雨生紅球藻蛋白酶解產(chǎn)物的制備和抗氧化活性評(píng)價(jià)

何宛詩(shī)，許 瑾，曹 庸，王忠銘，劉曉娟,

（1.中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

雨生紅球藻（）是一種單細(xì)胞綠藻，被認(rèn)為是繼螺旋藻、小球藻之后的又一高經(jīng)濟(jì)價(jià)值微藻，2010 年被國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)為新食品原料，富含蝦青素、多糖、蛋白質(zhì)、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分。為解決全球?qū)Α俺?jí)抗氧化劑”蝦青素的龐大需求，國(guó)內(nèi)外許多微藻企業(yè)為量產(chǎn)蝦青素規(guī)?；B(yǎng)殖雨生紅球藻，綠A 微藻養(yǎng)殖基地年產(chǎn)雨生紅球藻粉可達(dá)10 噸以上，中國(guó)已成為世界雨生紅球藻蝦青素市場(chǎng)的產(chǎn)能大國(guó)。然而，提取完蝦青素后產(chǎn)生了大量的工業(yè)藻渣，大多作為動(dòng)物飼料或被直接丟棄，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。作為微藻資源，雨生紅球藻渣中營(yíng)養(yǎng)成分豐富，其中蛋白質(zhì)含量為20.8%～22.2%。截止目前，藻渣蛋白的加工性質(zhì)已有相關(guān)研究，但蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)相關(guān)產(chǎn)品的功能活性研究仍有待進(jìn)一步完善。

微藻具有健康效益，螺旋藻、小球藻等被稱為“潛在的益生元”，因此微藻作為新型膳食補(bǔ)充劑的研究受到廣泛關(guān)注。微藻中蛋白含量豐富，如小球藻和斜生柵藻分別含有51%～58%和50%～56%蛋白質(zhì)，是一類潛在的、可利用的可再生蛋白資源。微藻蛋白的研究主要分為兩個(gè)方向：其一是探究蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)組成和功能性質(zhì)等；其二是研究蛋白酶解物及多肽的生理活性。研究表明，微藻蛋白酶解物顯示多種生理功能，如抗氧化、抗高血壓、抗炎活性等，經(jīng)純化的微藻多肽還具有較強(qiáng)的抗癌和抗菌等活性，有成為功能性食品、營(yíng)養(yǎng)品或藥物的潛力，研究前景廣闊。Norzagaray 等對(duì)杜氏鹽藻等三種綠藻藻渣進(jìn)行蛋白酶解，酶解物的抗氧化活性顯著高于藻渣，對(duì)ABTS 和DPPH 自由基有較高的清除能力，且其對(duì)彈性蛋白酶的抑制作用暗示了其抗衰老的潛能。不同蛋白酶作用下的小球藻多肽在體外顯示較強(qiáng)的DPPH、羥自由基清除能力和還原力，并能降低Bel7402 人肝癌細(xì)胞的ROS 水平，增強(qiáng)秀麗隱桿線蟲抗HO的作用以及老齡小鼠血清中抗氧化酶的活力。

目前雨生紅球藻的研究關(guān)注點(diǎn)主要停留在蝦青素，對(duì)其蛋白酶解物的探究有限。有研究表明，不同蛋白酶作用下雨生紅球藻酶解物的抗氧化能力不同，疏水性、含硫和芳香族氨基酸的含量、隨機(jī)線圈、-折疊的占比均比原蛋白要高，這些在組成和結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)很可能與其強(qiáng)抗氧化能力相關(guān)。因此，本研究以雨生紅球藻渣為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化開發(fā)制備抗氧化酶解物，以體外抗氧化活性和氨基酸組成予以評(píng)價(jià)，可為雨生紅球藻渣的高值化利用及后續(xù)研究提供參考價(jià)值，使藻渣“變廢為寶”，提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為藻源天然抗氧化劑的開發(fā)提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻渣 荊州天然蝦青素有限公司提供；堿性蛋白酶（200000 U/g）、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，98%） 上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（≥1000000 U/g） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；胰蛋白酶（250000 U/g） 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶（≥500000 U/g）Sigma-aldrich 上海貿(mào)易有限公司；鄰苯二甲醛（OPA，98%）、二硫蘇糖醇（DTT，≥98%）、L-亮氨酸（99%） 上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；四硼酸鈉（≥99.5%）、十二烷基硫酸鈉（SDS，92.5-100.5%） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；總抗氧化能力（T-AOC）FRAP法試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司；七水合硫酸鐵（FeSO·7HO）標(biāo)準(zhǔn)品 南京建成科技有限公司；其他試劑均為分析純。

