miR-212-5p通過(guò)靶向PCED1B基因抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖和凋亡

王俊卿 王敏 李晶

(1酒泉市人民醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000；2上海市口腔醫(yī)院)

膀胱癌(BC)是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均居高不下，其主要治療方式是手術(shù)和輔助放化療，前期患者需要順鉑全身化療，或采用新的靶向或免疫治療〔1〕。研究表明，miRNA在癌癥中通常表達(dá)異常，可能與癌癥的分化、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。miRNA在BC組織、患者尿液或血液樣本中表達(dá)異常，可能與患者診斷、預(yù)后、疾病監(jiān)測(cè)和靶向治療等相關(guān)〔2〕。有報(bào)道顯示，miR-212-5p在胃癌〔3〕和三陰性乳腺癌〔4〕中低表達(dá)，其通過(guò)lncMIF-AS1/miR-212-5p/NDUFA4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖并抑制凋亡，其表達(dá)水平與乳腺癌的腫瘤大小、是否侵犯淋巴結(jié)和血管有關(guān)，其高表達(dá)可抑制乳腺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究通過(guò)StarBase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-212-5p與PCED 1B可能存在靶向關(guān)系。PCED1B在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，敲除PCED1B可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力〔5〕。但miR-212-5p和PCED1B在BC中表達(dá)和作用尚不清楚。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果和上述報(bào)道結(jié)論，本研究以BC細(xì)胞系為主要研究對(duì)象，假設(shè)miR-212-5p靶向PCED1B基因通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)BC細(xì)胞凋亡和增殖。

1 材料與方法

1.1材料 人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1及BC細(xì)胞系T24、RT4和UM-UC-3購(gòu)自美國(guó)ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基、F12K培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK-8試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；引物、miR-212-5p模擬物(miR-212-5p)、miR-212-5p抑制劑(anti-miR-212-5p)、PCED1B抑制劑(si-PCED1B)、PCED1B高表達(dá)載體(pcDNA-PCED1B)和對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC、si-NC和pcDNA-NC)及PCED1B野生型和突變型雙熒光載體均購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；PCED1B抗體、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、β-catenin抗體和β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將SV-HUC-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的F12K培養(yǎng)基中，將BC細(xì)胞T24、RT4和UM-UC-3培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中均添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)條件：在濕度95%，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，消化傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將RT4細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，胰蛋白酶消化，以1×106個(gè)細(xì)胞/ml接種于6孔板培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-NC、miR-212-5p mimics、si-NC、si-PCED1B分別轉(zhuǎn)染至RT4細(xì)胞，分別記為miR-NC組、miR-212-5p組、si-NC組、si-PCED1B組。miR-212-5p mimics和pcDNA-NC、miR-212-5p mimics和pcDNA-PCED1B分別共轉(zhuǎn)染至RT4細(xì)胞，分別記為miR-212-5p+pcDNA-NC組、miR-212-5p+pcDNA-PCED1B組。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)RNA的表達(dá) 總RNA提取試劑盒從SV-HUC-1、T24、RT4和UM-UC-3細(xì)胞中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并檢測(cè)，然后以cDNA 為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，合成miR-212-5p和PCED1B mRNA。運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖率 胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的RT4細(xì)胞，培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，以濃度2×103個(gè)細(xì)胞/孔(200 μl細(xì)胞)接種于96孔板，加入20 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染后的RT4培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰蛋白消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，清洗細(xì)胞，稀釋細(xì)胞，取5×103個(gè)細(xì)胞，棄上清，加入195 μl AnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μl AnnexinV-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，室溫避光孵育10～20 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Western印跡 收集各組轉(zhuǎn)染的RT4細(xì)胞，室溫用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液裂解30 min，超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白，檢測(cè)蛋白濃度。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣本，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，PCED1B抗體(1∶1 000)、CyclinD1抗體(1∶3 000)、酶切caspase-3抗體(1∶1 500)、β-catenin抗體(1∶6 000)和抗β-actin抗體(1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜。洗膜3次，然后加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-212-5p、PCED1B的靶向關(guān)系 根據(jù)1.2.2方法培養(yǎng)RT4至細(xì)胞融合度為80%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的PCED1B的野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶報(bào)告載體，分別與miR-NC或miR-212-5p共轉(zhuǎn)染RT4細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，離心收集上清，-20℃保存或直接檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

