基于基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α/CXCR4通路研究氯吡格雷對大鼠頸動(dòng)脈狹窄的改善作用

劉婉麗，譚永輝，鄭翼徳

（郴州市第一人民醫(yī)院血管外科，湖南郴州 423000）

頸動(dòng)脈是將血液由心臟輸送至腦部的主要血管之一，頸動(dòng)脈狹窄是指頸動(dòng)脈內(nèi)徑變小甚至閉塞［1］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)、自身免疫、動(dòng)脈粥樣硬化等均與頸動(dòng)脈狹窄發(fā)病相關(guān)，常伴有頭暈、記憶力下降、肢體麻木、意識(shí)障礙等不良表現(xiàn)，長期狹窄可引起慢性腦缺血缺氧，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損，嚴(yán)重的頸動(dòng)脈狹窄可引起腦梗死甚至死亡，嚴(yán)重危害患者生命健康［2-3］。氯吡格雷是抑制血小板聚集的藥物，常用于預(yù)防、治療由于血小板高聚集引起的腦卒中、心肌梗死、動(dòng)脈循環(huán)障礙等疾病，在頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)中的使用幾率較大［4-5］，Graham 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)有的抗血栓治療中加入氯吡格雷可顯著減少頸動(dòng)脈狹窄引起的微栓塞數(shù)量。龔煜等［7］研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷可顯著降低頸動(dòng)脈狹窄患者的頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度，且臨床效果較好，但關(guān)于其作用機(jī)制研究較少?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）及其特異性受體CXCR4 與胚胎發(fā)育、血管新生、炎癥反應(yīng)等生理病理過程密切相關(guān)，具有促進(jìn)細(xì)胞遷移黏附、血管生成、內(nèi)膜增生等作用［8-9］。秦合偉等［9］研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈組織中SDF-1α、CXCR4 濃度顯著較高，并認(rèn)為SDF-1α/CXCR4 生物軸可能是冠心康干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用靶點(diǎn)之一。因此，本研究在前人的研究基礎(chǔ)上探究氯吡格雷對頸動(dòng)脈狹窄及SDF-1α/CXCR4 通路的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng) 物

40 只無特定病原體（SPF）級(jí)SD 雄性大鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2016-0041。所有大鼠均于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)并適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，采取自然光照及通風(fēng)，自由飲食、飲水，動(dòng)物房內(nèi)溫度保持在25℃左右，相對濕度保持在50%左右，按時(shí)對動(dòng)物房及鼠籠進(jìn)行清潔。

1.2 主要試劑及儀器

氯吡格雷（75 mg/片，國藥準(zhǔn)字：J20080090）購于杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司；單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、C 反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、改良蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號(hào)：SERK-0024、SERK-0017、SERK-0053、SERK-0012、G1121、BC3710、PC0020）購于北京索萊寶科技有限公司；SDF-1α ELISA 試劑盒（貨號(hào)：ml026159）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、SDF-1α、CXCR4、GAPDH 兔源抗體、羊抗兔IgG 抗體（貨號(hào)：EPR5368、ab18919、ab124824、ab9485、ab150077）購于英國Abcam。

Bio-rad680 酶標(biāo)儀購于美國伯樂；TS3B 全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)購于浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；MA752 組織切片機(jī)購于英國Campden；DMD108 光學(xué)顯微鏡購于德國徠卡；BOND-Max 全自動(dòng)免疫組化和原位雜交多功能染色機(jī)購于德國leica；JY300 蛋白電泳儀購于北京君意華鑫科技有限公司；TE70X 半干轉(zhuǎn)膜儀購于美國Hoefer；Quan?tum CX5 凝膠成像儀購于法國Vilber。

1.3 動(dòng)物模型制備及分組給藥

頸動(dòng)脈狹窄大鼠模型的構(gòu)建參考文獻(xiàn)［10］的方法并稍作修改，40 只SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組（8 只）、造模組（32 只）。將大鼠麻醉后保持仰臥位固定，消毒大鼠頸部皮膚后沿頸部正中線做長度約為4 cm 的切口，逐層分離肌肉后使頸動(dòng)脈暴露，在頸總動(dòng)脈近心端與頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈交叉處的1.5 cm 處做約為血管橫截面1/3 的切口，將10 mL 注射器的針頭插入上述切口，保持針頭與血管平行，用0 號(hào)手術(shù)線結(jié)扎頸動(dòng)脈及針頭，小心拔出針頭，縫合傷口并做消毒處理。假手術(shù)組僅暴露頸動(dòng)脈，不做結(jié)扎處理。兩組隨機(jī)選取兩只大鼠，解剖后獲取狹窄動(dòng)脈組織，清洗后進(jìn)行HE 染色，觀察到造模組大鼠頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜明顯增厚即可說明頸動(dòng)脈狹窄模型構(gòu)建成功。造模過程中，大鼠出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，及時(shí)選取備用大鼠進(jìn)行補(bǔ)充。

