國槐不同器官轉(zhuǎn)錄組分析及EST?SSR引物開發(fā)應(yīng)用

郁 潔 徐立人 龐新博 劉朝華 李泳潭 原陽晨 董 研

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000；4. 河北省洪崖山國有林場(chǎng)，河北 保定 074200）

國槐（Sophora japonica），又名家槐、中華槐等，為豆科（Leguminosae ）槐屬多年生落葉喬木。國槐的栽培歷史悠久，約在3000年以上，我國古代最早的詞典《爾雅》有關(guān)于槐的記載，《山海經(jīng)》中有“首山其木為槐”的記述[1]。國槐原產(chǎn)地為我國北部，常見于華北平原和黃土高原，現(xiàn)全國各地均有栽培，是我國常見的綠化樹種。國槐樹高可達(dá)25 m，樹干表皮灰褐色，表面粗糙縱裂，小枝綠色，皮孔明顯，花期一般在6—7月，可作為優(yōu)良的蜜源植物[2]。其萌芽力強(qiáng)、生長快、極耐修剪，在涵養(yǎng)水源、防風(fēng)固沙、水土保持等環(huán)境方面有重要的作用[3]?；趪钡闹T多優(yōu)良特性，我國的科研工作者進(jìn)行了長期的國槐新品種選育工作，相繼選育出了一批國槐優(yōu)良品種，如聊紅槐、華箭、嫣紅3號(hào)[4?6]等。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)能夠精確地進(jìn)行遺傳多樣性分析?，F(xiàn)已開發(fā)出RAPD、SRAP、ISSR、AFLP等多種標(biāo)記手段，并已應(yīng)用到多種植物的遺傳多樣性評(píng)價(jià)中[7]。SSR（simple sequence repeats）分子標(biāo)記也稱微衛(wèi)星序列標(biāo)記，是一類由若干個(gè)核苷酸（1～6個(gè)）為重復(fù)單元串聯(lián)重復(fù)組成的DNA序列，廣泛分布在真核生物的基因組中，其較傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記等具有共顯性、穩(wěn)定性高、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在研究生物遺傳多樣性、親本鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種等眾多方面發(fā)揮著重要作用[8?9]。SSR標(biāo)記根據(jù)來源可分為基因組SSR（G?SSR）和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST?SSR），G?SSR標(biāo)記來源于基因組序列，一般采用構(gòu)建和篩選基因組文庫、微衛(wèi)星富集和數(shù)據(jù)檢索等經(jīng)典方法進(jìn)行開發(fā)，該類標(biāo)記極少能定位到基因上。EST?SSR標(biāo)記來源于轉(zhuǎn)錄序列，是生物體某一組織在特定時(shí)期的表達(dá)基因，可定位在相關(guān)的功能基因上，且具有種屬間的通用性[10?11]。目前，已有大量關(guān)于利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)不同物種EST?SSR分子標(biāo)記的報(bào)道[12?13]，國槐作為我國優(yōu)良的鄉(xiāng)土樹種，其遺傳多樣性研究僅限于擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）、簡單序列間重復(fù)序列（ISSR）及少量表達(dá)序列標(biāo)簽（EST?SSR）[14?16]等，EST?SSR引物資源相對(duì)較為匱乏。本試驗(yàn)以11個(gè)不同國槐無性系為材料，從“青云1號(hào)”無性系中隨機(jī)選擇一株，對(duì)其根、莖、葉不同器官進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，進(jìn)行GO及 KEGG功能富集，進(jìn)一步對(duì)不同器官中EST?SSR的分布情況進(jìn)行初步分析，開發(fā)出一套EST?SSR標(biāo)記，進(jìn)而構(gòu)建11個(gè)國槐無性系的進(jìn)化樹及指紋圖譜，以期為今后國槐的種質(zhì)資源保護(hù)、新品種開發(fā)及生物信息學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗(yàn)所在地為河北省洪崖山國有林場(chǎng)管理局七里亭示范林場(chǎng)，位于河北省保定市易縣京環(huán)線（N 39°35′99″，E 115°56′36″），屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，雨熱同期。年平均氣溫12.2 ℃，年降水量570 mm，無霜期 200 d，年平均日照 2578.3 h，太陽輻射量128 J/(m2·d)。

