松材線蟲侵染不同抗性松樹后寄生適應(yīng)性與致病力的變化

應(yīng)晨希 胡龍嬌 劉紅斌 吳小芹

（1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同中心，林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是松樹萎蔫?。ㄒ喾Q松材線蟲病）的病原[1]。自1982年我國南京首次報(bào)道松材線蟲病發(fā)生以來[2]，該病在38年的時(shí)間里，已先后在我國18省666個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生為害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)破壞，松材線蟲已成為我國最具危險(xiǎn)性的林業(yè)有害生物之一。近年來，松材線蟲病在我國的傳播危害呈現(xiàn)一些新特點(diǎn)：發(fā)生區(qū)突破了傳統(tǒng)理論的北部適生界線；傳播媒介蟲種增加；有研究表明，目前除松墨天牛外林間的其他天?？疲–erambycidae）昆蟲以及象甲科（Curculionidae）、吉丁科（Buprestidae）、叩甲科 （Elateridae）和小蠹科 （Scolytidae）等昆蟲也可攜帶松材線蟲[3?7]；感病樹種由過去的黑松（Pinus thunbergii）、赤松（P. densiflora）和馬尾松（P. massoniana）等，擴(kuò)展到黃山松 (P. taiwanensis)、云南松 (P. yunnanensis)、油 松（P. tabuliformis）、華山松（P. armandii）、紅松（P. koraiensis）和落葉松（Larixspp.）等[8?12]。松材線蟲病在我國遠(yuǎn)距離傳播的主要方式是人為傳播含松材線蟲和媒介昆蟲的病木及其制品。

研究表明，在自然界中病原物和昆蟲均存在寄主轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，它們的寄生適應(yīng)性將直接影響其種群的定殖、擴(kuò)張繼而影響病蟲害的發(fā)生[13]。有學(xué)者對(duì)B型煙粉虱（Bemisia tabaci）在寄主轉(zhuǎn)換時(shí)的適應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱的寄主適應(yīng)度變化符合一般的寄主轉(zhuǎn)移規(guī)律，即嗜性相對(duì)較強(qiáng)的過渡寄主可以刺激煙粉虱提高寄主適應(yīng)性[14?16]。而棉蚜（Aphis gossypii）從棉花種群被轉(zhuǎn)到甜瓜（Cucumis melo）上時(shí)，其壽命比轉(zhuǎn)到原寄主棉花的成蚜壽命明顯降低[17]。目前松材線蟲的寄主范圍不斷擴(kuò)大，其由媒介昆蟲攜帶從病死木傳播到健康木、從病害發(fā)生區(qū)傳播到新地區(qū)的過程中都有可能在不同抗性松樹之間發(fā)生轉(zhuǎn)換，但目前松材線蟲在傳播過程中寄主發(fā)生變化時(shí)的寄生適應(yīng)性和致病力變化狀況尚不清楚。

馬尾松作為我國本土重要的松屬樹種，多年來其抗性種源和抗病單株選擇在江蘇和安徽等省陸續(xù)被進(jìn)行研究，目前已篩選出了一批高抗馬尾松，在安徽初步建立了抗松材線蟲病候選個(gè)體保存園[18]。目前對(duì)于松材線蟲病的寄主范圍和寄主抗性等問題已有相關(guān)研究[19?21]，而松材線蟲在寄主體內(nèi)的種群增殖力是關(guān)乎松樹是否發(fā)病的關(guān)鍵因子，但關(guān)于松材線蟲在不同抗性松樹體內(nèi)的種群繁殖參數(shù)等與寄生適應(yīng)性相關(guān)因素的研究還少見報(bào)道。同時(shí)，在松材線蟲相關(guān)致病機(jī)理的研究中，對(duì)于纖維素酶在松材線蟲病發(fā)生中的作用研究報(bào)道較多[22?23]，但對(duì)于在不同抗性寄主體內(nèi)松材線蟲分泌的纖維素酶活性變化狀況不甚明確。為此，本研究選取不同致病力的松材線蟲通過多次接種不同抗性的寄主松樹，對(duì)松材線蟲侵染松樹后的種群繁殖力、致病力變化及其分泌纖維素酶的能力進(jìn)行研究，以期闡明松材線蟲種群的寄生適應(yīng)性及其在寄主變換時(shí)種群繁殖力和致病力的變化規(guī)律，為進(jìn)一步揭示松材線蟲種群的入侵定殖及流行為害機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其培養(yǎng)

