RNA傳感器IFIH1對(duì)HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

喻 琳，羅 瑩，吳 迪，洪世垣

400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院

宮頸癌在全世界女性腫瘤發(fā)病率和死亡率中都位居第四[1]。GLOBOCAN數(shù)據(jù)顯示，2018年全球新增宮頸癌確診病例570 000例，并有311 000名女性死于宮頸癌[1]。持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的最大危險(xiǎn)因素[2-3]，但HPV導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的機(jī)制尚不完全清楚。目前預(yù)防性疫苗可通過阻斷高危型HPV的初始感染來預(yù)防HPV相關(guān)癌癥的發(fā)展，但疫苗本身沒有治療效果。因此探索宮頸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)其診斷、治療和開發(fā)新的治療藥物具有重要意義。

越來越多的研究表明，HPV可通過不同機(jī)制逃逸免疫監(jiān)視，從而導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生[4-5]。先天免疫反應(yīng)是抵御病毒感染的第一道防線，其激活依賴于識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-related molecular patterns，PAMPs)的細(xì)胞模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)[6]。病毒核酸傳感器干擾素誘導(dǎo)的解旋酶C結(jié)構(gòu)域蛋白1(interferon-induced helicase C domain protein 1，IFIH1)是一個(gè)重要的細(xì)胞模式識(shí)別受體，在許多病毒的感染和復(fù)制、以及自身免疫性疾病和癌癥的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用[7-9]。IFIH1是RNA傳感器，它可以識(shí)別并結(jié)合病毒RNA，從而抑制RNA病毒的感染和復(fù)制。最近研究表明，RNA傳感器也可以抑制DNA病毒復(fù)制，如豆苗病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒等[10-13]。此外，研究表明，IFIH1在癌癥治療中起著至關(guān)重要的作用，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等[14-16]。目前，IFIH1在DNA病毒HPV感染導(dǎo)致的宮頸癌中的作用尚不清楚。因此，本研究擬在人宮頸癌細(xì)胞HeLa中探討IFIH1對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機(jī)制，并在正常上皮細(xì)胞HaCaT中探討HPV對(duì)IFIH1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HPV陰性宮頸癌細(xì)胞C33A、HPV陽性宮頸癌細(xì)胞HeLa和正常上皮細(xì)胞HaCaT均購于武漢Procell公司；DMEM高糖和MEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購于以色列Bioind公司；TRIzol試劑購于美國Invitrigen公司；PEI轉(zhuǎn)染試劑購于美國Ployscience公司；G418試劑購于美國Sigma公司；無內(nèi)毒素小提中量質(zhì)粒提取試劑盒購于北京天根公司；高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑均購于南京Vazyme公司；蛋白質(zhì)提取試劑高效RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和DAPI均購于北京Solarbio公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot檢測相關(guān)試劑盒及免疫染色封閉液購于上海碧云天公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國Corning公司；HPR標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和兔抗人IFIH1抗體均購于美國CST公司；鼠抗人GAPDH抗體和兔抗人STAT3抗體購于美國Proteintech公司；兔抗人p-STAT3抗體購于美國Abclone公司；兔抗人FLAG抗體購于美國Sigma公司；熒光二抗購于美國Invitrigen公司；T4連接酶、美國BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶均購于美國Biolabs公司。shRNA相關(guān)序列及實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)引物購于上海生物工程股份有限公司；帶FLAG標(biāo)簽的IFIH1過表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。HPV18基因組，psi-LVRU6GP、pMD2.G、pSPAX2、PSV2-neo質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

C33A細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞用含100 mL/L FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HaCaT細(xì)胞用含100 mL/L FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并靜置于含37 ℃和50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中。使用含0.25%的EDTA胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞消化傳代。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 構(gòu)建IFIH1敲低的質(zhì)粒

使用慢病毒載體psi-LVRU6GP連接shRNA靶向序列，構(gòu)建能敲低IFIH1的質(zhì)粒(shIFIH1)。對(duì)照質(zhì)粒(shNC)為載體連接一段無意序列。將合成的shRNA靶向序列正義和反義寡核苷酸鏈退火，序列見表1。按照試劑說明書操作，將psi-LVRU6GP載體使用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切。利用T4連接酶連接退火后的寡核苷酸鏈和酶切后的載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌stable3，并按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