將造模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為模型組、氯吡格雷低劑量組（3 mg/kg）、氯吡格雷中劑量組（6 mg/kg）、氯吡格雷高劑量組（12 mg/kg）［11］，每組8 只。術(shù)后3 d 按照各組給藥劑量進(jìn)行灌胃處理，連續(xù)灌胃1 周。

1.4 大鼠血液及頸動(dòng)脈組織采集

末次給藥結(jié)束后24 h，將各組大鼠麻醉后行心臟取血（約4 mL），離心后收集血清用于炎癥因子濃度的測定；取血結(jié)束后將各組大鼠處死，采集結(jié)扎處頸動(dòng)脈組織，用于頸動(dòng)脈病理學(xué)觀察及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測。

1.5 大鼠血清炎癥因子濃度檢測方法

取1.4 中各組大鼠血清，用CRP、MCP-1、TGFβ、PGE2、SDF-1α 相關(guān)ELISA 試劑盒檢測血清中炎癥因子濃度，具體操作方法參考相關(guān)試劑盒中的說明書。

1.6 大鼠頸動(dòng)脈組織病理損傷觀察

取出1.4 中各組大鼠適量頸動(dòng)脈組織，清洗干凈后固定于4%多聚甲醛中（24 h），用水將頸動(dòng)脈組織上的甲醛溶液沖掉，對頸動(dòng)脈組織進(jìn)行脫水、透明處理，接著將融化的石蠟完全浸入頸動(dòng)脈組織中，待其凝固后進(jìn)行修剪并切片，將得到的石蠟切片經(jīng)過二甲苯Ⅰ脫蠟10 min、二甲苯Ⅱ脫蠟10 min、無水乙醇Ⅰ2 min、無水乙醇Ⅱ2 min、95%乙醇2 min、80%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸餾水2 min、蘇木素染色5 min、分化液分化5 s、返藍(lán)液返藍(lán)1 min、伊紅染色2 min、80%乙醇3 s、90%乙醇3 s、95%乙醇3 s、95%乙醇3 s、無水乙醇1 min、二甲苯Ⅰ1 min、二甲苯Ⅱ1 min、封片等步驟得到病理組織切片，具體操作參考HE 染色試劑盒的要求，于光學(xué)顯微鏡下觀察后拍照并進(jìn)行觀察。

1.7 免疫組化檢測大鼠頸動(dòng)脈組織中α-SMA濃度

將包有大鼠頸動(dòng)脈組織的石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟復(fù)水，置于3%H2O2中孵育30 min，經(jīng)過堿修復(fù)、加熱、煮沸后于5%牛血清白蛋白中37℃孵育1 h，加入兔源α-SMA 一抗（稀釋比為1∶800），4 ℃冰箱中孵育過夜后加入羊抗兔二抗（1∶1 000），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色后經(jīng)蘇木精復(fù)染核、中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡中觀察并拍照，采用Image J 軟件對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.8 大鼠頸動(dòng)脈組織SDF-1α/CXCR4 通路蛋白以及α-SMA 蛋白表達(dá)檢測

取1.4 中各組大鼠適量頸動(dòng)脈組織，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈后剪碎，加入組織裂解液低溫研磨，根據(jù)蛋白質(zhì)提取試劑盒的要求提取其中蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其中蛋白質(zhì)濃度。將各組大鼠頸動(dòng)脈組織蛋白質(zhì)溶液調(diào)至濃度相同，取5 μL待測液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，接著采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，將上述纖維膜用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉處理2 h，用TBST 沖洗掉纖維膜上的封閉液后加入α-SMA、SDF-1α、CXCR4、GAPDH 兔源一抗（稀釋比為1∶1 000），4 ℃冰箱中孵育過夜后取出，用TBST 沖洗后加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔二抗，孵育1 h經(jīng)過顯色處理后進(jìn)行定影觀察并拍照分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0 數(shù)據(jù)處理軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，單因素方差分析組間差異，進(jìn)一步兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頸動(dòng)脈狹窄大鼠模型構(gòu)建成功驗(yàn)證

