基于SRAP分子標(biāo)記分析彩色馬鈴薯品種間遺傳關(guān)系

謝 銳， 金曉蕾， 周繼鴻， 郭斌煜， 郭景山， 韓志剛

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 呼和浩特 010031； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 河北 保定 071000；3.巴林左旗農(nóng)牧局， 內(nèi)蒙古 赤峰 025450)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是全球種植最為廣泛的塊莖類糧食作物之一，因其富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦質(zhì)元素以及膳食纖維等營養(yǎng)成分，也是人類飲食中膳食熱量和一些微量元素的重要來源[1-3]。彩色馬鈴薯是一種特殊的栽培馬鈴薯類型，由于富含花青素和類胡蘿卜素而使其塊莖的薯皮、薯肉呈現(xiàn)出黃、紅、粉、紫、黑等顏色，另外塊莖中含有多酚、類黃酮和維生素C等多種抗氧化活性物質(zhì)，具有抗氧化、降三高、美容等保健功能，因此逐漸被消費市場認(rèn)可[4-5]。近些年，彩色馬鈴薯新品種選育成為了研究的熱點，而彩色馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳背景及多樣性等尚不清楚。因此，本研究對彩色馬鈴薯種質(zhì)資源間遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，為選育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)彩色馬鈴薯新品種奠定基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記技術(shù)是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)檢測遺傳多樣性的方法，不受外界環(huán)境、組織部位或生育時期等因素的影響，在種質(zhì)資源鑒定上比傳統(tǒng)生化標(biāo)記和形態(tài)標(biāo)記更具鑒別力[6]。序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence Related Amplified Polymorphism, SRAP)標(biāo)記，其目標(biāo)是檢測基因組中開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)的多態(tài)性，相較于RAPD、AFLP、SSR等技術(shù)，SRAP具有操作簡便、重復(fù)性好、效率高、成本低等特點[7-8]。目前，在彩色馬鈴薯遺傳多樣性研究方面所用的分子標(biāo)記大多為SSR[9-10]和ISSR[11-12]，利用SRAP分子標(biāo)記研究彩色馬鈴薯遺傳多樣性的研究并不多。本研究利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對收集的24個彩色馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為內(nèi)蒙古地區(qū)彩色馬鈴薯種質(zhì)資源可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院收集的24份彩色馬鈴薯品種(系)開展研究。供試材料信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1DNA提取及SRAP引物來源

于苗期采集供試材料幼嫩葉片并用液氮速凍帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱保存。稱取0.5 g葉片組織，使用TianGen植物DNA提取試劑盒(DP 305)按操作說明提取樣品DNA，用1.8%瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量及濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)Pezzotti等[13]和Lin等[14]的 SRAP引物序列，隨機選取正、反向引物各17條，具體信息如表2所示。

1.2.2SRAP-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系：共20 μL，包括2 μL模板DNA(50 ng/μL)，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，2×TaqMaster Mix(0.1 U/μLTaqDNA聚合酶，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTP，反應(yīng)緩沖液)16 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，共5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃溫育10 min后4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測：采用2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2.0 μL，電泳上槽緩沖液為1×TBE，120 V電壓下電泳1.5 h。

表1 彩色馬鈴薯品種及性狀Table 1 Varieties and traits of color potatoes

1.2.3數(shù)據(jù)分析

利用0/1賦值法將多態(tài)性標(biāo)記轉(zhuǎn)化為二進(jìn)制數(shù)據(jù)，即有條帶賦值為“1”，無條帶賦值為“0”。運用Excel 2016軟件整理為“0”“1”數(shù)據(jù)矩陣；運用PopGen 1.32軟件計算遺傳多樣性指數(shù)，包括有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s指數(shù)(I)；運用NTSYS PC 2.02 e軟件計算各彩色馬鈴薯間的遺傳相似系數(shù)(GS)，再利用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，通過Tree plot模塊構(gòu)建樹狀圖、PCA散點分布圖。多態(tài)性信息量值PIC(Polymorphism Index Contents)采用Nei’s多樣性指數(shù)公式獲得：

表2 SRAP引物序列Table 2 SARP primer sequences

注：M為DL 2 000；圖中數(shù)字編號對應(yīng)品種(系)與表1相同。下同。圖1 彩色馬鈴薯DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis of color potatoes