AL104 天平 梅特勒-托利多公司；PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HSJ-2A 磁力水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；Avanti J-E 落地式高速大容量離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；ALPHA 2-4 LDplus 冷凍干燥機(jī) 國(guó)Marin Christ公司；多功能酶標(biāo)儀 PerkinElmer EnSpire； rapid N exceed 杜馬斯快速定氮分析儀 德國(guó)Elementar 公司；855-4507 磺酸型陽(yáng)離子樹脂分離柱 日本日立公司；L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雨生紅球藻渣蛋白的酶解工藝 蛋白提取參考Zhu 等、邱月的方法，并稍作修改。取5.0 g的雨生紅球藻渣按料液比1:20 溶解于0.05 mol/L磷酸緩沖液中，加堿調(diào)節(jié)pH 至11.5，在56 ℃下水浴加熱30 min，期間保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)。4000 r/min 離心15 min 后，將上清液pH 調(diào)至4.2，在4 ℃下靜置過(guò)夜。8000×g 離心15 min 后棄上清，將蛋白溶液pH 調(diào)至中性，冷凍干燥后獲得雨生紅球藻蛋白。用蒸餾水復(fù)溶藻蛋白，將pH 調(diào)至所用蛋白酶的最適pH，加入一定量的蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后，將酶解物于沸水中加熱10 min 滅酶活，冰浴15 min 后離心（6000 r/min，20 min），除去沉淀物后獲得蛋白酶解液。

1.2.2 蛋白酶篩選 將雨生紅球藻蛋白用蒸餾水配制為底物濃度5%的蛋白溶液，以堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶為水解用酶，將pH 調(diào)至四種酶的最適pH，加入0.3%（w:w）的酶，并于最適溫度中酶解1 h。酶解上清液用于測(cè)定各蛋白酶解物的ABTS 清除率和水解度，篩選最優(yōu)水解酶。各蛋白酶最適水解條件見表1。

表1 不同蛋白酶的最適反應(yīng)條件Table 1 The optimum reaction conditions of different proteases

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以底物濃度、加酶量、溫度、pH、時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)因素，按下述描述分別進(jìn)行酶解單因素實(shí)驗(yàn)。酶解結(jié)束后，將酶解物于沸水中加熱10 min 滅酶活，冰浴15 min 后離心（6000 r/min，20 min），上清液用于分析各因素對(duì)酶解物的ABTS自由基清除率和水解度的影響。

1.2.3.1 底物濃度對(duì)酶解物的影響 將雨生紅球藻蛋白用蒸餾水配制成底物濃度為1%、3%、5%、7%、9%的蛋白溶液，將pH 調(diào)至10.5，加入0.3%（w:w）的酶，在40 ℃下酶解3 h。

1.2.3.2 加酶量對(duì)酶解物的影響 將雨生紅球藻蛋白用蒸餾水配制成底物濃度為5%的蛋白溶液，將pH 調(diào)至10.5，分別加入0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%（w:w）的酶，在40 ℃下酶解3 h。