以河北省林科院選育的“青云1號(hào)”國槐品種為對(duì)照（CK）及2016年在河北省洪崖山國有林場(chǎng)國槐實(shí)生林中選出同一種源地內(nèi)10株樹干通直、生長健壯的單株為材料（編號(hào)為A?1～A?10），2019年3月，采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以2年生普通國槐為砧木，以低接的方式，構(gòu)建11個(gè)不同國槐無性系的對(duì)比試驗(yàn)林，設(shè)3個(gè)區(qū)組，每個(gè)區(qū)組11個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)栽6株，株行距為3 m ×4 m。

1.2 研究方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

本試驗(yàn)以2年生國槐品種“青云一號(hào)”為材料，隨機(jī)選取一株生長健壯、無病蟲害的國槐無性系，分別從上、中、下3層采集其根、莖、葉不同部位的新鮮組織3次，隨后進(jìn)行混樣，液氮速凍后將其放入干冰中，送至北京諾和致源科技股份有限公司進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，本研究中各樣品的Q30堿基百分比均在93.19%以上，測(cè)序質(zhì)量較高，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

1.2.2 DNA提取

2020年7月28日，于每個(gè)無性系采集生長健壯、無病蟲害的嫩葉，放入裝有變色硅膠的PE自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，采用改良的CTAB 法[17]提取各樣本的總DNA，將檢測(cè)合格的DNA統(tǒng)一稀釋至20 ng/μL，放入?65 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 EST?SSR引物設(shè)計(jì)與篩選

采用MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html ) 軟件查找轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的SSR位點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)為：單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)單元最低重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5次。參考 Guo 等[18]的方法，使用Primer 3軟件進(jìn)行EST?SSR引物的設(shè)計(jì)與篩選，標(biāo)準(zhǔn)為：1）GC堿基含量為40% ～ 60% ；2）引物長度設(shè)置在18～25 bp；3）預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小在100～300 bp；4）退火溫度為52～65 ℃，且同一引物的正向引物和反向引物溫度差小于0.6 ℃；5）引物之間無引物二聚體結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。進(jìn)一步從符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的引物中隨機(jī)挑選30對(duì)，交由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.4 PCR擴(kuò)增體系及程序

PCR擴(kuò)增體系采用20 μL體系，各成分及比例 為：2 × M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix(Blue)10 μL，正向引物和反向引物各1 μL (10 ng/μL)，DNA模板1 μL (20 ng/μl)，最后用去Nuclease-free dd H2O補(bǔ)足至20 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸15 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電壓設(shè)定為230 V，時(shí)間為35 min，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染顯色及拍照記錄。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

利用EXCEL 2016軟件對(duì)全部Unigene序列中SSR位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率、分布規(guī)律、數(shù)量及類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；將8%非變性聚丙烯凝膠電泳所得到的圖片，轉(zhuǎn)換為0/1矩陣，有擴(kuò)增條帶的記為1，反之為0 ；利用 Cervus 3.0.7 軟件計(jì)算各引物的多態(tài)性信息量（PIC）；利用 POPGENE 32軟件統(tǒng)計(jì)具有多態(tài)性引物的 Shannon's 指數(shù)（I）、等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）等；利用DPS 7.05 軟件，利用類平均法（UPGMA）計(jì)算各樣本間的遺傳距離矩陣并繪制進(jìn)化樹，構(gòu)建指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 國槐不同器官轉(zhuǎn)錄組差異分析

2.1.1 測(cè)序結(jié)果分析

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)國槐根、莖、葉3個(gè)不同器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別獲取了21835502、21762356和22037888個(gè)Clean Reads，GC含量分別為43.75%、43.96%和43.99%。且3個(gè)不同器官的Q30堿基百分比均在93.19%以上，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求（表1）。

表1 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總Table 1 Quality summary of sample sequencing data

2.1.2 差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)

利用Edge R軟件，以表達(dá)量差異倍數(shù)大于1和Padj≤ 0.005為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)國槐根、莖、葉3個(gè)不同器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)（圖1）。結(jié)果表明，根與葉中差異基因數(shù)最多，為52711條；根與莖次之，為51937條；莖與葉最少，為7193條。

圖1 國槐不同器官差異表達(dá)基因火山圖Fig. 1 Differential expression of genes in different organs of S. japonica

2.1.3 差異基因GO功能富集

GO (Gene Ontology) 數(shù)據(jù)庫包括生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三大生物學(xué)過程。本試驗(yàn)采用Cluster Profiler軟件對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，閾值為Padj< 0.05。