PICk=1-∑Pi2

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測

使用TianGen公司的DNA提取試劑盒提取DNA。結(jié)果表明，試劑盒提取的DNA質(zhì)量好，無降解，品種間DNA提取量均勻(圖1)，能夠滿足SRAP擴(kuò)增對供試材料DNA的要求，經(jīng)稀釋后可用于SRAP分析。

2.2 SRAP引物多態(tài)性分析

利用17組SRAP引物(表2)對24份彩色馬鈴薯的基因組DNA擴(kuò)增，其中有14對引物可擴(kuò)增出清晰且重復(fù)性好的條帶。利用篩選出的14對引物組合對24份彩色馬鈴薯進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表3)，共獲得74個多態(tài)性條帶，產(chǎn)物大小介于100～500 bp之間。SRAP引物在各種質(zhì)材料間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶為2～8條，每條引物平均擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)為5.3條。PIC值的范圍在0.62～0.93之間，平均值為0.86，其中PIC值達(dá)到0.90的引物有7對，分別為M 3/E 10(0.93)、M 14/Be 7(0.92)、M 2/E 6(0.91)、M 1/E 2(0.9)、M 3/E 9(0.9)、M 11/E 2(0.9)、M 14/E 1(0.9)，以上7對SRAP引物在品種間表現(xiàn)出良好的多態(tài)性且條帶清晰穩(wěn)定(圖2)，可用于馬鈴薯種質(zhì)間的多樣性分析。PIC值在0.84～0.88之間的引物有5對，也表現(xiàn)出較好的多態(tài)性；PIC值小于0.8的引物有2對，分別為M 5/E 10(0.77)、M 3/E 1(0.62)(表3)。

在物種水平，供試24個彩色馬鈴薯種質(zhì)的有效等位基因數(shù)變幅為1.39～1.89，平均值為1.61；Nei’s遺傳多樣度變幅為0.25～0.47，平均值為0.36；Shannon信息指數(shù)介于0.40～0.66之間，平均值為0.54(表3)，其中M 3/E 9引物組合在以上3個參數(shù)上均表現(xiàn)為最大，說明各種質(zhì)在M 3/E 9擴(kuò)增時多態(tài)性豐富，同時也表明供試彩色馬鈴薯種質(zhì)間存在較豐富的遺傳變異。

2.3 聚類分析

利用NTSYS-pc計算24份彩色馬鈴薯的遺傳相似系數(shù)(GS)，并建立矩陣，結(jié)果(表4)表明，24份彩色馬鈴薯種質(zhì)的GS介于0.445 9～0.783 8之間，平均值為0.671 7，說明彩色馬鈴薯種質(zhì)具有較豐富的遺傳多樣性且存在一定的遺傳差異。其中Sienavodan和C 107相似系數(shù)最大(0.783 8)，表明兩種質(zhì)間遺傳差異較小，親緣關(guān)系最近。而D 613和252遺傳相似系數(shù)最小(0.445 9)，表明兩者間遺傳差異較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 引物組合M 2/E 6對24份彩色馬鈴薯的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Genmic DNA amplification results of primer combination M 2/E 6 to 24 color potatoes

圖3 彩色馬鈴薯UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA cluster of color potatoes

表3 SRAP引物組合多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Polymorphic amplification results of SARP primer combinations

利用UPGMA方法對24份彩色馬鈴薯進(jìn)行聚類分析，由圖3可知，在遺傳相似系數(shù)為0.61時，可將供試彩色馬鈴薯種質(zhì)分為四大類群，第Ⅰ類群包含7份材料，其中5個材料為紅皮馬鈴薯，2個材料為紫皮；第Ⅱ類群包含12份材料，其中紅皮黃肉或白肉的有7份，紅皮彩肉的有3份，紫皮的有2份；第Ⅲ類群包含2個品種，為黑金剛和黑美人，薯皮薯肉均為深紫色；第Ⅳ類群包含3份材料，均為紫皮紫肉種質(zhì)。