供試松材線蟲為經(jīng)前期致病力測定表現(xiàn)為強(qiáng)毒的蟲株ZJ和弱毒的蟲株YW4，分別分離自浙江富陽馬尾松和云南德宏思茅松（P.kesiyavar.langbianensis）[24]，保存于江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。松材線蟲生長適溫為 25 ℃[19]，通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板在 25 ℃ 無光照條件下培養(yǎng)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）4～5 d，菌絲長滿 PDA 后接入供試松材線蟲，相同的條件下培養(yǎng) 5～6 d，待灰葡萄孢菌絲被吃光后采用貝爾曼漏斗法收集松材線蟲[25]。將收集的線蟲懸浮液 4000 r/min，離心 3 min，棄去上清；再用雙蒸水（ddH2O）清洗 3 次，4000 r/min 離心，每次 3 min，備用。

供試植物為3～4年生生長狀況基本一致的健康黑松幼樹、火炬松（P. taeda）幼樹和高抗馬尾松幼樹（由江蘇省林科院抗性馬尾松種源篩選獲得，種源編號(hào)為GD5），培養(yǎng)于南京林業(yè)大學(xué)溫室，培養(yǎng)溫度控制在28～32 ℃，相對(duì)濕度控制在65%～75%。

1.2 松材線蟲接種松樹及致病力測定

將2種不同毒力的松材線蟲制備成蟲懸液（3000 條/mL），以皮接法對(duì)3種松幼樹進(jìn)行人工接種，用無菌刀片在近地約10 cm的莖干處割開樹皮深達(dá)木質(zhì)部，用鑷子取無菌棉球塞入，每株接1 mL的蟲懸液，以接種1 mL ddH2O的松樹作為對(duì)照，封口膜做成漏斗狀將切口及棉球包裹住，保證蟲液不滲漏。每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)。根據(jù)針葉顏色變化程度，將松樹的感病程度劃分為以下5個(gè)等級(jí)：0級(jí)：所有針葉均健康呈綠色；Ⅰ級(jí)：小部分針葉開始變黃；Ⅱ級(jí)：一半左右的針葉變黃或萎蔫；Ⅲ級(jí)：大部分針葉褐變萎蔫；Ⅳ級(jí)：所有針葉失綠枯萎。在接種后的第15天、30 天和45 天統(tǒng)計(jì)松苗的發(fā)病率和感病指數(shù)，發(fā)病率和感病指數(shù)按如下公式進(jìn)行計(jì)算[26]：

當(dāng)任一處理中松幼樹全部死亡或感病指數(shù)不變時(shí)，將所有供試松幼樹按不同處理分別剪成細(xì)條收集，通過貝爾曼漏斗法分離線蟲并洗凈，接種至灰葡萄孢培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁再收集，方法同1.1所述。將收集到的線蟲按照上述方法再次接種于健康的松幼樹并測定相關(guān)指標(biāo)。重復(fù)該過程即為第3次接種。

1.3 松材線蟲寄生適應(yīng)性與雌雄性比的檢測

采用Braach[27]提出的相關(guān)寄生適應(yīng)性（RHS）系數(shù)分析不同毒力松材線蟲在3種松樹中的定殖狀況。

2種不同毒力松材線蟲（強(qiáng)毒蟲株ZJ和弱毒蟲株YW4）與3種不同抗性松幼樹（抗性馬尾松、火炬松、黑松）共組成6組接種處理，接種后獲得的線蟲按上述順序分別命名為ZJ?Ma、ZJ?Huo、ZJ?Hei和YW4?Ma、YW4?Huo、YW4?Hei。在上述的3次接種試驗(yàn)中，當(dāng)任一處理中松幼樹全部死亡或感病指數(shù)不變時(shí)，通過貝爾曼漏斗法分離松苗中的線蟲，并在蔡司顯微鏡Axio Lab A1下統(tǒng)計(jì)每次接種試驗(yàn)中的松材線蟲數(shù)量（區(qū)分死亡松幼樹中的線蟲數(shù)量）和雌雄蟲性比（記錄接種前線蟲性比）。根據(jù)RHS系數(shù)公式計(jì)算3次接種試驗(yàn)中各處理的RHS系數(shù)：