表1 shRNA靶向序列

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

IFIH1轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長期的C33A細(xì)胞(1×106/皿)于6 cm培養(yǎng)皿中，20 h后細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，以PEI∶質(zhì)粒=3∶1的比例將帶Flag標(biāo)簽的IFIH1過表達(dá)質(zhì)粒與對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為2組：①陰性對(duì)照組(NC)；②IFIH1過表達(dá)組(O/E IFIH1)。轉(zhuǎn)染6～8 h后，將培養(yǎng)基更換為含100 mL/L FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HPV18基因組轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞(3×106/皿)于6 cm培養(yǎng)皿中，20 h后細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，以PEI∶HPV18∶psv2-neo質(zhì)粒=6∶1∶1的比例將HPV18基因組轉(zhuǎn)染進(jìn)HaCaT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6～8 h后換液，48 h后用G418溶液(800 μg/mL)篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。每2天換1次液并加藥篩選細(xì)胞，待添加G418溶液培養(yǎng)皿中無細(xì)胞死亡，且細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 慢病毒包裝與感染

取對(duì)數(shù)生長期的HEK293T細(xì)胞(1×106/皿)于6 cm培養(yǎng)皿中，20 h后細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，按照試劑說明書操作，利用PEI轉(zhuǎn)染試劑將1 μg pMD2.G質(zhì)粒，3 μg pSPAX2質(zhì)粒，4 μg shIFIH1#1質(zhì)粒、shIFIH1#2質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6～8 h后換液，48 h后收集上清，并用0.22 μm濾器過濾，所得的上清即為病毒原液，于-80 ℃保存。取對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞(1×106/皿)于6 cm培養(yǎng)皿中，20 h后細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，以培養(yǎng)基∶病毒原液=1∶1的比例感染HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后換液，并用puro溶液(1 μg/mL)篩選感染成功的細(xì)胞。待添加puro溶液培養(yǎng)皿中無細(xì)胞死亡，且細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為2組：①陰性對(duì)照組(shNC)；②實(shí)驗(yàn)組(shIFIH1#1，#2)。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)

利用TRIzol試劑法提取細(xì)胞中的總RNA，取1 μg RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到相應(yīng)的cDNA。利用qRT-PCR檢測HPV18 E6/E7、IFIH1、GAPDH的mRNA表達(dá)水平，引物序列見表2。qRT-PCR的反應(yīng)條件：95℃ 1 min(預(yù)變性)，95 ℃ 10 s(變性)，60 ℃退火，延伸，共40個(gè)循環(huán)。

表2 引物序列

1.7 Western blot

收集細(xì)胞沉淀，使用高效RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并利用BCA法測定蛋白總濃度。取20 μg蛋白上樣，在80 V 30 min，120 V 60 min的條件下經(jīng)8% SDS-PAGE分離后，350 mA恒流將分離后的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。使用5%的脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，分別加入兔抗人IFIH1抗體(1∶1 000)、兔抗人p-STAT3抗體(1∶1 000)、兔抗人STAT3抗體(1∶1 000)、兔抗人FLAG抗體(1∶1 000)、鼠抗人GAPDH抗體(1∶100 000)，4 ℃搖床孵育12～16 h；TBST洗膜5 min×5次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)，室溫?fù)u床1 h；TBST洗膜5 min×5次，利用高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒發(fā)光顯色。

1.8 實(shí)時(shí)無標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)(RTCA)

將細(xì)胞接種于RTCA的增殖板中(HeLa細(xì)胞每孔接種4 000個(gè)細(xì)胞，C33A細(xì)胞每孔接種20 000個(gè)細(xì)胞)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將增殖板置于37 ℃，50 mL/L的CO2培養(yǎng)箱中，利用RTCA Software Lite實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞的增殖情況。

1.9 CCK8法

將細(xì)胞接種于96孔板中(HeLa細(xì)胞每孔細(xì)胞數(shù)目為2 000個(gè)，C33A細(xì)胞每孔接種10 000個(gè)細(xì)胞)，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在0、24、48、72、96 h時(shí)每孔加10 μL CCK8試劑，混勻后將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，1 h后在酶標(biāo)儀450 nm處測定光密度值，并繪制生長曲線。

1.10 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將Hela細(xì)胞和C33A細(xì)胞按5×105/孔接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿6孔板時(shí)，用10 μL無菌槍頭在每孔細(xì)胞中間垂直劃線，用PBS洗2次，隨后加入3 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基，并在顯微鏡下觀察劃痕和拍照，記作0 h。將拍照后的6孔板繼續(xù)放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24 h和48 h取出，并在相同位置拍照。利用Image J 軟件計(jì)算劃痕面積。細(xì)胞遷移率按以下公式計(jì)算：

