雙培養(yǎng)法提高涂片陰性分枝桿菌檢出率的回顧性研究

陳曉麗，葉 龍，周典蓉，趙 越，袁凱旋，歐陽峰，顧 兵

(廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510080)

分枝桿菌病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculosismycobacteria)感染易感人群引起的全身性慢性傳染病。世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《2020年全球結(jié)核病報告》[1]顯示，受新型冠狀病毒肺炎疫情影響，全球結(jié)核病(tuberculosis，TB)病死率十多年來首次上升，全球約有150萬人死于TB，病死率為15%，高于2019年的14%。據(jù)美國結(jié)核病監(jiān)測系統(tǒng)(NTSS)報告，美國2020年TB發(fā)病率為2.2/10萬，肺外結(jié)核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)約占所有TB患者的15%～20%[2-3]。目前，大部分實驗室檢測分枝桿菌的病原學方法為涂片萋-尼(Ziehl-Neelsen)法和分枝桿菌培養(yǎng)法，涂片法操作簡單、快捷，但敏感性較低，而傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時長，難以滿足臨床對早期可疑分枝桿菌感染快速診斷的需求。與涂陽分枝桿菌病相比，涂陰分枝桿菌病的鑒別仍然是診斷的挑戰(zhàn)。本研究旨在探究實驗室開展固-液雙培養(yǎng)流程對提高涂片陰性分枝桿菌檢出率的應(yīng)用價值，并明確雙培養(yǎng)流程的最佳標本應(yīng)用范圍，以期為提高實驗室分枝桿菌的檢出提供科學的參考方案。

1 資料與方法

1.1 研究資料 回顧性分析廣東省人民醫(yī)院2019年1月—2021年9月住院首診普篩送檢抗酸菌培養(yǎng)的患者，根據(jù)納入標準和排除標準篩選出研究對象，并剔除重復(fù)患者送檢的標本，按固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固-液雙培養(yǎng)進行分組。另選取涂片分枝桿菌陰性，固體、液體或固-液雙培養(yǎng)陽性的患者，將其按送檢標本部位分為肺分枝桿菌組和肺外分枝桿菌組，分析兩組患者的臨床特征。納入標準：均為初次涂片結(jié)果陰性患者。排除標準：已明確診斷分枝桿菌病的患者；艾滋病陽性、免疫系統(tǒng)疾病者；接受免疫抑制療法的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 涂片染色 參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4版)操作步驟，痰、創(chuàng)面分泌物標本直接涂片，纖支鏡沖洗液、支氣管肺泡灌洗液、無菌體液等液體標本則取離心濃縮物涂片，組織標本經(jīng)無菌研磨后取組織勻漿涂片，經(jīng)紫外線照射30 min后采用萋-尼法染色，于普通光學顯微鏡油鏡下觀察計數(shù)[4]，染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 固體法培養(yǎng) 加入與呼吸道標本等量的4% NaOH溶液，取液化完成后的離心沉淀濃縮液100 mL接種羅氏斜面培養(yǎng)基(購自江門市凱林貿(mào)易有限公司)，無菌體液、組織標本則經(jīng)前處理后取濃縮物及組織勻漿100 mL接種羅氏斜面培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)箱孵育，每周觀察并記錄培養(yǎng)結(jié)果，連續(xù)培養(yǎng)至少8周。

1.2.3 液體法培養(yǎng) 加入與呼吸道標本1～2倍體積的N-乙酰-L半胱氨酸(NALC)+2%NaOH消化液混勻靜置15 min，無菌體液、組織標本則經(jīng)前處理后取濃縮物及組織勻漿1 000 mL，加入磷酸鹽緩沖液至45 mL混勻中和，3 000×g、8～10℃離心15 min，取沉渣加入1 mL磷酸鹽緩沖液制備標本混合液。取0.5 mL標本混合液加入已制備含有0.8 mL生長添加劑/抑菌劑混合液的MGIT培養(yǎng)管，顛倒混勻置入BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀(儀器及相關(guān)配套試劑購自美國BD生物技術(shù)有限公司)，設(shè)置儀器每60 min自動監(jiān)測一次，隨時跟蹤處理儀器報陽結(jié)果，連續(xù)培養(yǎng)至少6周。

