冠突散囊菌與哈茨木霉在百香果儲藏中的應(yīng)用研究

魏宗游, 王 宇, 嚴(yán)云剛, 董 旋, 趙懿琛,2

(1.貴州大學(xué)茶學(xué)院， 貴陽 550025；2.山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所， 貴陽 550005； 4.安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 貴州 安順 561000)

百香果(PassifloraedulisSims)是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬草質(zhì)藤本植物，又稱西番蓮、巴西果、雞蛋果，生長于熱帶地區(qū)，原產(chǎn)地為巴西。果實成熟后散發(fā)出多種水果香味，故稱為“百香果”，享有“飲料之王”的美譽[1-2]。研究表明，百香果果汁含有多種必需氨基酸、維生素和微量元素[3]。百香果作為南方地區(qū)農(nóng)村脫貧致富重點開發(fā)的經(jīng)濟果樹，市場發(fā)展前景廣闊[4-5]。目前，貴州省百香果種植面積為1.12萬hm2，產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展導(dǎo)致種苗質(zhì)量參差不齊，一半種苗需從外省調(diào)入。大型百香果標(biāo)準(zhǔn)化種苗繁育基地欠缺，種苗質(zhì)量良莠不齊，存在劣質(zhì)苗、帶病毒苗，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展。利用百香果優(yōu)質(zhì)實生苗可以有效解決產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸，實生選育也是開展種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要手段。但百香果種子外有一層囊膜，內(nèi)含果汁，在分離選種時無法徹底清理干凈，在貯藏中極易受到腐敗真菌侵染導(dǎo)致劣變。受霉變環(huán)境影響的種子發(fā)芽率極低，嚴(yán)重影響選種效率。百香果為呼吸躍變型水果，采后易失水、皺縮，病原菌在表皮生長，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)[6]。隨著百香果產(chǎn)銷半徑的擴大及市場需求的增加，開展百香果采后保鮮技術(shù)研究，不僅能提升百香果采后商品性、延長貨架期，而且對百香果優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保存和創(chuàng)新具有一定的輔助作用。

近年來，利用拮抗微生物防治植物病害及水果保鮮儲藏已成為研究的熱點，其中，以哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)應(yīng)用最為廣泛[7]，哈茨木霉菌可以通過營養(yǎng)競爭、重寄生、細胞壁分解酵素以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等多重機制對多種植物病原菌產(chǎn)生拮抗作用，具有保護和治療雙重功效，是許多病原微生物的生防因子[8]，但就哈茨木霉的食品安全性評估目前未見報道。

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)俗稱金花，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的一種真菌，營養(yǎng)要求低，適應(yīng)性強，能利用多種氮源、碳源生長，是茯磚茶中的優(yōu)勢菌種及鑒別茯磚茶品質(zhì)好壞的標(biāo)準(zhǔn)[9]。冠突散囊菌發(fā)酵可促進茶葉內(nèi)含成分轉(zhuǎn)化，改善產(chǎn)品香氣滋味，且產(chǎn)生多種活性代謝物，具有抑菌、降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化等功效。其發(fā)酵產(chǎn)物苔黑酚除具有抗輻射作用外，對腸道致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及普通變形桿菌均具有顯著的抑制作用[10-11]。

本研究分離并純化百香果鮮果表皮真菌，分析真菌組成，用哈茨木霉和冠突散囊菌對分離出的真菌開展對峙抑菌試驗，觀察抑菌效果。同時配制哈茨木霉茶湯浸泡液、冠突散囊菌茶湯浸泡液、哈茨木霉與冠突散囊菌混合茶湯浸泡液和茶湯，將鮮果置入浸泡液中30 s，以未處理組作為對照，觀察并記錄采后鮮果的皺縮情況，以期為延長百香果的貨架期提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試百香果品種為紫香1號，紫皮黃肉；2021年10月18日，采摘于貴州省果樹科學(xué)研究所鎮(zhèn)寧縣良田鎮(zhèn)壩草試驗基地，選取面積為10 m2區(qū)域圍繞4個方向和中心點，隨機挑選成熟度、大小基本一致的果實60個，重復(fù)3次。

冠突散囊菌是由本實驗室保存的菌種；哈茨木霉購于北京科展生物科技有限公司；黑茶購自中茶湖南安化第一茶廠有限公司。

1.2 方 法

1.2.1百香果表皮真菌分離純化

百香果鮮果表皮3 g充分研磨成粉后，置于含有50 mL無菌生理鹽水與玻璃珠的250 mL三角瓶內(nèi)，200 r/min震蕩培養(yǎng)60 min，制成懸液，將懸液稀釋100倍，取100 μL稀釋液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基上用于分離[12]，26 ℃倒置培養(yǎng)14 d 或菌斑大于7 cm，選取長勢良好的真菌菌落PDA進行純化[13]。