細(xì)胞遷移率=[0 h劃痕面積-24 h(48 h)劃痕面積]/0 h劃痕面積×100%

1.11 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)是將細(xì)胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，混勻后取100 μL細(xì)胞懸液(HeLa細(xì)胞4×104/孔，C33A細(xì)胞1×106/孔)到小室中，下室中添加含20% FBS的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h，取出；用棉簽擦去未穿孔的細(xì)胞，4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，結(jié)晶紫染色20 min，流水沖洗染料，晾干，顯微鏡觀察并拍照。侵襲實(shí)驗(yàn)需提前取100 μL基質(zhì)膠于上室中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，其余實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)一致。

1.12 免疫熒光

將細(xì)胞重懸至1×105/mL，取500 μL細(xì)胞接種于24孔板爬片內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗1次，取300 μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min；PBS洗3次，取300 μL 0.1% Triton X-100通透細(xì)胞15 min；PBS洗3次，取300 μL免疫染色封閉液室溫?fù)u床封閉細(xì)胞1 h；分別加入200 μL兔抗人STAT3抗體(1∶200)和兔抗人p-STAT3抗體(1∶100)4 ℃搖床12～16 h；PBS洗3次，加入200 μL熒光二抗(1∶500)，室溫避光搖床1 h；PBS洗3次，取200 μL DAPI(1∶10)染核30 min；將爬片取出封片至載玻片上，晾干后拍照。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用Student’st檢驗(yàn)比較兩組間數(shù)據(jù)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFIH1在人宮頸癌組織和HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)

為觀察IFIH1在宮頸癌組織中的表達(dá)，利用基因表達(dá)譜交互分析數(shù)據(jù)庫(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/)內(nèi)收集的306例人宮頸癌組織和13例正常人宮頸組織的分析得知，IFIH1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常宮頸組織(P<0.05，圖1A)。在HPV18陽性的宮頸癌細(xì)胞中驗(yàn)證IFIH1的表達(dá)，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組C33A細(xì)胞，HPV18陽性的HeLa細(xì)胞中IFIH1的蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01，圖1B、C)。提示HPV陽性宮頸癌的發(fā)生可能與IFIH1的高表達(dá)有關(guān)。

A：GEPIA數(shù)據(jù)庫分析IFIH1在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)；B：Western blot檢測HeLa細(xì)胞中IFIH1的蛋白表達(dá)水平；C：HeLa細(xì)胞中IFIH1蛋白水平的半定量分析；a:P<0.05，與正常宮頸組織比較；b:P<0.01，與C33A比較

2.2 轉(zhuǎn)染HPV18基因組促進(jìn)正常上皮細(xì)胞HaCaT中IFIH1的表達(dá)

本研究選擇在人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中探究HPV是否通過IFIH1促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。將HPV18基因組轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，并通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HPV18基因組的HaCaT細(xì)胞中HPV18 E6/E7 mRNA水平明顯增高(P<0.01，圖2A)，表明HaCaT細(xì)胞中HPV18基因組成功轉(zhuǎn)染。Western blot和qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常HaCaT細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染HPV18基因組的HaCaT細(xì)胞，IFIH1的蛋白水平和mRNA水平明顯增加(P<0.01，圖2B～D)。結(jié)果提示，HPV上調(diào)IFIH1可能是其誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的機(jī)制之一。

A：qRT-PCR檢測HaCaT細(xì)胞中HPV18轉(zhuǎn)染效率；B：Western blot檢測HaCaT細(xì)胞中IFIH1蛋白表達(dá)水平；C：HaCaT細(xì)胞中IFIH1蛋白水平的半定量分析；D：qRT-PCR檢測HaCaT細(xì)胞中IFIH1 mRNA水平 a:P<0.01，與NC組比較

2.3 IFIH1在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中成功敲低

為研究IFIH1在宮頸癌細(xì)胞中的作用，利用shRNA構(gòu)建敲低IFIH1的宮頸癌HeLa細(xì)胞株。Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HeLa-shIFIH1#1和HeLa-shIFIH1#2細(xì)胞中IFIH1的蛋白水平和mRNA水平均明顯降低(P<0.01，圖3)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IFIH1在HeLa細(xì)胞中成功敲低。

A：Western blot檢測HeLa細(xì)胞中IFIH1的蛋白表達(dá)水平；B：HeLa細(xì)胞中IFIH1蛋白水平的半定量分析；C：qRT-PCR檢測HeLa細(xì)胞中IFIH1的mRNA表達(dá)水平 a:P<0.01，與shNC組比較