圖2分別為各比較組中差異基因的GO富集結(jié)果，在根vs.莖比較組中（圖2a），注釋到GO數(shù)據(jù)庫的差異基因數(shù)目為28755條，分屬于3009個(gè)生物學(xué)過程、684個(gè)細(xì)胞組分和1456個(gè)分子功能組分，主要顯著富集于代謝過程、蛋白質(zhì)代謝過程及高分子化合物等功能；在根vs. 葉比較組中（圖2b），注釋到GO數(shù)據(jù)庫的差異基因數(shù)目為29352條。分屬于3024個(gè)生物學(xué)過程、692個(gè)細(xì)胞組分和1462個(gè)分子功能組分中，主要顯著富集于蛋白質(zhì)代謝過程、膜的外在成分及四吡咯結(jié)合等功能；在莖vs. 葉比較組中（圖2c），注釋到GO數(shù)據(jù)庫的差異基因數(shù)目為4440條，分屬于2269個(gè)生物學(xué)過程、536個(gè)細(xì)胞組分和1019個(gè)分子功能組分中，主要顯著富集于代謝過程、膜部分及催化活性等功能。

圖2 GO 分類的顯著性富集圖Fig. 2 Significant enrichment plots of GO terms

2.1.4 差異基因KEGG功能分析

KEGG數(shù) 據(jù) 庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫，本研究以Padj< 0.05為閾值，進(jìn)行差異代謝通路富集分析。在根vs. 莖（圖3a）及根vs. 葉（圖3d）比較組中，分別有13961、14159條差異基因被注釋到了123個(gè)代謝通路，但均未被顯著富集。在莖vs. 葉（圖3g）比較組中，有2056條差異基因被分類到117個(gè)代謝通路中，其中糖酵解和糖質(zhì)新生、苯丙烷類生物合成及乙醛酸和二羧酸代謝的富集達(dá)到了顯著水平（P<0.01）。

進(jìn)一步分別對(duì)3個(gè)比較組中的上調(diào)及下調(diào)基因進(jìn)行KEGG富集，在根vs. 莖（圖3b，c）及根vs.葉（圖3e，f）比較組中，其上調(diào)基因在核糖體代謝通路中的富集達(dá)到了顯著水平（P< 0.01），其下調(diào)基因在光合作用，光合作用?天線蛋白等通路中的富集達(dá)到了顯著水平（P< 0.01）；在莖vs. 葉（圖3h，i）比較組中，其上調(diào)基因在苯丙烷生物合成、糖酵解/糖異生、戊糖磷酸途徑等代謝通路中的富集達(dá)到了顯著水平（P< 0.01），下調(diào)基因在光合作用、光合作用?天線蛋白、光合生物的固碳作用等通路中的富集達(dá)到了顯著水平（P< 0.01）。

圖3 KEGG pathways富集圖Fig. 3 Enrichment plots of KEGG pathways

2.2 國槐EST-SSR引物開發(fā)

2.2.1 不同組織轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的數(shù)量及分布

分別對(duì)國槐根、莖、葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝（表2）。結(jié)果表明，根的Unigene數(shù)最多，莖組織次之，葉組織最少。各組織轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果表明，莖組織中SSR位點(diǎn)數(shù)最多，葉組織次之，根組織最少。本研究中國槐的SSR位點(diǎn)類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均存在，其中單核苷酸重復(fù)占主導(dǎo)地位，說明國槐轉(zhuǎn)錄組中的SSR重復(fù)單元主要為單堿基重復(fù)。

表2 國槐SSR檢索結(jié)果Table 2 SSR search results of S. japonica

2.2.2 EST?SSR重復(fù)類型及頻率特征

分別對(duì)國槐根、莖、葉不同器官及全部樣本進(jìn)行SSR序列長度分析（圖4），結(jié)果表明，國槐不同組織及全部樣本的SSR序列長度在10～81 bp間變化，主要以10～22 bp短序列為主。分別占不同組織及全部樣本SSR總數(shù)的89.00%、90.06%、89.70%及90.17%，其中10 bp的SSR數(shù)量最多，分別占各自SSR總數(shù)的20.80%、18.05%、17.83%及20.05%，且主要以單核苷酸重復(fù)為主。

圖4 SSR序列長度分布Fig. 4 SSR sequence length distribution

進(jìn)一步對(duì)各器官中的重復(fù)單元及優(yōu)勢(shì)重復(fù)模序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表3～4），結(jié)果表明，國槐根、莖、葉及全部樣本SSR位點(diǎn)分別含有217、300、286、403種重復(fù)單元。在根、莖、葉不同器官的轉(zhuǎn)錄組中，莖檢測(cè)到的重復(fù)模序種類最多，根最少。對(duì)各樣本SSR重復(fù)模序的類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，各樣本中單、二、三核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢(shì)模序均為A/T、 AT/TA和AAG/CTT，四、五、六核苷酸重復(fù)模序雖種類較多，但數(shù)量相對(duì)較少。