1.2.2真菌鑒定及群落組成

以O(shè)MEGA-HP Fungal DNA Kit(Omega Bio-Tek USA)提取的DNA為模板，ITS 1 F(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS 4 R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物，使用KOD-Plus-Neo DNA Polymerase(TOYOBO東洋紡上海生物科技有限公司)擴增純化真菌的ITS-序列，反應(yīng)體系(20 μL)：ddH2O 8 μL，KOD buffer 2 μL，dNTP 2 μL，MgSO41.4 μL，正向和反向引物各0.6 μL，模板DNA 5 μL，KOD-Plus-Neo 0.4 μL進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；68 ℃ 30 s，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Gel Extraction Kits (Omega Bio-Tek，USA)純化回收后送美國英杰生命技術(shù)有限公司測序(Invitrogen)。NCBI blast N (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對分離純化獲得的菌株ITS序列進行比對，并下載相似序列，Clustalx(http://www.clustal.org)軟件進行多重比對，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ樹，對分離獲得的菌株進行分子鑒定[14]。利用如下公式計算真菌占比[15]。

1.2.3菌種活化

將冠突散囊菌、哈茨木霉及分離出的表皮真菌菌株接種于馬鈴薯 PDA培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)，5 d后，用打孔器取菌斑邊緣6 mm菌餅用作后續(xù)試驗。

1.2.4平板對峙培養(yǎng)

用記號筆在 PDA 培養(yǎng)基平板背面分別標(biāo)記對峙培養(yǎng)哈茨木霉、冠突散囊菌和病原菌所處位置(兩菌種培養(yǎng)皿中線相對稱，間隔3 cm)。直徑為6 mm的哈茨木霉、冠突散囊菌和11種病原菌菌餅分別接種于上述對峙培養(yǎng)的PDA 培養(yǎng)基上。以單一接種6 mm菌餅的PDA培養(yǎng)基上生長的對應(yīng)真菌作為對照。對峙培養(yǎng)和對照均置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)，且每個試驗重復(fù)3次。第3天開始采用“十字交叉法”測量菌落直徑并拍照記錄，根據(jù)如下公式計算生長抑制率[16]。

1.2.5浸泡液制備

1) 茶湯制備：參照GB/T 8305-2013茶水浸出物測定中茶湯制備方法提取茶湯，并置于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。

2) 冠突散囊菌及哈茨木霉菌液的制備：用6 mm無菌打孔器取一個活化的冠突散囊菌和哈茨木霉菌菌餅，分別置于裝有250 mL液體PDA培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min暗培養(yǎng)12 h。

3) 混配菌液制備：用6 mm無菌打孔器取一個活化的冠突散囊菌和哈茨木霉菌菌餅，分別置于裝有250 mL液體PDA培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min暗培養(yǎng)12 h。

4) 浸泡液制備：冠突散囊菌茶湯浸泡液、哈茨木霉茶湯浸泡液、哈茨木霉與冠突散囊菌混合浸泡液由冠突散囊菌菌液、哈茨木霉菌液、混配菌液分別與茶湯按體積比1∶3混合后28 ℃、180 r/min，5 min。

1.2.6百香果離體儲藏實驗

1) 取同一時期大小相似的鮮果，滅菌紙擦拭后分別置于哈茨木霉茶湯浸泡液、冠突散囊菌茶湯浸泡液、哈茨木霉與冠突散囊菌混合茶湯浸泡液和茶湯中30 s，以不浸泡為對照，25 ℃恒溫儲藏9 d，觀察鮮果皺縮情況。

2) 皺縮度及皺縮指數(shù)。每次觀察記錄12個百香果皺縮面積，確定其皺縮度(0代表無皺縮；1代表0～25%皺縮；2代表25%～50%皺縮；3代表 50%～75%皺縮； 4代表75%～100%皺縮)， 設(shè)置3個重復(fù)；計算皺縮指數(shù)[17]。

3) 在室溫下儲藏14 d后，將鮮果從中間剖開，觀察果肉情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌分離鑒定

從鮮果表皮中共分離得到23株真菌，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)有9個屬11種(表1)，其中耙齒菌屬(Irpex) 1株，占菌落總數(shù)的4.3%；橫斷孢屬(Strelitziana)1株，占菌落總數(shù)的4.3%；曲霉屬(Aspergillus)2株，占菌落總數(shù)的8.7%；栓菌屬(Trametes)2株，占菌落總數(shù)的8.7%；葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)2株，占菌落總數(shù)的8.7%；附球菌屬(Epicoccum)2株，占菌落總數(shù)的8.7%；刺孢菌屬(Subulicystidium)2株，占菌落總數(shù)的8.7%；枝孢霉屬(Cladosporiumsp)有兩個種共3株，占菌落總數(shù)的13%，鐮刀菌屬(Fusariumsp)有兩個種共8株，占菌落總數(shù)的34.8%。從分離出的真菌數(shù)量及種類得出，鐮刀菌屬和枝孢霉屬真菌是鮮果表皮主要真菌。