1.2.3.3 溫度對(duì)酶解物的影響 將雨生紅球藻蛋白用蒸餾水配制成底物濃度為5%的蛋白溶液，將pH調(diào)至10.5，加入0.3%（w:w）的酶，在30、35、40、45、50 ℃下酶解3 h。

1.2.3.4 pH 對(duì)酶解物的影響 將雨生紅球藻蛋白用蒸餾水配制成底物濃度為5%的蛋白溶液，將pH 調(diào)至7.0、8.0、9.5、10.5、11.5，加入0.3%（w:w）的酶，在40 ℃下酶解3 h。

1.2.3.5 時(shí)間對(duì)酶解物的影響 將雨生紅球藻蛋白用蒸餾水配制成底物濃度為5%的蛋白溶液，將pH 調(diào)至10.5，加入0.3%（w:w）的酶，在40 ℃下酶解1、2、3、4、5 h。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇溫度、pH 和時(shí)間為影響因素，以ABTS 清除率為響應(yīng)值，采用Design-Expert V8.0.6.1 設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)因素及水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 最優(yōu)條件酶解物的抗氧化活性評(píng)價(jià) 各取10 mg 雨生紅球藻蛋白與最優(yōu)酶解物的凍干樣，用蒸餾水溶解為10 mg/mL 的溶液，并按比例稀釋成各濃度的樣品溶液。通過(guò)抗氧化指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)比酶解底物與酶解產(chǎn)物的ABTS 自由基IC和FRAP 值。

1.2.6 水解度的測(cè)定 水解度參照Nielsen 等的OPA 法進(jìn)行測(cè)定，并稍作修改。

1.2.6.1 L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取0.10 g干燥的L-亮氨酸，用蒸餾水溶解并定容到50 mL，此時(shí)溶液的濃度為2.0 mg/mL。然后從該溶液中分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，用蒸餾水定容至25 mL，制成L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.6.2 OPA 工作液的配制 將7.620 g 四硼酸鈉和200 mg SDS 溶解至150 mL 蒸餾水中，將160 mg OPA 于黑暗避光處溶解至4 mL 乙醇，二者混合后加入176 mg DTT，最后用蒸餾水在棕色容量瓶定容至200 mL，制得OPA 工作液。

1.2.6.3 水解度的測(cè)定 將400 μL L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到3 mL OPA 工作液中，室溫下孵育2 min后，吸取200 μL 在96 孔酶標(biāo)板并在340 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。蛋白酶解物的水解度測(cè)定同上，所得吸光度對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶解物中游離氨基酸的含量（C，g/mL）。

式中：C表示酶解物的游離氨基酸含量，g/mL；C表示底物的蛋白含量，由杜馬斯燃燒法測(cè)定，0.1594 g/mL。

1.2.7 抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 ABTS 自由基清除率測(cè)定 ABTS 自由基清除率的測(cè)定參照Norzagaray 等的方法，并稍作修改。ABTS 儲(chǔ)備液（終濃度為7 mmol/L ABTS 和2.45 mmol/L 過(guò)硫酸鉀）在室溫、避光環(huán)境中靜置過(guò)夜，使用前用0.01 mol/L 磷酸緩沖液（pH7.4）稀釋成工作液，使其在734 nm 波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.05。測(cè)定時(shí)，將酶解物稀釋160 倍，在96 孔板中加入ABTS 工作液100 μL 和樣液100 μL，振蕩混勻，室溫避光處放置10 min 后在734 nm 處測(cè)定吸光度（A），同時(shí)以ABTS 工作液100 μL+蒸餾水100 μL為空白（A），磷酸緩沖液 100 μL+樣液100 μL 為對(duì)照（A）。該法可測(cè)定樣品對(duì)ABTS 自由基的清除能力，顏色越淺則代表清除能力越強(qiáng)。