1.2.8Western 印跡驗(yàn)證miR-212-5p、PCED1B的調(diào)控關(guān)系 采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-NC、miR-212-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-212-5p分別轉(zhuǎn)染至RT4細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)PCED1B蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1在BC細(xì)胞系中，PCED1B高表達(dá)，miR-212-5p低表達(dá) 與人膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1組相比，BC細(xì)胞系T24、RT4和UM-UC-3組細(xì)胞中miR-212-5p含量均顯著下降(P<0.05)，PCED1B的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖1。PCED1B和miR-212-5p在T24、RT4和UM-UC-3 BC細(xì)胞系中表達(dá)情況一致，采用表達(dá)差異較大的RT4細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 BC細(xì)胞系中miR-212-5p和PCED1B 表達(dá)水平

圖1 Western印跡檢測(cè)PCED1B蛋白表達(dá)

2.2高表達(dá)miR-212-5p抑制BC RT4細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡 與miR-NC組相比，miR-212-5p組RT4細(xì)胞中miR-212-5p含量顯著升高，CyclinD1和酶切caspase-3表達(dá)量均顯著降低，細(xì)胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖2，表2。說(shuō)明高表達(dá)miR-212-5p可降低BC RT4細(xì)胞的增殖率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B：Western印跡檢測(cè)CyclinD1、酶切caspase-3蛋白表達(dá)圖2 高表達(dá)miR-212-5p對(duì)BC細(xì)胞RT-4增殖和凋亡的影響

表2 高表達(dá)miR-212-5p抑制BC細(xì)胞RT4細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡

2.3低表達(dá)PCED1B對(duì)BC細(xì)胞RT4增殖和凋亡的影響 與si-NC組相比，si-PCED1B組RT4細(xì)胞中PCED1B、CyclinD1和酶切caspase-3、細(xì)胞增殖率均顯著下降(均P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表3。說(shuō)明低表達(dá)PCED1B可抑制BC RT4細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。

A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B：Western印跡檢測(cè)PCED1B、CyclinD1、酶切caspase-3蛋白表達(dá)圖3 低表達(dá)PCED1B對(duì)BC細(xì)胞RT4增殖和凋亡的影響

表3 低表達(dá)PCED1B對(duì)BC細(xì)胞RT4增殖和凋亡的影響

2.4miR-212-5p靶向PCED1B StarBase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCED1B的3′UTR中含有與miR-212-5p互補(bǔ)的位點(diǎn)，說(shuō)明PCED1B可能是miR-212-5p的靶基因，見(jiàn)圖4。與miR-NC組相比，miR-212-5p組PCED1B WT的熒光素酶相對(duì)活性顯著下降(P<0.05)；而PCED1B MUT的熒光素酶相對(duì)活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。miR-212-5p組PCED1B蛋白水平(0.39±0.04)顯著低于miR-NC組(1.13±0.11，P<0.05)，anti-miR-212-5p組PCED1B蛋白水平(1.42±0.14)顯著高于anti-miR-NC組(1.16±0.12，P<0.05)。見(jiàn)圖5。說(shuō)明miR-212-5p靶向負(fù)向調(diào)控PCED1B的表達(dá)。

2.5恢復(fù)PCED1B表達(dá)可部分反轉(zhuǎn)miR-212-5p高表達(dá)對(duì)RT4細(xì)胞凋亡和增殖的影響 恢復(fù)PCED1B表達(dá)后RT4細(xì)胞中的PCED1B、CyclinD1和酶切caspase-3表達(dá)量、細(xì)胞增殖率均顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6、圖7、表5。說(shuō)明恢復(fù)PCED1B表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-212-5p高表達(dá)對(duì)RT4細(xì)胞凋亡和增殖的影響。

圖4 StarBase對(duì)miR-212-5p和PCED1B結(jié)合 進(jìn)行預(yù)測(cè)