1.4 松材線蟲分泌的纖維素酶活性測定

1.4.1 松材線蟲胞外纖維素酶的提取

提取從不同抗性松幼樹上分離得到的線蟲分泌的纖維素酶，參考Kojima等[22]的方法稍作修改，將線蟲收集后調(diào)整濃度為5×104/mL，于20 ℃下不時(shí)震蕩搖動(dòng)， 48 h后收集上清液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取DNS 10.0 g，加400 mL去離子水使之懸浮，邊混合邊慢慢加入150 mL氫氧化鈉溶液（每300 mL去離子水中含32.0 g氫氧化鈉）。將該懸浮液置于50 ℃水浴中溫?zé)嶂脸吻澹粩嗷旌舷戮従徏尤?00 g酒石酸甲鈉至溶液中，用去離子水稀釋至1000 mL，貯存于棕色瓶中。

取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖溶液分別加入0、1、2、3、4、5號(hào)管中，每管用去離子水補(bǔ)足體積為2.0 mL，然后加DNS溶液，沸水浴10 min，補(bǔ)足體積為14 mL，以0號(hào)管為空白對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)（CARY100，Agilent）測定490 nm吸光度，在Excel中求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及R2值。

1.4.3 纖維素酶活性的測定

參考王琳等[28]的DNS法和公式進(jìn)行測定。反應(yīng)體系為1 mL 含1%羧甲基纖維素鈉（CMC，國藥集團(tuán)，上海）的醋酸鈉緩沖液和1 mL酶液，經(jīng)50 ℃反應(yīng)30 min，加2 mL DNS溶液，置沸水浴15 min，冷卻后加入去離子水使得總體積為14 mL，使用紫外分光光度計(jì)測定490 nm吸光度。以每分鐘每毫升酶液產(chǎn)生1微克葡萄糖的量作為1個(gè)活性單位，將測的葡萄糖含量值（C）代入公式E=C×1000/30×1，求得纖維素酶活性值（E）。

1.5 接種后不同松材線蟲種群致病力的比較測定

選取2年生健康且生長狀況基本一致的黑松幼樹為致病力測定的接種對(duì)象，對(duì)經(jīng)過3次循環(huán)接種不同抗性松幼樹上分離的松材線蟲進(jìn)行致病力統(tǒng)一測定比較。接種量為3000條/株，各處理分別包含8個(gè)重復(fù)，接種后每5 d觀察并記錄松樹發(fā)病情況，直至供試松幼樹全部死亡或感病指數(shù)不再變化。以持續(xù)在灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)的強(qiáng)毒和弱毒蟲株（即出發(fā)種群，分別命名為ZJ?CK和YW4?CK）接種黑松幼樹作為對(duì)照。接種方法和指標(biāo)測定同1.2所述。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel計(jì)算重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并使用SPSS Statistics 17.0軟件（IBM中國公司，北京），采用Duncan多重比較法檢驗(yàn)各處理的差異顯著性，顯著性檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲接種不同抗性松幼樹后致病力的變化

將松材線蟲強(qiáng)毒蟲株ZJ和弱毒蟲株YW4分別接種不同抗性松幼樹（高抗馬尾松、火炬松及黑松），通過接種—分離培養(yǎng)—再接種的方式，持續(xù)進(jìn)行3輪接種試驗(yàn)，比較3次試驗(yàn)中不同松樹的發(fā)病率和感病指數(shù)的變化。3次循壞接種強(qiáng)弱毒松材線蟲的抗性馬尾松幼樹的發(fā)病率和感病指數(shù)變化見表1。在第1輪及第2輪接種中，松材線蟲弱毒蟲株YW4對(duì)抗性馬尾松幼樹未表現(xiàn)出致病性，即在持續(xù)觀察的45 d中未出現(xiàn)發(fā)病癥狀；接種強(qiáng)毒蟲株ZJ后抗性馬尾松幼樹的發(fā)病率也僅有16.7%，感病指數(shù)僅為8.3。在第3輪接種中，各松材線蟲蟲株對(duì)抗性馬尾松幼樹的致病力均有較大程度的提高，其中接種弱毒蟲株YW4的抗性馬尾松的發(fā)病率為50%，感病指數(shù)為16.7，而接種強(qiáng)毒蟲株ZJ的抗性馬尾松幼樹發(fā)病率為50%，感病指數(shù)達(dá)到37.5?？剐择R尾松幼樹對(duì)松材線蟲的抗性隨著松材線蟲接種次數(shù)的增加呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。這些結(jié)果表明無論是強(qiáng)毒還是弱毒松材線蟲，通過反復(fù)侵染抗性松樹幼樹其致病力均得到了明顯增強(qiáng)。