式中：A表示空白組的吸光值；A表示酶解物的吸光值；A表示對(duì)照組的吸光值。

1.2.7.2 FRAP 能力測(cè)定 FRAP 能力測(cè)定參照總抗氧化能力試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，并稍作修改。在避光條件下，吸取TPTZ 溶液975 μL 與TPTZ 稀釋液9750 μL混合后，加入檢測(cè)緩沖液975 μL 均勻混合，制成FRAP工作液，使用前37 ℃預(yù)溫，現(xiàn)配現(xiàn)用。在96 孔板中依次加入30 μL FeSO·7HO 標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0、0.2、0.3、0.6、0.9 和1.2 mmol/L）和170 μL FRAP 工作液，振蕩混勻后在室溫下避光反應(yīng)10 min，于593 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。樣液測(cè)定同上，樣品的FRAP 值以達(dá)到相同吸光度所需FeSO的濃度表示。該法可測(cè)定樣品對(duì)三價(jià)鐵離子的還原能力，顏色越深則代表還原能力越強(qiáng)。

1.2.8 抗氧化酶解物的氨基酸組成分析 按照GB 5009.124-2016 的方法，對(duì)最優(yōu)酶解物進(jìn)行前處理和上樣測(cè)定。酸水解過(guò)程中色氨酸完全被破壞，蛋氨酸和胱氨酸部分被破壞。氨基酸組成分析采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行，具體上樣檢測(cè)的條件為：色譜柱采用磺酸型陽(yáng)離子樹脂分離柱（4.6 mm×60 mm），進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)器為鎢燈檢測(cè)器；流動(dòng)相采用檸檬酸（鋰）PF 緩沖液，流速：洗脫泵0.35 mL/min，衍生泵0.30 mL/min；反應(yīng)柱溫：135 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)通道1為570 nm，通道2 為440 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均采用3 次平行處理，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，不同處理組之間的差異用多重比較分析（LSD）、單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA）進(jìn)行處理，＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選

蛋白酶種類對(duì)雨生紅球藻蛋白酶解物的ABTS清除能力和水解度的影響如圖1 所示。各酶解物的抗氧化能力順序?yàn)椋簤A性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶，各酶之間存在顯著性差異（＜0.05），堿性蛋白酶解物的ABTS 自由基清除率達(dá)51.58%±0.66%。且堿性蛋白酶解物中游離氨基酸含量相對(duì)最低，水解度顯著低于另外三種酶解物（0.05）。

圖1 不同蛋白酶對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on the ABTS free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of hydrolysates

堿性蛋白酶是一種具廣泛選擇性和特異性的內(nèi)切酶，對(duì)蛋白質(zhì)羧基側(cè)的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸具有較強(qiáng)的專一性，傾向于剪切Glu、Met、Leu、Tyr、Lys 和 Gln 的肽鍵，比其它酶更容易產(chǎn)生強(qiáng)抗氧化的疏水性多肽，而雨生紅球藻中富含這些氨基酸。另外，該酶的一個(gè)重要應(yīng)用就是水解植物殘?jiān)臍埩舻鞍踪|(zhì)，如果皮、果核等，酶解產(chǎn)物的自由基清除能力顯著高于胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，與本研究結(jié)果一致，且在較寬的pH 范圍內(nèi)顯示出優(yōu)異的蛋白質(zhì)溶解性。馬艷芳發(fā)現(xiàn)螺旋藻經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶作用的水解物DPPH 自由基清除能力優(yōu)于木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶的產(chǎn)物。也有學(xué)者采用含堿性蛋白酶的復(fù)合酶來(lái)水解微藻，充分發(fā)揮協(xié)同作用。