假手術(shù)組大鼠頸動(dòng)脈組織正常；與假手術(shù)組相比，造模組大鼠頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜顯著增厚，頸動(dòng)脈腔管面積較小，結(jié)扎損傷法構(gòu)建大鼠頸動(dòng)脈狹窄模型構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 假手術(shù)組與造模組大鼠頸動(dòng)脈脈組織光學(xué)顯微鏡下圖像（HE 染色；A 為假手術(shù)組；B 為造模組）

2.2 各組大鼠血清炎癥因子濃度比較

與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組組大鼠相比，氯吡格雷各劑量組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α 濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，見表1。

表1 各組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α 濃度比較 ［n=8，］

表1 各組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α 濃度比較 ［n=8，］

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯吡格雷低劑量組比較，cP＜0.05；與氯吡格雷中劑量組比較，dP＜0.05

2.3 各組大鼠動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)比較

假手術(shù)組大鼠頸動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜無明顯病變，中膜平滑肌細(xì)胞、彈力纖維層結(jié)構(gòu)清晰；與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠頸動(dòng)脈組織管腔狹窄嚴(yán)重，內(nèi)膜增厚明顯，中膜彈力纖維層混亂；與模型組大鼠相比，氯吡格雷各劑量組大鼠頸動(dòng)脈組織內(nèi)膜增厚現(xiàn)象得到緩解，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，其中高劑量組效果較好，見圖2。

圖2 各組大鼠頸動(dòng)脈組織顯微鏡下圖像（HE 染色；×200；A 為假手術(shù)組；B 為造模組；C 為氯吡格雷低劑量組；D 為氯吡格雷中劑量組；E 為氯吡格雷高劑量組）

2.4 各組大鼠頸動(dòng)脈組織α-SMA 濃度比較

與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠頸動(dòng)脈組織α-SMA表達(dá)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，氯吡格雷各劑量組大鼠頸動(dòng)脈組織α-SMA 表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠頸動(dòng)脈組織α-SMA 濃度免疫組化檢測結(jié)果比較（免疫組化染色；×200；A 為假手術(shù)組；B 為造模組；C 為氯吡格雷低劑量組；D 為氯吡格雷中劑量組；E 為氯吡格雷高劑量組）

圖4 各組大鼠頸動(dòng)脈組織中α-SMA相對濃度比較柱狀圖

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯吡格雷低劑量組比較，cP＜0.05；與氯吡格雷中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組大鼠頸動(dòng)脈組織SDF-1α/CXCR4 通路蛋白以及α-SMA 蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠頸動(dòng)脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，氯吡格雷低、中、高劑量組大鼠頸動(dòng)脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，見圖5、表2。

表2 各組大鼠頸動(dòng)脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA蛋白相對表達(dá)量比較 ［n=8，］

表2 各組大鼠頸動(dòng)脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA蛋白相對表達(dá)量比較 ［n=8，］

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯吡格雷低劑量組比較，cP＜0.05；與氯吡格雷中劑量組比較，dP＜0.05

圖5 各組大鼠頸動(dòng)脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白相對表達(dá)量比較（A 為假手術(shù)組；B 為造模組；C 為氯吡格雷低劑量組；D 為氯吡格雷中劑量組；E 為氯吡格雷高劑量組）

3 討論

頸動(dòng)脈狹窄主要是動(dòng)脈血管中出現(xiàn)粥樣斑塊，斑塊不穩(wěn)定、機(jī)體炎癥反應(yīng)等均為頸動(dòng)脈狹窄發(fā)生的不良因素，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起血管閉塞，造成腦部缺血、缺血性腦卒中、血管性認(rèn)知障礙等不良疾病的發(fā)生，嚴(yán)重危害患者的生命健康［12-13］。建立一種重復(fù)性好、狹窄程度易控制、操作簡單的動(dòng)物模型對于研究頸動(dòng)脈狹窄具有重要意義，張羽喬等［14］采用“針控線栓法”構(gòu)建大鼠頸動(dòng)脈狹窄模型，構(gòu)建的動(dòng)物模型成功率較高且較穩(wěn)定。本研究采用此方法構(gòu)建頸動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型，結(jié)果顯示，造模組大鼠新生內(nèi)膜顯著增厚，頸動(dòng)脈腔管面積顯著減小，血清炎癥因子（CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2）濃度顯著升高，與王鴻康等［15］研究結(jié)果一致，表明大鼠頸動(dòng)脈狹窄模型構(gòu)建成功。頸動(dòng)脈狹窄可造成血管內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，而大量炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子的過度釋放對于血管損傷后的內(nèi)膜增生具有不利影響［15］。