表1 抗性馬尾松幼樹循環(huán)接種松材線蟲強(qiáng)毒和弱毒蟲株的發(fā)病情況Table 1 The incidence of resistant P. massoniana seedlings after cyclic inoculation with high virulent and low virulent strains of B. xylophilus

松材線蟲循環(huán)接種火炬松幼樹后致病力的變化趨勢(shì)見表2。在3次接種中，強(qiáng)毒蟲株ZJ和弱毒蟲株YW4對(duì)火炬松幼樹的致病力隨著接種次數(shù)的增加而增強(qiáng)。接種強(qiáng)毒蟲株ZJ的火炬松幼樹的發(fā)病率從第1次接種的66.7%增長至第2次接種的83.3%，最后增長至第3次接種的100%，感病指數(shù)由37.5增長至66.7，最后增長至100；接種弱毒蟲株YW4的火炬松幼樹的發(fā)病率從16.7%增長至33.3%，最后增長至66.7%，感病指數(shù)由8.30增長至20.1，最后增長至52.08。該結(jié)果表明，隨著接種次數(shù)的增加火炬松幼樹也對(duì)松材線蟲的抗性呈明顯下降趨勢(shì)。

表2 火炬松幼樹循環(huán)接種松材線蟲強(qiáng)毒和弱毒蟲株的發(fā)病情況Table 2 The incidence of P. taeda seedlings after cyclic inoculation with high virulent and low virulent strains of B. xylophilus

松材線蟲循環(huán)接種黑松幼樹后致病力的變化趨勢(shì)見表3。對(duì)易感寄主黑松，松材線蟲強(qiáng)毒蟲株ZJ在第1輪測定中已表現(xiàn)出較高致病力，黑松幼樹發(fā)病率為75%，感病指數(shù)為66.7，在第3輪測定中感病指數(shù)上升為100。接種弱毒蟲株YW4的黑松幼樹的發(fā)病率由第1次測定的33.3%上升為第3次測定的83.3%，感病指數(shù)由20.1上升為81.25，YW4致病力提高尤為顯著。

表3 黑松幼樹循環(huán)接種松材線蟲強(qiáng)毒和弱毒蟲株的發(fā)病情況Table 3 The incidence of P. thunbergii seedlings after cyclic inoculation with high virulent and low virulent strains of B. xylophilus

綜合比較不同毒力松材線蟲循環(huán)接種3種不同抗性松幼樹的結(jié)果可知，寄主松樹無論接種的是強(qiáng)毒蟲株還是弱毒蟲株，其感病程度高低的順序依次為黑松種群>火炬松種群>抗性馬尾松種群，且經(jīng)過循環(huán)接種3次后測定的發(fā)病率和感病指數(shù)均顯示出較大程度的提升。表明無論強(qiáng)毒或弱毒的松材線蟲經(jīng)多次侵染寄主松樹后，其致病力會(huì)明顯增強(qiáng)。

2.2 松材線蟲接種不同抗性幼樹后種群寄生適應(yīng)性的變化

對(duì)松材線蟲侵染不同松幼樹1～3輪后各個(gè)種群的寄生適應(yīng)性RHS系數(shù)測定結(jié)果見表4。在第1輪的接種試驗(yàn)中，從抗性馬尾松幼樹中僅分離得到極少量強(qiáng)毒蟲株ZJ和弱毒蟲株YW4，且接種YW4的抗性馬尾松幼樹死亡率為0，因此來自抗性馬尾松幼樹的ZJ種群（ZJ?Ma）RHS系數(shù)為0.72，而YW4種群（YW4?Ma）的RHS系數(shù)為0。RHS系數(shù)最高的為來自易感寄主黑松幼樹的ZJ種群（ZJ?Hei），RHS值為9.6；弱毒蟲株YW4侵染不同松幼樹后各種群的RHS系數(shù)均較低，其中最高值為4.5，是來自黑松幼樹的YW4種群（YW4?Hei）。

表4 循環(huán)侵染不同抗性松幼樹過程中松材線蟲種群RHS系數(shù)Table 4 The RHS coefficient of B. xylophilus populations during cyclic infection with different resistant pine seedlings