2.4 主成分分析

利用主成分分析(PCA)通過各種質(zhì)間位置可直觀判斷它們的親緣關(guān)系，種質(zhì)間位置越近表明它們的相似性越高，親緣關(guān)系越近，反之則越遠(yuǎn)?；凇?”“1”矩陣，利用NTsys軟件進(jìn)行主成分分析，形成24份種質(zhì)散點平面分布圖。前3個解釋總遺傳變異的主成分貢獻(xiàn)率依次為12.91%、9.35%、8.40%，占總遺傳變異的30.66%。從圖4可知，種質(zhì)間有交疊現(xiàn)象，說明它們之間親緣關(guān)系較近。

表4 24個彩色馬鈴薯種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)Table 4 The genetic similarity coefficients among 24 color potatoes germplasms

圖4 彩色馬鈴薯主成分分析Fig.4 Principal component analysis of color potatoes

3 討論與結(jié)論

彩色馬鈴薯是一種特殊的馬鈴薯，新品種選育雖有所成效，但仍面臨資源缺乏、適栽品種較少以及消費市場有限等問題，使彩色馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展受限。另一方面，馬鈴薯遺傳基礎(chǔ)狹窄，且收集的種質(zhì)資源由于退化難以對其進(jìn)行準(zhǔn)確表型鑒定，這在某種程度上限制了彩色馬鈴薯新品種培育和遺傳改良工作的開展。分子標(biāo)記技術(shù)從DNA水平直接反映物種的遺傳變異，克服了形態(tài)學(xué)鑒定的困難以及生長期、環(huán)境的影響，且篩選出的特異性標(biāo)記可作為該品種的分子生物學(xué)性狀[15-16]。利用分子標(biāo)記技術(shù)對彩色馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳背景和多樣性研究對雜交育種工作親本的選配具有重要指導(dǎo)意義。SRAP標(biāo)記具有操作簡便、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、成本低等優(yōu)點[17]，在各物種遺傳多樣性分析、QTL定位、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定等方面被廣泛應(yīng)用[18-21]。本研究以SRAP分子標(biāo)記技術(shù)探究了24份彩色馬鈴薯種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，14對引物共擴(kuò)增出74條多態(tài)性條帶，平均每對引物可擴(kuò)增出5.3個多態(tài)性條帶，表明SRAP標(biāo)記適合彩色馬鈴薯遺傳多樣性分析。另外，供試彩色馬鈴薯SRAP引物多態(tài)性信息量平均值為0.86，高于油梨等[22]的多態(tài)性信息量(0.33)，而與忻雅等[23]研究的草莓多態(tài)性信息量(0.91)相當(dāng)，說明SRAP-PCR技術(shù)適用于不同植物的遺傳多樣性分析，同時也表明彩色馬鈴薯在ORFs區(qū)具有豐富的遺傳多態(tài)性。Shannon信息指數(shù)(I)和Nei’s基因多樣度(H)是評價種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富度的常用指標(biāo)[24]，在物種水平上，本研究中24份彩色馬鈴薯H(均值)=0.36，I(均值)=0.54，表明其遺傳多樣性水平較豐富。

聚類分析與主成分分析是進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的有力工具，另外主成分分析更能直觀地反映種質(zhì)間的親緣關(guān)系，也是對聚類分析的佐證[25]，本研究中24份彩色馬鈴薯資源的遺傳相似系數(shù)平均值為0.61，說明其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。聚類樹狀圖顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.61時可將材料分為四類，其中，第Ⅲ類群只有2份材料，黑金剛和黑美人，薯皮薯肉均為深紫色；第Ⅳ類群包含3份材料，均為紫皮紫肉種質(zhì)，表明這兩個類群各材料間遺傳背景差異較小。第Ⅰ類群、第Ⅱ類群皮色肉色都不盡相同，但其遺傳背景較為相似，造成這種現(xiàn)象的主要原因可能是控制色素合成的基因差異較大。進(jìn)一步采用主成分分析，結(jié)果與聚類分析結(jié)果并不完全一致，這可能是與兩種分析方法的計算原理不同有關(guān)，另外，Ⅲ、Ⅳ類群間有重疊現(xiàn)象，說明其親緣關(guān)系較近，這可能與雜交育種時親本較為單一有關(guān)，因此，在常規(guī)雜交育種親本選配時，應(yīng)把育種目標(biāo)和親本間遺傳差異共同考慮。