表4 雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組、miR-212-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-212-5p組圖5 Western印跡檢測(cè)PCED1B表達(dá)量

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖7 Western印跡檢測(cè)PCED1B、CyclinD1、 酶切-caspase-3蛋白表達(dá)

表5 高表達(dá)PCED1B可部分逆轉(zhuǎn)miR-212-5p高表達(dá)對(duì)RT4細(xì)胞凋亡和增殖的影響

2.6Western印跡檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 與miR-NC組β-catenin蛋白水平(0.86±0.09)相比，miR-212-5p組(0.34±0.03)顯著降低(P<0.05)；與miR-212-5p+pcDNA-NC組β-catenin蛋白水平(0.36±0.04)相比，miR-212-5p+pcDNA-PCED1B組(0.72±0.07)顯著升高(P<0.05)；見(jiàn)圖8。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-212-5p可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，而恢復(fù)PCED1B表達(dá)可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

1～4：miR-NC組、miR-212-5p組、miR-212-5p+pcDNA-NC組、miR-212-5p+pcDNA-PCED1B組圖8 Western印跡檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)

3 討 論

BC大多是淺表性的，大約有30%的BC會(huì)演變成肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌(MIBC)或轉(zhuǎn)移性BC，全身化療加放射治療是保留膀胱的重要治療方法，順鉑為主的化療是轉(zhuǎn)移性BC的主要治療手段，靶向抑制劑為主要形式的個(gè)性化治療也越來(lái)越多的用于BC，改善患者預(yù)后和延長(zhǎng)生存期〔6〕。

研究表明，miR-212-5p與癌癥〔3，4〕、創(chuàng)傷性腦損傷〔7〕、帕金森病〔8〕、急性髓系白血病〔9〕等多種疾病有關(guān)。miR-212-5p在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝方面具有新的功能，可能是治療非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的潛在治療靶點(diǎn)〔10〕。miR-212-5p在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中表達(dá)下調(diào)，其可抑制COPD相關(guān)基因的過(guò)度表達(dá)，對(duì)COPD具有保護(hù)作用〔11〕。miR-212-5p在黑色素瘤組織中表達(dá)下調(diào)，其低水平與黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)，上調(diào)其表達(dá)可通過(guò)抑制kruppel樣因子(KLF)4蛋白進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔12〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與人膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1相比，miR-212-5p在BC細(xì)胞系T24、RT4和UM-UC-3中表達(dá)均顯著下調(diào)，與研究〔3，4，12〕結(jié)果類(lèi)似；說(shuō)明miR-212-5p在BC的發(fā)展中具有重要作用。

Yang等〔5〕發(fā)現(xiàn)PCED1B和PCED1B-AS1在膠質(zhì)瘤中均表達(dá)升高，敲除PCED1B或PCED1B-AS1均可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡能力，上調(diào)PCED1B可逆轉(zhuǎn)PCED1B-AS1沉默對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，PCED1B通過(guò)PCED1B-AS1/miR-194-5p/PCED1B信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮致癌作用〔5〕。還有研究表明，PCED1B甲基化的升高可能與消防員癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)，PCED1B在BC細(xì)胞系A(chǔ)489、RT4和SN12-PM6中均表達(dá)上調(diào)，與研究〔5〕結(jié)論類(lèi)似，低表達(dá)PCED1B可抑制BC RT4細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。說(shuō)明PCED1B在BC也發(fā)揮致癌作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控胚胎發(fā)育和維持成人體內(nèi)干細(xì)胞平衡中起著關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞等多種生理病理過(guò)程，Wnt/β-catenin通路失調(diào)與BC的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程密切相關(guān)〔14〕。Wnt參與了尿路上皮的發(fā)育和維持成人尿路上皮組織的穩(wěn)態(tài)，Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵分子的突變/表觀(guān)遺傳學(xué)改變與BC的發(fā)生、耐藥性的發(fā)展和生存率的提高有關(guān)〔15〕。

綜上，在BC RT4細(xì)胞中，miR-212-5p靶向PCED1B可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控BC細(xì)胞凋亡和增殖。miR-212-5p可能是BC的潛在分子靶點(diǎn)。