在第3輪測定中，強(qiáng)毒蟲株ZJ和弱毒蟲株YW4在抗性馬尾松幼樹中的RHS系數(shù)均有上升，其中ZJ?Ma種群的RHS系數(shù)達(dá)到10.5，已高于第1次測定中接種黑松幼樹的ZJ?Hei種群的最高值；同時(shí)，弱毒蟲株YW4?Ma種群的RHS系數(shù)達(dá)到3.8，已明顯高于前2次測定中的YW4?Ma（0）和YW4?Huo的種群（0.4），說明YW4?Ma種群經(jīng)多次接種高抗性寄主后寄生適應(yīng)性明顯增強(qiáng)。在第3次測定中，松材線蟲RHS系數(shù)最高仍為接種黑松幼樹的ZJ?Hei種群，達(dá)到21.6，約達(dá)到第1次測定值的2倍，而來自黑松幼樹的弱毒YW4?Hei種群的RHS系數(shù)為14.1，約達(dá)到第1次試驗(yàn)中測定值的3倍。

2.3 松材線蟲接種不同抗性幼樹后種群性比的變化

松材線蟲強(qiáng)毒蟲株ZJ和弱毒蟲株YW4在每次接種前的雌雄性比均為2.2～2.4，雌蟲數(shù)量較多，有利于繁殖。將線蟲循環(huán)接種于不同抗性松樹1～3次后，統(tǒng)計(jì)分離自寄主體內(nèi)的松材線蟲種群的雌雄性比，結(jié)果如圖1。在第1輪測定結(jié)果中，雌雄性比小于1的種群有3個(gè)，分別為ZJ?Ma種群、YW4?Ma種群和YW4?Huo種群；性比為1的種群有1個(gè)，為ZJ?Huo種群；雌雄性比大于1的種群有2個(gè)，是ZJ?Hei種群和YW4?Hei種群。說明松材線蟲在第1次侵染抗性馬尾松幼樹中雄成蟲數(shù)量大于雌成蟲，而在易感寄主黑松幼樹中強(qiáng)毒和弱毒蟲株的雌成蟲明顯增多，這暗示，松材線蟲在易感松樹中適應(yīng)性和繁殖力較強(qiáng)從而導(dǎo)致松樹發(fā)病快，發(fā)病程度重。

圖1 循環(huán)侵染不同抗性松幼樹過程中松材線蟲種群性比的變化Fig. 1 Variation of population sex ratio of B. xylophilus during cyclic infection with different resistant pine seedlings

在第3輪侵染寄主測定中，松材線蟲種群的雌雄性比有一定程度的上升，除了YW4?Huo種群為0.98小于1之外，其余5個(gè)松材線蟲種群的雌雄性比均高于1，即循環(huán)侵染寄主后松材線蟲多數(shù)種群中雌蟲所占比例增加，進(jìn)一步表明循環(huán)侵染可以提高松材線蟲種群的寄生適應(yīng)性。ZJ?Hei種群的雌雄性比在3次測定中結(jié)果基本保持一致，可見易感黑松幼樹是其適宜的寄主，在該寄主環(huán)境下松材線蟲種群擴(kuò)繁順利。這也說明，當(dāng)松材線蟲種群在寄主體內(nèi)適應(yīng)性較好時(shí)，種群性比趨于穩(wěn)定。

2.4 松材線蟲接種不同抗性幼樹后纖維素酶活性的比較

為測定不同抗性松幼樹上松材線蟲纖維素酶活性，首先進(jìn)行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，經(jīng)計(jì)算所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算公式為：y=1.5213x+0.0319。相關(guān)系數(shù)R2=0.9984。之后對(duì)來自不同抗性松幼樹上松材線蟲分泌的纖維素酶活性測定的結(jié)果見圖2。

比較強(qiáng)弱毒松材線蟲多次接種不同抗性松幼樹后其分泌的纖維素酶的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒蟲株群體的纖維素酶活性依次為ZJ?Ma >ZJ?Hei >ZJ?Huo，均高于弱毒蟲株；而弱毒蟲株YW4的纖維素酶活性依次為YW4?Hei> YW4?Ma>YW4?Huo，但第3次接種后變化為YW4?Ma> YW4?Hei> YW4?Huo。循環(huán)侵染不同抗性寄主不同程度地增加了松材線蟲種群的纖維素酶活力，其中松材線蟲ZJ?Ma和YW4?Ma種群的纖維素酶活力均出現(xiàn)顯著上升，ZJ?Huo、YW4?Huo、ZJ?Hei、YW4?Hei種群的纖維素酶活力上升差異不顯著（圖2）。由此可見，循環(huán)侵染高抗性寄主對(duì)松材線蟲種群纖維素酶活力的增強(qiáng)效應(yīng)較大。