表1 百香果表皮真菌組成Table 1 Fungal composition of Passiflora edulis Sims epidermis

注：A為對照；B為冠突散囊菌；C為哈茨木霉。圖1 對峙培養(yǎng)Fig.1 confrontation culture

2.2 抑菌效果

在PDA培養(yǎng)基上用哈茨木霉菌、冠突散囊菌與11種百香果表皮真菌對峙培養(yǎng)，計算對峙第7天時的抑菌率。從圖1可以看出，培養(yǎng)到第7天時，哈茨木霉對分離的11種真菌均有不同程度的抑制作用，抑制率為23.8%～88.1%。其中對多毛毛栓菌(TH)的抑制作用最強，抑制率為88.1%。對可可毛色二孢菌(LT)、白囊耙齒菌(LL)、刺孢菌(SL)、橫斷孢菌(AS)、枝狀枝孢菌(CC)、枝孢菌(CL)、厚孢鐮刀菌(FC)、黃曲霉菌(AF)、高粱表球菌(ES)的抑制率分別為71.2%、69.4%、68.9%、68.5%、61.7%、56.6%、54.2%、43.3%、44.2%。對尖孢鐮刀菌(FO)的抑制作用最弱，抑制率為23.8%。

冠突散囊菌對峙培養(yǎng)7 d時，其菌株直徑在1.5～3.6 cm之間。有研究表明，冠突散囊菌20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長較快，28 ℃培養(yǎng)7 d直徑達37～40 mm，在不同培養(yǎng)基上的生長情況差異較大[18]。冠突散囊菌對黃曲霉菌(AF)、枝孢菌(CL)、多毛毛栓菌(TH)、厚孢鐮刀菌(FC)、尖孢鐮刀菌(FO)、枝狀枝孢菌(CC)、橫斷孢菌(AS)沒有抑制作用。對白囊耙齒菌(LL)、可可毛色二孢菌(LT)、長錐囊菌(SL)、高粱表球菌(ES)有抑制作用，抑制率分別為27.2%、25.8%、13.9%、16.1%。

注：A為冠突散囊菌茶湯浸泡液處理；B為哈茨木霉茶湯浸泡液處理；C為哈茨木霉與冠突散囊菌混合茶湯浸泡液處理；D為茶湯處理；E為對照。下同。圖2 5組不同處理儲藏9 d的鮮果Fig.2 Fresh fruit of 5 groups stored for 9 days under five different treatments

2.3 儲藏效果

果實皺縮度是評價果實貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，果實表皮失水皺縮會嚴(yán)重影響果實的外觀品質(zhì)，從而影響其商業(yè)價值。5組處理后的皺縮指數(shù)變化如圖2、圖3所示，結(jié)果表明，冠突散囊菌茶湯浸泡液處理后的鮮果0～4 d內(nèi)果皮無皺縮現(xiàn)象，皺縮指數(shù)為0，第5天時部分鮮果表皮出現(xiàn)輕微皺縮現(xiàn)象，皺縮指數(shù)為1.17。隨著儲藏時間加長，表皮皺縮面積增大，第7天時皺縮指數(shù)為2，第9天時全部鮮果都出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，皺縮指數(shù)增長至2.33。哈茨木霉茶湯浸泡液處理后的鮮果在第3天時出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，皺縮指數(shù)為0.5，第9天時鮮果全部皺縮，皺縮指數(shù)為4。哈茨木霉與冠突散囊菌混合茶湯浸泡液處理的鮮果在第3天時出現(xiàn)皺縮，皺縮指數(shù)為1，在第7天時全部皺縮，皺縮指數(shù)為4。茶湯浸泡處理的鮮果在第3天時出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，皺縮指數(shù)為0.42，第7天時全部皺縮。對照組的鮮果在第3天出現(xiàn)皺縮，皺縮指數(shù)為1.7，第7天時全部皺縮。

圖3 5組不同處理儲藏9 d的皺縮指數(shù)Fig.3 Shrinkage rate of 5 groups stored for 9 days unbder different treatments

圖4 儲藏14 d果瓤情況Fig.4 Pulp condition after storage for 14 days

在5組處理中，第3天時哈茨木霉茶湯浸泡液、混配浸泡液、茶湯浸泡和對照4組處理均出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，皺縮指數(shù)對照組>哈茨木霉與冠突散囊菌混合茶湯浸泡液組>哈茨木霉茶湯浸泡液組>茶湯浸泡液組，隨著儲藏時間延長，各組處理的鮮果皺縮指數(shù)增加。第7天時，哈茨木霉茶湯浸泡液組的皺縮指數(shù)為3，對照組、哈茨木霉與冠突散囊菌混合茶湯浸泡液組和茶湯組鮮果表皮全部皺縮，皺縮指數(shù)為4。