水解度是常用于體現(xiàn)酶解程度的指標(biāo)，定義為被蛋白酶作用斷裂的肽鍵的占比。理論上，高水解度、低分子量的肽會(huì)有更高的抗氧化活性，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)酶解程度增加會(huì)生成許多小分子肽和游離氨基酸，伴隨著可電離基團(tuán)（NH和COO）增多，同時(shí)在分子結(jié)構(gòu)上疏水區(qū)域逐漸暴露，這些變化都可能增加酶解物的抗氧化活性。但是，近年來(lái)越來(lái)越多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，水解度并不是決定酶解物抗氧化活性的主要因素，它與自由基清除率并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，不存在明顯的相關(guān)關(guān)系。酶解反應(yīng)實(shí)質(zhì)上是抗氧化肽不斷形成和分解的過(guò)程，過(guò)度水解可能會(huì)破壞肽鏈中原本能發(fā)揮功能活性的區(qū)域。酶解物的綜合活性還與肽鏈特殊空間結(jié)構(gòu)、氨基酸序列等多種因素有關(guān)，水解度僅是判斷產(chǎn)物抗氧化能力的輔助指標(biāo)。綜合考慮后選擇堿性蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 底物濃度對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響 不同底物濃度對(duì)雨生紅球藻蛋白酶解物的ABTS 自由基清除能力和水解度的影響如圖2所示。在抗氧化活性方面，酶解物的ABTS 清除能力隨底物濃度增加而增加，9%濃度的清除能力顯著高于其他組別（0.05），清除率達(dá)84.67%±0.85%。在酶解程度方面，各濃度的水解度無(wú)顯著差異（＞0.05）。酶解物底物濃度在合適范圍內(nèi)（0%～10%）增加，底物與酶結(jié)合的位點(diǎn)隨之增多，產(chǎn)生更多抗氧化能力強(qiáng)的物質(zhì)，濃度過(guò)大會(huì)抑制產(chǎn)物的活性，研究顯示在制備鹿血酶解物和螺旋藻肽時(shí)，分別在底物濃度9%和10%的水平下抗氧化能力達(dá)到峰值。因此選擇底物濃度9%的水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 底物濃度對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響Fig.2 Effect of substrate concentrations on the ABTS free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of hydrolysates

2.2.2 加酶量對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響 不同加酶量對(duì)雨生紅球藻蛋白酶解物的ABTS 自由基清除能力和水解度的影響如圖3 所示。在抗氧化活性方面，加酶量在0.7%之前，酶解物ABTS自由基清除能力隨加酶量加大而增強(qiáng)，0.7%加酶量的酶解效果最佳，清除率達(dá)72.56%±1.02%，之后則開始減弱；水解度也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，在同一點(diǎn)達(dá)到最大值。隨加酶量增大，自由基清除率和水解度反而減弱的原因可能是，產(chǎn)物與酶在酶過(guò)量時(shí)會(huì)形成復(fù)合物，阻礙底物與酶的結(jié)合，從而抑制了酶解作用。從經(jīng)濟(jì)成本和環(huán)境保護(hù)的角度綜合考慮，應(yīng)選擇用量少、抗氧化效果最高的水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)選擇加酶量0.7%水平。

圖3 加酶量對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響Fig.3 Effect of dosage of proteases on the ABTS free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of hydrolysates

2.2.3 溫度對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響 不同溫度對(duì)雨生紅球藻蛋白酶解物的ABTS自由基清除能力和水解度的影響如圖4 所示。當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃前，ABTS 自由基清除率隨溫度增加而呈現(xiàn)先升高后減弱的趨勢(shì)，在40 ℃達(dá)到最大值，清除率達(dá)67.12%±0.22%，溫度大于45 ℃后清除率回升。過(guò)高溫下產(chǎn)物抗氧化能力回升的結(jié)果也曾出現(xiàn)在其它研究中，具體原因還未查明，可能是該溫度可激活另一個(gè)抗氧化酶切位點(diǎn)。當(dāng)溫度大于30 ℃時(shí)，酶解物水解度與30 ℃相比顯著降低（0.05），且隨著溫度的增加水解度無(wú)顯著變化（0.05）。原因可能是在多因素的影響下，酶的最適溫度較表1有所降低，30 ℃之后蛋白酶活性開始減弱，催化速率變小。因此選擇溫度35～45 ℃水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 酶解溫度對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on the ABTS free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of hydrolysates