2.4 敲低IFIH1抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖

為探究IFIH1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，使用RTCA實(shí)驗(yàn)和CCK8法檢測IFIH1敲低后對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，敲低IFIH1的HeLa細(xì)胞在48、72、96 h的增殖能力明顯減弱(P<0.05，圖4)。結(jié)果表明，敲低IFIH1后抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力。

A RTCA檢測HeLa細(xì)胞的增殖能力；B：CCK8法檢測HeLa細(xì)胞的增殖能力 a: P<0.05, b: P<0.01，與shNC組比較

2.5 敲低IFIH1抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa的遷移和侵襲

為探究IFIH1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，利用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測敲低IFIH1后對(duì)HeLa細(xì)胞橫向遷移、縱向遷移和侵襲能力的影響。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低IFIH1的HeLa細(xì)胞在24 h和48 h的劃痕愈合率明顯降低(P<0.01，圖5A、B)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，敲低IFIH1的HeLa細(xì)胞穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01，圖5C、D)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低IFIH1后，穿膜的HeLa細(xì)胞明顯少于對(duì)照組(P<0.01，圖5E、F)。結(jié)果表明，敲低IFIH1后可抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。

A：劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測HeLa細(xì)胞橫向遷移能力(×100)；B：HeLa細(xì)胞劃痕愈合率的半定量分析；C：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測HeLa細(xì)胞的遷移能力(結(jié)晶紫染色×100)；D：HeLa細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)的半定量分析；E：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測HeLa細(xì)胞的侵襲能力(結(jié)晶紫染色×100)；F：HeLa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的半定量分析 a:P<0.01，與shNC組比較

2.6 過表達(dá)IFIH1促進(jìn)C33A細(xì)胞增殖

為探究IFIH1對(duì)C33A細(xì)胞增殖的影響，利用PEI將帶FLAG標(biāo)簽的IFIH1過表達(dá)質(zhì)粒與陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IFIH1在C33A細(xì)胞中過表達(dá)成功(圖6A)。RTCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)IFIH1促進(jìn)C33A細(xì)胞的增殖(P<0.01，圖6B、C)。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，過表達(dá)IFIH1的C33A細(xì)胞在48、72、96 h的增殖能力增強(qiáng)(P<0.01，圖6D)。結(jié)果表明過表達(dá)IFIH1可以促進(jìn)C33A細(xì)胞的增殖。

A：Western blot檢測IFIH1在C33A細(xì)胞中的過表達(dá)效果；B：RTCA檢測C33A細(xì)胞的增殖能力：C：CCK8法檢測C33A細(xì)胞的增殖能力 a: P<0.01，與NC比較

2.7 過表達(dá)IFIH1促進(jìn)C33A細(xì)胞遷移和侵襲

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)IFIH1的C33A細(xì)胞在48 h劃痕愈合率明顯增加(P<0.01，圖7A、B)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，過表達(dá)IFIH1組的C33A細(xì)胞穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.01，圖7C、D)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)IFIH1后，穿膜的C33A細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(P<0.01，圖7E、F)。結(jié)果表明，過表達(dá)IFIH1可促進(jìn)C33A細(xì)胞的遷移和侵襲。

A：劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測C33A細(xì)胞橫向遷移能力(×100)；B：C33A細(xì)胞劃痕愈合率的半定量分析；C：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測HeLa細(xì)胞的縱向遷移能力(結(jié)晶紫×100)；D：HeLa細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)的半定量分析；E：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測HeLa細(xì)胞的侵襲能力(結(jié)晶紫×100)；F：HeLa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的半定量分析 a:P<0.01，與NC組比較

2.8 敲低IFIH1抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa中磷酸化STAT3蛋白的表達(dá)

為探究IFIH1在宮頸癌中發(fā)揮作用的機(jī)制，利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中IFIH1與STAT3有一定的相關(guān)性(r=0.34，P<0.01)，見圖8A，提示IFIH1可能通過STAT3通路影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低IFIH1后，HeLa細(xì)胞中STAT3蛋白水平無明顯變化，而p-STAT3蛋白水平明顯降低(P<0.01，圖8B、C)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STAT3和p-STAT3主要位于細(xì)胞核。敲低IFIH1后，STAT3和p-STAT3的定位未發(fā)生改變，STAT3的表達(dá)也無明顯變化，而p-STAT3的表達(dá)減少(P<0.01，圖8D～G)。結(jié)果表明，敲低IFIH1可抑制STAT3的磷酸化。