針對頸動(dòng)脈狹窄患者，應(yīng)當(dāng)采用血管內(nèi)介入治療，但由于血管內(nèi)治療技術(shù)水平有限、術(shù)后并發(fā)癥較多、治療費(fèi)用偏高等因素不易被患者接受，因此抗血小板聚集類藥物仍是臨床中常用的治療藥物。氯吡格雷是第二代口服噻吩吡啶，具有抑制血小板聚集、抗炎等多種生物學(xué)作用［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)氯吡格雷還具有抗神經(jīng)元凋亡、緩解缺血性腦卒中等作用［18］，對頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)后復(fù)發(fā)及臨床缺血事件的發(fā)生率具有一定的降低作用［19］。氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林可顯著抑制頸動(dòng)脈狹窄患者血小板活化、抑制炎癥因子釋放、增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性等，并顯著改善患者的預(yù)后情況［20］。α-SMA可與血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）特異性結(jié)合，測定血管組織中α-SMA 表達(dá)可反映VSMCs 的分布及濃度，當(dāng)血管受到損傷時(shí)可引起VSMCs 的惡性增殖，進(jìn)而造成血管腔狹窄［21］。本研究結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，氯吡格雷各劑量組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2濃度顯著降低，頸動(dòng)脈組織內(nèi)膜增厚現(xiàn)象得到緩解，頸動(dòng)脈組織α-SMA 表達(dá)降低，提示氯吡格雷可顯著抑制頸動(dòng)脈狹窄、大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)及VSMCs 的惡性增殖，對于頸動(dòng)脈狹窄大鼠具有一定的緩解作用，但其作用機(jī)制仍不清晰。

SDF-1 主要有SDF-1α、SDF-1β 兩種形式，主要以SDF-1α 為主，SDF-1α 屬于CXC 類趨化因子，在心臟、肝臟、小腸等組織中均有表達(dá)。CXCR4為CXC 類趨化因子受體，是SDF-1α 的特異性受體，SDF-1α/CXCR4 軸與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附、血管生成、血管生長等生物學(xué)行為密切相關(guān)［22-23］。資料顯示，當(dāng)機(jī)體組織受到損傷時(shí)，SDF-1α 的表達(dá)增加，進(jìn)而激活CXCR4，使得炎癥細(xì)胞因子向受損部位聚集，同時(shí)促進(jìn)炎癥因子對受損組織的浸潤，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙及VSMCs 增殖異常［24］。研究發(fā)現(xiàn)SDF-1α、CXCR4 在頸動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)［25］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷聯(lián)合銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對治療急性腦梗死療效顯著，能有效抑制炎癥反應(yīng)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展［26］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)升高的同時(shí)，血清SDF-1α濃度、頸動(dòng)脈組織中SDF-1α、CXCR4 蛋白表達(dá)水平也顯著升高，提示SDF-1α/CXCR4 軸可能參與了頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜的增厚過程，與頸動(dòng)脈狹窄密切相關(guān)；與模型組大鼠相比，氯吡格雷各劑量組大鼠血清SDF-1α 濃度、頸動(dòng)脈組織中SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明氯吡格雷減輕炎癥反應(yīng)，緩解頸動(dòng)脈內(nèi)膜組織增厚，與其降低SDF-1α、CXCR4 蛋白表達(dá)水平的作用機(jī)制有關(guān)，提示氯吡格雷可能通過抑制SDF-1α/CXCR4 通路，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮緩解頸動(dòng)脈狹窄作用。

綜上所述，氯吡格雷可顯著緩解頸動(dòng)脈狹窄大鼠的炎癥反應(yīng)及頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚現(xiàn)象，可能是通過抑制SDF-1α/CXCR4 通路實(shí)現(xiàn)的，但氯吡格雷作用機(jī)制及頸動(dòng)脈狹窄發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氯吡格雷是否通過其他途徑發(fā)揮作用仍不清晰，因此仍需深入研究。