2.2.4 pH 對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響 不同pH 對(duì)雨生紅球藻蛋白酶解物的ABTS自由基清除能力和水解度的影響如圖5 所示。pH調(diào)至大于8 時(shí)，酶解物的ABTS 自由基清除率隨著pH 的升高而增加，pH 為11.5 的酶解效果最佳，清除率達(dá)69.88%±0.22%。各pH 條件下酶解物的水解度無(wú)顯著差異（＞0.05）。反應(yīng)體系的pH對(duì)酶活力、酶分子和底物分子的狀態(tài)等有很大影響，一般而言堿性蛋白酶在中等堿性環(huán)境下很穩(wěn)定，多數(shù)微藻抗氧化肽的酶解條件為pH7～9。鷹嘴豆多肽的研究很接近上述結(jié)果，表示該酶也能在強(qiáng)堿環(huán)境下（pH10～12）發(fā)揮效果，猜測(cè)這與堿溶酸沉法提取蛋白的pH 與酶解最適pH 相同是有關(guān)的。有研究表明堿性蛋白酶解物在pH12 時(shí)溶解度仍然很高，不會(huì)影響進(jìn)一步應(yīng)用，因此在該pH 范圍內(nèi)酶解蛋白是可行的，綜合考慮后選擇pH9.5～11.5 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 pH 對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響Fig.5 Effect of pH on the ABTS free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of hydrolysates

2.2.5 時(shí)間對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響 不同時(shí)間對(duì)雨生紅球藻蛋白酶解物的ABTS 自由基清除能力和水解度的影響如圖6 所示。4 h 前，酶解物ABTS 自由基清除能力隨時(shí)間增長(zhǎng)而增加，在4 h 達(dá)到頂峰，清除率達(dá)78.14%±0.74%，之后則開始減弱。1、3 h 的水解度顯著低于其它三個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0.05）。4 h 后酶解物抗氧化活性降低的原因可能是長(zhǎng)時(shí)間酶解使部分強(qiáng)抗氧化肽被水解成肽鏈更短、抗氧化更弱的短肽。因此選擇時(shí)間3～5 h 水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖6 時(shí)間對(duì)酶解物ABTS 自由基清除率和水解度的影響Fig.6 Effect of time on the ABTS free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of hydrolysates

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 選擇對(duì)ABTS 自由基清除率影響效果較大的3 個(gè)因素酶解時(shí)間（A）、酶解pH（B）和酶解溫度（C）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，得到的試驗(yàn)方案、結(jié)果和方差分析見表3、表4。模型項(xiàng)的0.01，失擬項(xiàng)的＞0.05，說(shuō)明模型擬合成功，方程擬合度高?；貧w模型的決定系數(shù)（）為0.9395，說(shuō)明ABTS 自由基清除率的實(shí)測(cè)值比預(yù)測(cè)值擬合較好；調(diào)整決定系數(shù)（）為0.8616，表明該模型能解釋86.16%的響應(yīng)值變化。根據(jù)值，各因素對(duì)雨生紅球藻蛋白酶解物抗氧化活性的影響順序?yàn)閜H＞溫度＞時(shí)間。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experiment design with results for response surface analysis

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of regression equation

響應(yīng)面回歸方程為：Y=75.40+0.67A+5.72B-0.72C-3.74AB+0.29AC+1.92BC-0.063A+4.44B-6.54C

圖7（a）響應(yīng)面顯示，pH 越大、時(shí)間越小，清除率越高；沿pH 方向的響應(yīng)面坡度較時(shí)間方向陡峭，說(shuō)明pH 對(duì)清除率的影響更大。圖7（b）響應(yīng)面曲面較均勻，坡度陡峭度中等，最高值對(duì)應(yīng)的點(diǎn)在接近中心的位置；沿溫度方向的響應(yīng)面坡度較時(shí)間方向軸陡峭，說(shuō)明溫度對(duì)清除率的影響更大。圖7（c）響應(yīng)面曲面向上延伸，在溫度方向接近中心的位置、pH 方向最大值處取到清除率最大值。根據(jù)坡度陡峭度判斷各因素對(duì)清除率的影響程度，為pH＞溫度＞時(shí)間，與方差分析結(jié)果一致。

