醉后期(30 min)顯著降低；而異氟烷吸入麻醉和三溴乙醇腹腔注射麻醉的心衰小鼠EF值變化不明顯(圖4D)。

A：不同麻醉劑對Sham組小鼠心率影響的比較；B：不同麻醉劑對Sham組小鼠心功能影響的比較；C：不同麻醉劑對TAC組小鼠心率影響的比較 a：P<0.05，與Sham組比較；D：不同麻醉劑對TAC組小鼠心功能影響的比較 a：P<0.05，與Sham組比較

2.4 評估不同麻醉劑量對小鼠心導管結果的影響

為進一步觀察TAC組小鼠在心導管檢測時的最佳麻醉方式和麻醉劑量，本實驗對異氟烷和三溴乙醇進行了不同劑量的比較。異氟烷麻醉組，2.0%的濃度和1.5%濃度可以降低TAC組小鼠麻醉過程中的EF值，但當異氟烷濃度調整為1.0% 時，心衰小鼠EF值在麻醉過程中無明顯變化(

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>0.05)，見圖5A。腹腔注射三溴乙醇組，0.15 mL/10 g的麻醉劑量可以較好地維持TAC組小鼠麻醉過程中的EF值，見圖5B。

A：不同濃度異氟烷對TAC組小鼠心功能影響的比較；B：不同濃度三溴乙醇劑對TAC組小鼠心功能影響的比較

3 討論

心導管檢測是精確評估小鼠心功能的一種有創(chuàng)技術。具有數(shù)據精確可靠、重復性好等優(yōu)點。研究表明麻醉劑劑量與小鼠心功能密切相關，于心衰小鼠而言，因其心功能下降，更容易受到麻醉劑的影響，相關研究鮮有報導。本文選擇4種不同的麻醉劑，觀察其對心衰小鼠心功能的影響。研究結果顯示，吸入異氟烷是小鼠心導管檢測期間較安全穩(wěn)定的麻醉劑。1.5% v/v劑量的異氟烷在心衰小鼠中可以維持小鼠血壓和心率平穩(wěn)。腹腔注射三溴乙醇麻醉也有較好的麻醉效果，但在心力衰竭小鼠中，腹腔注射三溴乙醇存在安全性問題。既往文獻的推薦劑量容易導致心衰小鼠死亡。因此，對于心衰小鼠的麻醉，吸入性異氟烷可能是較好的選擇。

3.1 麻醉劑對小鼠心臟功能的影響

實驗中常用的麻醉劑對小鼠心臟功能都有一定影響，不同程度地抑制心功能，但不同麻醉劑的抑制程度不同。既往研究選用清醒小鼠作為對照，研究麻醉劑對小鼠心功能的抑制，但在小鼠清醒狀態(tài)下直接抓持，其本身會引起小鼠交感神經興奮，導致小鼠心率過快，檢測結果并非小鼠靜息心功能。因此，本研究中未設置清醒小鼠作為對照，心衰小鼠的心功能較差，過大的刺激會導致小鼠死亡。同時部分小鼠在清醒狀態(tài)下，心率和心功能變化較大，穩(wěn)定性較差。心導管檢測心功能也受操作者技術的影響，實驗中存在數(shù)次因導管放置位置不準確，小鼠出現(xiàn)心率異常現(xiàn)象，需要停止操作，待其恢復平靜后繼續(xù)測量。此外，影響心率的因素眾多，選擇合理的麻醉藥物，實現(xiàn)滿意的麻醉鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，可以抑制交感神經，減慢心律，減少抓取或手術疼痛導致的交感神經興奮，一定程度上排除了植物神經對心率的干擾。本研究在保證小鼠完全麻醉的情況下檢測心率，發(fā)現(xiàn)不同的麻醉藥物均會導致小鼠心率有一定程度的減慢，這一現(xiàn)象在心衰小鼠模型中尤為明顯。因此，本研究組認為，在麻醉小鼠的過程中，選擇對小鼠心率影響越小的麻醉藥物，可能更適合應用于心衰模型小鼠心功能檢測。

3.2 不同麻醉劑量對小鼠心臟功能的影響

本研究組選擇參考文獻推薦的劑量，不同麻醉劑都有一定的使用劑量范圍。既往數(shù)據表明，4種麻醉劑的推薦用量為：異氟烷吸入麻醉(2.0%體積分數(shù))或腹腔注射三溴乙醇(1.25%，0.2 mL/10 g)或腹腔注射戊巴比妥鈉(1%，0.05 mL/10 g)或氯胺酮(5%，0.016 mL/10 g)，在實驗中觀察到，即使對于同一種麻醉劑，當使用劑量小于推薦劑量時，雖然可以實現(xiàn)足夠的鎮(zhèn)靜作用，但是鎮(zhèn)痛效果差。如果增加麻醉劑量雖可以提供足夠的鎮(zhèn)痛作用，但是與之相關的死亡率風險和血流動力學不穩(wěn)定性增加。針對同種麻醉劑梯度劑量影響的研究結果顯示：對于心功能較差的小鼠而言，適度減低麻醉劑用量，可以保證小鼠麻醉過程中的安全。

3.3 研究的不足之處

在評估麻醉藥物對小鼠的致死率時，研究所納入的樣本量偏少，這可能導致死亡率的統(tǒng)計分析存在一定程度的偏倚。通過多次重復試驗的觀察及驗證，在本實驗所使用的麻醉劑量下，4種麻醉劑導致心衰小鼠死亡率都在可接受范圍內。在后續(xù)的研究中，將增大樣本量進行進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)：異氟烷吸入使用便捷，參數(shù)穩(wěn)定性好，更適于心衰小鼠心功能檢測。既往亦有多項研究證實異氟烷吸入麻醉更適于小鼠有創(chuàng)實驗。由于不同麻醉劑對心功能影響程度不同，對多種參數(shù)的影響程度也不同，因此實際操作時，應根據實驗需要謹慎選擇麻醉劑，并在同一實驗中保持前后麻醉劑選擇一致，麻醉劑量及條件一致，最大程度避免因麻醉劑而產生的實驗誤差。

綜上所述，對于壓力負荷誘導心衰模型小鼠的麻醉，異氟烷吸入的安全性高，對心功能的影響小，明顯優(yōu)于其他麻醉劑。