儲藏14 d后，冠突散囊菌茶湯浸泡處理的12個鮮果果瓤完好，與果籽都完整粘附在內(nèi)壁上，果汁呈黃色，水分保持較好。茶湯浸泡液處理的2個鮮果果瓤與內(nèi)壁分離，12個果汁呈黃色，水分保持不及冠突散囊菌茶湯浸泡處理的鮮果。哈茨木霉茶湯浸泡液處理的6個鮮果果瓤與內(nèi)壁分離，4個果瓤顏色發(fā)暗。哈茨木霉與冠突散囊菌混合茶湯浸泡液處理的10個果瓤顏色發(fā)暗，出現(xiàn)異味。對照組鮮果果肉失水皺縮變質(zhì)，部分果肉變黑，無可食性(圖4)。

3 討 論

新鮮采摘的百香果果實含水量高，如果不及時采取保鮮防腐措施，水分會不斷蒸發(fā)，引發(fā)百香果果實霉變。有研究表明，采后2～3 d百香果就會因失水果皮發(fā)生皺縮，易受病源真菌侵染而腐爛[19]，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟價值，并且霉變果實的種子發(fā)芽率也大幅度降低。因此，延緩果實皺縮，抑制果皮表面微生物生長對延長鮮果貯藏期，保存優(yōu)良性狀百香果種質(zhì)具有重要意義。

本研究從百香果表皮中分離得到9屬11種真菌，說明百香果采后表皮皺縮腐敗很可能不是由單一菌種造成。本次分離獲得的葡萄座腔菌屬的可可毛色二孢菌是一種弱寄生菌，能引起百香果采后果腐病[20]。鐮刀菌能引起植物果實、塊莖、鱗莖等腐爛，是導(dǎo)致草果果穗和果實腐爛的致病菌[21]。枝狀枝孢菌是導(dǎo)致臍橙腐爛病原菌之一[22]，并能引發(fā)香蕉煤污病[23]。高粱附球菌能引起卷心菜、煙草、百合等植物產(chǎn)生葉斑病[24]。黃曲霉是自然界中分布最廣的腐生菌，可使農(nóng)作物及產(chǎn)品變質(zhì)、霉壞，對小麥、玉米、大米、花生污染最多[25]。

冠突散囊菌的代謝物能有效抑制細菌、真菌、放線菌的生長和繁殖[26-27]。目前，哈茨木霉是應(yīng)用最廣泛的生防真菌[28]，對植物病原菌有競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)抗性及協(xié)同拮抗作用[29]。本研究表明，冠突散囊菌和哈茨木霉對分離獲得的百香果表皮真菌均有顯著的抑制作用，且哈茨木霉的抑菌效果顯著優(yōu)于冠突散囊菌，說明這兩種真菌均可用于百香果的儲藏和保鮮。

儲藏試驗發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉茶湯浸泡液處理儲藏第9天時表皮完全皺縮，第14天時，6個鮮果果瓤與內(nèi)壁分離，4個果瓤顏色發(fā)暗。鮮果經(jīng)哈茨木霉茶湯浸泡液處理后，菌株在鮮果表皮快速繁殖，分泌纖維素酶，水解果皮中纖維素以獲得能量來生長[30]，雖然果皮上其他菌種生長受到抑制，但哈茨木霉繁殖較快，大量消耗果皮中的碳氮源，并未達到預(yù)期保鮮效果。冠突散囊菌茶湯浸泡液處理儲藏第9天時鮮果皺縮指數(shù)最小，第14天時，其果瓤保持較好，果汁呈黃色，無異味。菌株對營養(yǎng)要求低，適應(yīng)性強，鮮果經(jīng)冠突散囊菌茶湯浸泡液處理后，部分茶湯附著在鮮果表面，菌株利用茶湯內(nèi)含物質(zhì)繁殖。

冠突散囊菌和哈茨木霉對分離獲得的百香果表皮真菌均有顯著的抑制作用，由于哈茨木霉在鮮果表皮上繁殖較快，茶湯中的能源物質(zhì)不能滿足其生長，需要從鮮果表皮皮中獲取能源，導(dǎo)致鮮果表皮皺縮。而冠突散囊菌利用茶湯內(nèi)含物質(zhì)能滿足其9 d生長所需的能源，不需要從鮮果表皮中獲取能源，使得儲藏時間延長。本研究表明，冠突散囊菌可作為一種潛在的保鮮用拮抗微生物菌種。