圖7 兩因素之間交互作用對(duì)ABTS 自由基清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of interaction between two factors on ABTS free radical scavenging rate

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)系統(tǒng)給出的最優(yōu)條件為溫度40.4 ℃、pH11.5、時(shí)間3 h。為了驗(yàn)證模型的可靠性且考慮到實(shí)際可操作性，采用溫度40 ℃、pH11.5、時(shí)間3 h 進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得酶解物的實(shí)際清除率為86.02%±5.69%，與軟件預(yù)測(cè)值88.58%相近，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的回歸模型方程及最佳條件可靠。

2.4 最優(yōu)酶解物的抗氧化活性及組成

2.4.1 最優(yōu)酶解物的體外抗氧化活性 如圖8 所示，隨著物質(zhì)濃度的增加，最優(yōu)酶解物的ABTS 自由基清除能力逐步增強(qiáng)，并在1000 μg/mL 時(shí)達(dá)到75.53%±0.25%，此后清除率隨濃度遞增的速度開始減緩。如圖9 所示，最優(yōu)酶解物的FRAP 值隨著物質(zhì)濃度的增加越來(lái)越大，在9000 μg/mL 時(shí)達(dá)到最大值76.20±8.53 μmol/L FeSO·7HO，此后還原能力基本不變。

圖8 最優(yōu)酶解物的ABTS 自由基清除率Fig.8 ABTS free radical scavenging rate of optimal hydrolysate

圖9 最優(yōu)酶解物的FRAP 能力Fig.9 FRAP of optimal hydrolysate

經(jīng)過(guò)酶解后，雨生紅球藻酶解物比蛋白顯示更強(qiáng)的體外抗氧化活性，結(jié)果如表5 所示。酶解物的ABTS 自由基清除率的IC值為481.574 μg/mL，極顯著低于藻蛋白（0.01）；對(duì)比發(fā)現(xiàn)，其IC值優(yōu)于舌狀蜈蚣藻蛋白酶解物（880 μg/mL）和紫菜渣餅酶解物（1010 μg/mL）。為評(píng)價(jià)不同物質(zhì)的亞鐵離子還原能力，對(duì)比每克原料的FRAP 值：雨生紅球藻酶解物的FRAP 為19.641 μmol FeSO·7HO/g（濃度為1000 μg/mL），極顯著高于藻蛋白（0.01），高于藍(lán)鯊皮膚抗氧化肽的FRAP 數(shù)值（9.23 μmol FeSO·7HO/g）。由此可見，該酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化作用，且活性具備劑量效應(yīng)關(guān)系，濃度與活性呈正相關(guān)關(guān)系。

表5 雨生紅球藻蛋白酶解物的抗氧化活性評(píng)價(jià)Table 5 Antioxidant activity of Haematococcus pluvialis hydrolysate

2.4.2 最優(yōu)酶解物的氨基酸組成 如表6、表7 所示，最優(yōu)酶解物中氨基酸種類豐富，含17 種氨基酸，必需氨基酸有7 種，分別是Lys、Phe、Met、Thr、Ile、Leu 和Val，必需氨基酸占總氨基酸的含量達(dá)到34.44%，與FAO/WHO 提出的EAA/TAA 為40%接近，且優(yōu)于鏈帶藻蛋QL96 蛋白質(zhì)。酶解物中含量最高的是Glu（16.41%）和Asp（12.33%），這兩種氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，也是哺乳動(dòng)物腸細(xì)胞ATP 的主要來(lái)源，可通過(guò)脫羧基或轉(zhuǎn)氨基等作用轉(zhuǎn)化為其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮健康效應(yīng)，且有研究表明Glu 和Asp 的含量與抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系。由此可知雨生紅球藻蛋白酶解物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