1.2.4 固-液雙培養(yǎng)法 在液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，取其處理后的標本同時進行固體培養(yǎng)，工作流程及觀察方法見圖1。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，對于符合正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標準差表示，若不符合正態(tài)分布，則以中位數(shù)(M)及百分位數(shù)(P25，P75)表示；對不符合正態(tài)分布的三組變量的兩兩比較，采用非參數(shù)秩和檢驗，α分割法，取P<0.017時差異有統(tǒng)計學差異；分類資料采用χ2檢驗或Fisher’s確切檢驗法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 共納入6 492例患者，按不同培養(yǎng)法分組，可分為固體組3 234例，液體組1 938例，雙培養(yǎng)組1 320例，253例培養(yǎng)陽性，檢出率3.90%，各組培養(yǎng)陽性檢出率分別為2.35%(76例)、4.54%(88例)、6.74%(89例)。三種培養(yǎng)法患者的臨床癥狀分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=9.338，P=0.053)。見表1。

表1 不同培養(yǎng)法患者的臨床癥狀分布(例)

涂片分枝桿菌陰性，固體、液體或固-液雙培養(yǎng)陽性的253例患者中男性143例，女性110例，平均年齡(58.34±18.47)歲。對各組檢出時間(time-to-detection，TTD)進行分析，固體組TTD為34.65(24.37，43.10)d，液體組為10.45(5.33，18.08)d，雙培養(yǎng)組為9.89(5.73，19.09)d；液體組和雙培養(yǎng)組的TTD均低于固體組，差異有統(tǒng)計學意義(Z值分別為8.508、8.430，均P<0.001)；而液體組與雙培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.021，P=0.984)。

2.2 不同培養(yǎng)法患者肺和肺外分枝桿菌檢出情況 固體組、液體組和雙培養(yǎng)組肺分枝桿菌檢出率分別為3.11%、6.02%、7.13%；肺外分枝桿菌檢出率分別為1.02%、2.68%、6.09%。固體組、液體組肺分枝桿菌陽性檢出率均高于肺外組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，而雙培養(yǎng)組肺與肺外分枝桿菌陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同培養(yǎng)法肺分枝桿菌檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=26.513，P<0.001)；液體組、雙培養(yǎng)組肺分枝桿菌檢出率均高于固體組(均P<0.001)。不同培養(yǎng)法肺外分枝桿菌檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=35.618，P<0.001)；液體組、雙培養(yǎng)組肺外分枝桿菌檢出率均高于固體組(均P<0.001)；雙培養(yǎng)組肺外分枝桿菌檢出率高于液體組(P<0.001)。見表2。

表2 不同培養(yǎng)法肺和肺外分枝桿菌檢出情況

2.3 涂片陰性培養(yǎng)陽性的標本類型分布 253例涂片陰性培養(yǎng)陽性患者送檢的標本中肺標本188份，包括痰(30.44%)、纖支鏡沖洗液(24.90%)和支氣管肺泡灌洗液(18.97%)；肺外標本65份，主要由肺外組織(11.46%)、創(chuàng)面分泌物(5.93%)和胸腔積液(3.16%)構(gòu)成。見表3。

表3 涂片陰性培養(yǎng)陽性的標本類型分布

2.4 253例患者的臨床特征分析 253例涂片陰性培養(yǎng)陽性患者中肺分枝桿菌病188例(74.31%)、肺外分枝桿菌病65例(25.69%)。兩組患者的性別分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.025)。肺分枝桿菌病組咳嗽咳痰的比率較肺外分枝桿菌病組高(77.13% VS 21.54%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。肺分枝桿菌病組呼吸道疾病患者的比率較肺外分枝桿菌病組高(85.11% VS 38.46%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。肺分枝桿菌病組胸部CT表現(xiàn)有炎性滲出的比例較肺外分枝桿菌病組高(91.49% VS 72.31%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。肺分枝桿菌病組結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT)陽性檢出率高于肺外分枝桿菌病組(87.23% VS 73.85%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012)。見表4。

表4 肺分枝桿菌組與肺外分枝桿菌組患者的臨床特征比較

續(xù)表4 (Table 4， Continued)

3 討論

結(jié)核分枝桿菌是TB的病原體，因感染部位不同，可分為肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)和EPTB，大多數(shù)感染表現(xiàn)為無臨床癥狀、被控制的狀態(tài)，稱為潛伏性結(jié)核感染(LTBI)；小部分感染者出現(xiàn)有癥狀的活動性TB[5]。中國在WHO結(jié)核病負擔最高的國家中排名第三(8.4%)[1]，因此，早期TB的檢測與診斷對感染的預(yù)防與控制具有重要意義。