表3 國槐SSR重復(fù)類型統(tǒng)計(jì)Table 3 SSR repeat type statistic of S. japonica

表4 SSR優(yōu)勢(shì)重復(fù)模序比例Table 4 Proportion of preponderant repeat motif of SSR

2.2.3 國槐EST?SSR引物有效性及多態(tài)性

依照國槐3個(gè)不同器官的轉(zhuǎn)錄組混合拼接數(shù)據(jù)，依據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)引物，隨機(jī)挑選出符合條件的30對(duì)，以11個(gè)國槐無性系的DNA為模板，進(jìn)行有效性驗(yàn)證。共篩選出9對(duì)多態(tài)性引物（表5～6），多態(tài)性帶數(shù)百分比均值為 79.63%，各引物的多態(tài)信息指數(shù)（PIC）值在0.1528～0.6719之間變化，Shannon's 信息指數(shù)（I）在0.1849～1.1384之間變化，變幅均較大，說明篩選出的引物多態(tài)性較高，但不同SSR位點(diǎn)的遺傳信息存在較大差異，部分引物的擴(kuò)增結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 引物YJ-23聚丙烯酰胺電泳圖Fig. 5 Primer YJ?23 polyacrylamide electrophoretogram

圖6 引物YJ-27聚丙烯酰胺電泳圖Fig. 6 Primer YJ?27 polyacrylamide electrophoretogram

表5 9對(duì)多態(tài)引物基本信息Table 5 Information of 9 pairs of polymorphic primers

表6 9對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果Table 6 Amplification results of 9 pairs of primers

2.2.4 不同國槐無性系的進(jìn)化樹及指紋圖譜

依據(jù)各引物的擴(kuò)增結(jié)果，將條帶轉(zhuǎn)化為二元數(shù)據(jù)（0/1 矩陣），運(yùn)用DPS 7.05 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（UPGMA 類平均法），計(jì)算各樣本間的遺傳距離矩陣并繪制11個(gè)不同國槐參試無性系進(jìn)的進(jìn)化樹，構(gòu)建指紋圖譜（圖7、表7），結(jié)果表明，本研究開發(fā)的9對(duì)EST?SSR引物可將全部參試樣本完全區(qū)分，當(dāng)遺傳距離為0.415時(shí)，可按遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近將全部參試樣本分為4類，第Ⅰ類包括CK、A?4、A?6、A?8、A?1 第Ⅱ類包括A?3、A?9、A?5、A?7；第Ⅲ類包括 A?2 ；第Ⅳ類為 A?10，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了引物的可靠性。

表7 11個(gè)國槐無性系的EST-SSR指紋圖譜Table 7 SSR fingerprint of 11 S. japonica clones

圖7 國槐11個(gè)不同無性系SSR聚類分析Fig. 7 SSR cluster analysis diagram of 11 different clones of S. japonica

3 結(jié)論與討論

Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，作為第二代測(cè)序技術(shù)，兼具高通量、效率高及成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來已在生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[19]。本研究利用 Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)國槐根、莖及葉3個(gè)不同器官進(jìn)行了無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組對(duì)比結(jié)果表明，根vs. 莖比較組中的差異基因數(shù)最多，根vs. 葉次之，莖vs. 葉最少，這與王芬[20]等得出的福鼎大白種茶（Camellia sinensis）樹根與葉相比差異基因數(shù)最多的結(jié)論不同，原因可能是由于樹種或篩選閾值設(shè)定不同導(dǎo)致的。進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG注釋，結(jié)果表明，根vs. 莖、根vs. 葉、莖vs. 葉3個(gè)比較組中差異基因的GO及KEGG數(shù)據(jù)庫注釋率均值分別為57.59%和27.44%，二者雖均有大量差異基因未獲得注釋，但GO數(shù)據(jù)庫的注釋率遠(yuǎn)高于KEGG數(shù)據(jù)庫，這與劉洪旭等[21]、葛國平等[22]眾多學(xué)者的研究結(jié)果相似，原因可能與物種及數(shù)據(jù)庫的側(cè)重點(diǎn)不同有關(guān)，同時(shí)測(cè)序時(shí)參考基因組的有無也可能對(duì)后續(xù)分析的產(chǎn)生影響[23]。