表6 雨生紅球藻蛋白酶解物的氨基酸組成Table 6 Amino acid content of Haematococcus pluvialis hydrolysate

表7 不同類型氨基酸與總氨基酸含量比例Table 7 Ratio of different types of amino acids to total amino acids

按氨基酸類型分析，雨生紅球藻蛋白酶解物的酸性氨基酸、堿性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸和極性氨基酸的含量比例為4:1:1:11:3，接近Pavlicevic 等歸納得出的海洋源抗氧化生物活性肽的結(jié)構(gòu)組成，這說(shuō)明該蛋白酶解物中很大可能存在強(qiáng)抗氧化的藻源多肽。疏水性氨基酸的含量高達(dá)38.07%，分別是Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Pro 和Met，這些氨基酸有助于促進(jìn)疏水性較強(qiáng)的肽段的形成，可通過(guò)多種途徑增強(qiáng)物質(zhì)清除自由基的能力，如促進(jìn)酶解物在脂質(zhì)-水界面處的溶解，使其更易于進(jìn)入疏水性的靶器官，或作為供氫體發(fā)揮功效，也可充分利用其與金屬離子螯合（如Fe和Cu）的性質(zhì)。酸性氨基酸（Glu 和Asp）和堿性氨基酸（Lys 和Arg）在抗氧化中也起著重要作用，其所帶電荷直接決定酶解物對(duì)金屬離子的螯合能力，含量分別為28.75%和9.26%。以上三類與抗氧化高度相關(guān)的氨基酸占總氨基酸含量的76.08%，較好地解釋了該酶解物的抗氧化活性。

此外，芳香族、脂肪族和極性氨基酸也可提供相應(yīng)的自由基消除能力。芳香族氨基酸既可以利用自身存在的咪唑環(huán)供氫和捕捉自由基，也可能利用和其他氨基酸的作用來(lái)增強(qiáng)疏水性能力，以提高物質(zhì)的抗氧化功能，其消除自由基的能力約是脂肪族氨基酸的二倍以上。脂肪族氨基酸能增強(qiáng)基于肽的依布硒啉類似物的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，但其對(duì)抗氧化酶解物的作用機(jī)理還有待證實(shí)。極性氨基酸可螯合金屬離子以發(fā)揮抗氧化作用，還能與非極性氨基酸相互協(xié)同來(lái)增強(qiáng)自由基清除能力。綜上所述，雨生紅球藻蛋白酶解物可作為天然抗氧化劑的一種來(lái)源，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有可觀的健康效應(yīng)。

3 結(jié)論

本研究利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，通過(guò)抗氧化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定篩選，制備了具較強(qiáng)抗氧化活性的雨生紅球藻蛋白酶解物。最終確定的最佳酶解條件為：以堿性蛋白酶為實(shí)驗(yàn)用酶，底物濃度為9%（w:v），加酶量為0.7%（w:w），酶解溫度40 ℃，pH11.5，酶解時(shí)間為3 h。用最優(yōu)方案制備的酶解物的ABTS自由基清除率IC值為481.574 μg/mL，亞鐵離子還原能力為19.641 μmol FeSO·7HO/g（1000 μg/mL），抗氧化活性極顯著高于藻渣蛋白（＜0.01）。該酶解物的氨基酸種類豐富，必需氨基酸含量達(dá)34.4%，且內(nèi)含較多疏水性氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。本研究為雨生紅球藻渣的綜合利用及后續(xù)研究提供了理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步分離純化雨生紅球藻抗氧化肽提供了參考價(jià)值，為藻源天然抗氧化劑的開發(fā)提供新途徑。