涂片鏡檢(萋-尼染色法)可輔助分枝桿菌病的診斷，其操作簡單快速，對設(shè)施要求不高，檢查費用低，是普篩的首選方法，但因敏感度不足、涂片質(zhì)量不穩(wěn)定等局限性，可能會延誤診斷。培養(yǎng)作為診斷分枝桿菌病的金標準，目前大部分實驗室常用的培養(yǎng)方法有固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法。固體培養(yǎng)法成本較低、操作簡單，通過肉眼觀察菌落形態(tài)即可得到初步的鑒別，廣泛適用于各級實驗室，但培養(yǎng)時間長，陰性結(jié)果需連續(xù)觀察8周，陽性檢出率受限于標本含菌量、培養(yǎng)前處理等。液體培養(yǎng)法敏感度相對較高，培養(yǎng)基添加的促生長因子能為分枝桿菌的生長提供充分的營養(yǎng)，檢出率可提高10%，陽性TTD僅約14 d，但污染率偏高[6-7]，因此，需防止操作過程的污染。此法通過自動化檢測設(shè)備，可以降低實驗室生物安全風險，但同時也增加檢查費用[8-9]。

加拿大結(jié)核病標準第七版[10]指出，每份送涂片鏡檢的標本都應(yīng)設(shè)置在一種固體培養(yǎng)基和一種液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。Zhao等[11]研究結(jié)果顯示，MGIT 960系統(tǒng)的平均TTD(11.78±5.16)d短于羅氏培養(yǎng)。本研究中，固體組TTD為34.65(24.37，43.10)d，液體組為10.45(5.33，18.08)d，雙培養(yǎng)組為9.89(5.73，19.09)d，液體組和雙培養(yǎng)組的TTD均低于固體組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)；而液體組與雙培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.984)。因雙培養(yǎng)組大部分以液體培養(yǎng)先檢出，故TTD與液體組差異不大。液體組分枝桿菌檢出率為4.54%，優(yōu)于固體組的2.35%，固-液體雙培養(yǎng)組分枝桿菌檢出率為6.74%，表明在本研究設(shè)計的雙培養(yǎng)流程中樣本前處理的優(yōu)化也能提高傳統(tǒng)固體培養(yǎng)的檢出率。

對253例涂片陰性培養(yǎng)陽性患者的臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，肺分枝桿菌病患者中男性、咳嗽咳痰、患呼吸道基礎(chǔ)疾病、胸部CT炎性滲出和T-SPOT陽性的比例較肺外分枝桿菌組高。肺外分枝桿菌病患者臨床表現(xiàn)不典型，以椎體病變(疼痛和壓痛)較為多見，其次為胸膜(發(fā)熱)、腎及膀胱(尿頻和尿痛)等。PTB患者早期臨床體征也不明顯，常表現(xiàn)干咳無痰，送檢標本不合格導(dǎo)致涂片陰性，涂片陰性的TB在無規(guī)范診斷方案的情況下，誤診率可高達35%～52%，而EPTB臨床表現(xiàn)多變，準確檢測及診斷更具挑戰(zhàn)性[12-13]。固體組、液體組肺分枝桿菌陽性檢出率均高于肺外組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究中液體培養(yǎng)組肺分枝桿菌檢出率較固體培養(yǎng)肺組高，與Thangavelu等[14]研究結(jié)果一致。固-液體雙培養(yǎng)組肺外分枝桿菌檢出率較另兩組高，且耗時最短，固-液體雙培養(yǎng)組中肺外分枝桿菌陽性檢出率與肺組比較，差異無統(tǒng)計學意義，因此，優(yōu)化標本培養(yǎng)前處理及工作流程可明顯提高分枝桿菌檢出率，尤其是肺外分枝桿菌的檢出。Gr?schel等[15]調(diào)查結(jié)果顯示，美國青少年TB發(fā)病率為1.0/10萬人，本研究結(jié)果顯示青少年組TB患者數(shù)少，這與研究單位為大型綜合醫(yī)院中老年住院患者居多，導(dǎo)致入組年齡分段差距大有關(guān)。Snow等[16]研究指出，青少年患病占全球所有新發(fā)PTB病例的17%，因此，加強關(guān)注青少年生理、心理環(huán)境，對該病的研究和防控有重要作用[17-18]。

目前，我國分枝桿菌病診療現(xiàn)狀是90%以上病患在綜合醫(yī)院首診，在患者肺標本涂片找到分枝桿菌或培養(yǎng)陽性后即需轉(zhuǎn)至?？漆t(yī)院完成鑒定及藥敏試驗方能確診治療。期望隨著當代質(zhì)譜、分子生物學等診斷技術(shù)的高速發(fā)展，未來綜合醫(yī)院乃至基層實驗室在做好生物安全防護的基礎(chǔ)上，都能快速完成分枝桿菌的鑒定及藥敏試驗，盡早對患者進行確診治療，有效遏制疾病的醫(yī)院及社區(qū)傳播。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。