A：GEPIA數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌中IFIH1與STAT3的相關(guān)性；B：Western blot檢測HeLa細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平；C：HeLa細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平的半定量分析；D：免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測Hela細(xì)胞中STAT3的表達(dá)和定位(×400)；F：HeLa細(xì)胞中STAT3平均熒光強(qiáng)度的半定量分析；E：免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測HeLa細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)和定位(×400)；G：HeLa細(xì)胞中p-STAT3平均熒光強(qiáng)度的半定量分析 a:P<0.01，與shNC比較

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與HPV感染密切相關(guān)。從HPV感染到宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)緩慢且復(fù)雜的過程。在這個(gè)過程中，腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間存在著持續(xù)的斗爭。由于持續(xù)不斷的免疫壓力，腫瘤形成了不同的逃避免疫監(jiān)視的機(jī)制，從而逃避免疫系統(tǒng)的控制[17]。

一般來說，當(dāng)外界有病毒入侵時(shí)常常在第一線發(fā)揮哨兵作用的是病毒核酸傳感器。核酸傳感器包括DNA傳感器和RNA傳感器，分別識(shí)別并結(jié)合病毒DNA和RNA，從而發(fā)揮抗病毒功能。由于HPV是DNA病毒，大多數(shù)研究主要集中在DNA傳感器上。而本研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染HPV18基因組的HaCaT細(xì)胞中，作為RNA傳感器的IFIH1的mRNA水平和蛋白水平都升高。這表明IFIH1不僅可以識(shí)別病毒RNA，對(duì)DNA病毒也有一定的作用。此外，越來越多的證據(jù)表明，IFIH1的異位表達(dá)可導(dǎo)致癌細(xì)胞的生長停滯和凋亡[18-19]。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，IFIH1的高表達(dá)與良好的預(yù)后相關(guān)[20]。IFIH1可通過內(nèi)源性IFIH1/MAVS途徑和外源性Fas介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡[21]。IFIH1也可激活Caspase-3/7途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡并抑制小鼠肝癌移植瘤生長[22]。IFIH1/MAVS和促凋亡蛋白NOXA的激活協(xié)同黑色素瘤細(xì)胞凋亡，并抑制小鼠黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移[23]。目前，IFIH1與HPV誘導(dǎo)的宮頸癌的關(guān)系尚不清楚，因此對(duì)IFIH1在宮頸癌中發(fā)揮的作用的研究，可能為宮頸癌的治療和開發(fā)新的藥物提供幫助。

本研究首先利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，IFIH1在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)。其次，通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IFIH1在HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，這提示IFIH1可能參與HPV陽性宮頸癌的發(fā)生。為探討HPV感染誘導(dǎo)的宮頸癌是否與IFIH1的高表達(dá)有關(guān)，本研究將HPV18基因組轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，并利用Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測IFIH1的表達(dá)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HPV18基因組后，HaCaT細(xì)胞中IFIH1的表達(dá)上調(diào)。通過shRNA在宮頸癌HeLa細(xì)胞中敲低IFIH1，利用RTCA和CCK8法檢測其對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，敲低IFIH1的HeLa細(xì)胞增殖能力明顯減弱。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，敲低IFIH1的HeLa細(xì)胞遷移能力和侵襲能力明顯減弱。同樣，在C33A細(xì)胞中過表達(dá)IFIH1，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)C33A細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。以上結(jié)果顯示，IFIH1可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，這與IFIH1在其他癌癥細(xì)胞中所報(bào)道的作用不一致，表明IFIH1在不同癌癥細(xì)胞中發(fā)揮的作用可能不同。其具體的作用以及分子機(jī)制需要進(jìn)一步闡釋。

為了進(jìn)一步探討IFIH1在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用，本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中IFIH1與信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)有一定的相關(guān)性。STAT3是STAT家族的重要成員，其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的方式參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展[24-25]。有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中磷酸化的STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)的表達(dá)顯著升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，這表明p-STAT3可能與乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)[26]。p-STAT3在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，與腫瘤浸潤深度、血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[27]。p-STAT3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與分期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[28]。同時(shí)，有研究表明STAT3的激活與宮頸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中敲低IFIH1可抑制STAT3的磷酸化，這提示IFIH1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲可能與STAT3信號(hào)通路有關(guān)。然而，IFIH1調(diào)控STAT3磷酸化的機(jī)制以及HPV上調(diào)IFIH1的機(jī)制需做進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究證明IFIH1在宮頸癌中高表達(dá)，HPV感染可導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞中IFIH1的表達(dá)上調(diào)。敲低IFIH1抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，該抑制作用可能是通過阻礙STAT3的磷酸化實(shí)現(xiàn)。IFIH1有望成為開發(fā)新的宮頸癌治療藥物的候選靶點(diǎn)。