本研究表明，在國槐根、莖、葉器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)兩兩對(duì)比中，每個(gè)比較組的差異基因GO富集情況大體一致。在生物學(xué)過程中，主要參與代謝過程，說明國槐不同器官均存在大量基因參與次生代謝過程；在細(xì)胞組分過程中，主要構(gòu)成細(xì)胞的組成；在分子功能過程中，多數(shù)具有結(jié)合功能和催化活性等功能，說明植物生長后期酶活催化能力增強(qiáng)。這與林艷玲等[24]在對(duì)人參（Panax ginseng）根、莖、葉轉(zhuǎn)錄組兩兩對(duì)比，得出的差異基因GO富集結(jié)果相似，表明不同植物在生長發(fā)育過程中均受到多種途徑及多種代謝產(chǎn)物的影響。同時(shí)在莖vs. 葉比較組中，有10個(gè)被KEGG數(shù)據(jù)庫顯著富集的代謝通路，但在根vs莖和根vs葉比較組中，均未有代謝通路被顯著富集，原因可能是由于植物DNA在不同組織中的轉(zhuǎn)錄過程存在差異，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同或表達(dá)量存在差異[25]，也可能是由于植物部分組織中的DNA存在甲基化現(xiàn)象，從而抑制了某些功能基因的表達(dá)[26]，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。進(jìn)一步對(duì)各比較組中上下調(diào)基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果表明，從宏觀上來看，上調(diào)基因主要在核糖體代謝通路中被顯著富集，下調(diào)基因主要在光合作用、光合作用?天線蛋白等代謝通路中被顯著富集，原因可能是由于上調(diào)基因主要參與細(xì)胞分裂及組織分化等過程[27]，而由于根位于地下部分，莖葉位于地上部分，與光合作用相關(guān)的基因不升反降，原因可能是由于這些基因的表達(dá)量負(fù)相關(guān)于基因功能[28]。同時(shí)，結(jié)果表明，在根vs. 莖、根vs. 葉2個(gè)比較組中上調(diào)基因數(shù)量遠(yuǎn)多于下調(diào)基因，原因可能是由于此時(shí)植物的光形態(tài)建成已趨于完成，且葉綠素含量已趨于穩(wěn)定，而此時(shí)期為國槐速生期，與植物生長相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)較為活躍，進(jìn)而使得細(xì)胞分裂加快，同時(shí)也提高了植物組織分化的速度[29?31]。各組織轉(zhuǎn)錄組的SSR分析表明，莖組織的SSR位點(diǎn)數(shù)最多，葉組織次之，根組織最少，這與石登紅等[32]在對(duì)野地瓜（Ficus tikoua）不同組織轉(zhuǎn)錄組的研究中得出的莖SSR位點(diǎn)數(shù)多于葉片的結(jié)論一致；對(duì)各樣本SSR重復(fù)模序的類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，各樣本三核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢(shì)模序均為AAG/CTT，這與眾多國內(nèi)外學(xué)者[33?35]對(duì)雙子葉植物SSR模序分析所得結(jié)論一致，也進(jìn)一步說明了AAG/CTT 微衛(wèi)星基序在雙子葉植物中的廣譜性及重要性。進(jìn)一步利用國槐3個(gè)不同器官的轉(zhuǎn)錄組混拼數(shù)據(jù)，按照嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行EST-SSR引物的開發(fā)，結(jié)果表明，在隨機(jī)挑選的30對(duì)引物中，有24對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰的目的條帶，進(jìn)一步的驗(yàn)證表明，其中有9對(duì)多態(tài)性引物，多態(tài)性條帶比例高于Sun等[14]開發(fā)的國槐SRAP引物，但SRAP標(biāo)記也具有其自身優(yōu)勢(shì)，與SSR分子標(biāo)記相比其擴(kuò)增范圍包括了DNA的內(nèi)含子區(qū)域，擴(kuò)增范圍更加廣泛，但SSR分子標(biāo)記具有更高的種間通用性及精確性[36]，未來將2種技術(shù)結(jié)合進(jìn)行遺傳多樣性分析，不失為解決引物資源缺乏、提高分子育種效率的良策。

本研究對(duì)國槐的根、莖、葉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)3個(gè)不同器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩對(duì)比，對(duì)差異基因進(jìn)行了功能注釋及代謝通路分析，同時(shí)對(duì)不同樣本的EST?SSR進(jìn)行了分析，開發(fā)出了9對(duì)多態(tài)性高的EST?SSR引物，同時(shí)構(gòu)建了11個(gè)不同國槐無性系的進(jìn)化樹及指紋圖譜，為今后國槐的遺傳資源開發(fā)及品種鑒定等工作提供了重要的分子依據(jù)，同時(shí)為今后類似的研究提供了參考。