圖2 循環(huán)侵染不同抗性松幼樹過程中松材線蟲纖維素酶活性的比較Fig. 2 Comparison of the cellulose activity of B. xylophilus during cyclic infection with different resistant pine seedlings

2.5 循環(huán)侵染不同抗性松幼樹后松材線蟲種群致病力的比較

將經(jīng)不同抗性松幼樹體內(nèi)增殖后的松材線蟲6個(gè)種群與對(duì)照（出發(fā)種群ZJ?CK和YW4?CK）在2年生黑松幼樹上進(jìn)行致病力的比較測定（表5）。結(jié)果表明，作為對(duì)照的松材線蟲強(qiáng)、弱毒蟲株出現(xiàn)第1株病死植株的時(shí)間分別為第21天和第33天，而在經(jīng)循環(huán)多次接種不同抗性松幼樹后的不同種群中，出現(xiàn)第1株病死植株的時(shí)間均不同程度的縮短，其中發(fā)病最快的為來自經(jīng)抗性松幼樹接種的ZJ?Ma種群和ZJ?Huo種群，接種松幼樹后第15天即出現(xiàn)病死植株；發(fā)病最慢的為YW4?Huo種群和YW4?Hei種群，接種黑松幼樹后第21天出現(xiàn)病死植株，但也比原始出發(fā)蟲株提前12 d發(fā)病。同時(shí)，接種ZJ?Ma種群的松幼樹全部死亡的歷期最短，為21 d，其發(fā)病率為100%，感病指數(shù)為100，可見該種群致病力最強(qiáng)。接種YW4?Hei種群的發(fā)病松幼樹死亡歷期較長為36 d，但這一數(shù)值也低于接種原蟲株YW4?CK（45 d，松幼樹未全部死亡，發(fā)病率和感病指數(shù)不再變化）。在發(fā)病率和感病指數(shù)方面，弱毒蟲株YW4接種各個(gè)不同松幼樹種群的變化數(shù)值較為明顯，其中經(jīng)接種抗性松幼樹的YW4?Ma和YW4?Huo種群的發(fā)病率為87.5%，已達(dá)到強(qiáng)毒蟲株的水平。接種易感松幼樹的YW4?Hei種群的發(fā)病率為75%，感病指數(shù)為77.5，也成為中等致病力的蟲株。這些結(jié)果表明松材線蟲強(qiáng)、弱毒蟲株均可以通過多次侵染松幼樹的方式提高其致病力，且循環(huán)侵染高抗松幼樹后，線蟲致病力提高更為顯著。

表5 循環(huán)接種后不同松材線蟲種群的致病力比較Table 5 The comparison of pathogenicity of different B. xylophilus populations after cyclic inoculation

3 結(jié)論與討論

有研究表明，不同寄主和地理來源的松材線蟲其致病力存在差異[29?30]。而這種差異與松材線蟲侵染不同抗性松樹后而產(chǎn)生的獲得致病力是否有關(guān)并不清楚。在以往有關(guān)寄主適應(yīng)性的研究中，有人認(rèn)為病原從嗜好性較強(qiáng)的寄主轉(zhuǎn)移到嗜好性相對(duì)較弱的寄主后，其寄主適應(yīng)性會(huì)迅速下降[31?32]。本研究中將松材線蟲強(qiáng)毒蟲株和弱毒蟲株接種到不同抗性寄主松幼樹中，通過接種—分離—再接種的不斷侵染寄主的循環(huán)方式，發(fā)現(xiàn)松材線蟲強(qiáng)毒和弱毒蟲株對(duì)不同松幼樹的致病力均得到了不同程度的提高，這種致病力的提升在弱毒蟲株侵染抗性松樹上的表現(xiàn)更為明顯。同時(shí)，強(qiáng)毒松材線蟲在侵染抗性寄主馬尾松幼樹后致病力的增幅顯著大于其侵染易感松幼樹黑松。另外，無論是松材線蟲強(qiáng)毒或弱毒蟲株，其在接種抗性馬尾松幼樹后引起的發(fā)病率和感病指數(shù)均低于其在火炬松幼樹中引起的發(fā)病率和感病指數(shù)，說明本試驗(yàn)采用的抗性馬尾松幼樹的抗性較高，對(duì)于抗松材線蟲病具有較明顯的效果。

采用種群相關(guān)寄生適應(yīng)性（RHS）系數(shù)來描述不同種群對(duì)不同寄主的致病力差異能較好地反映線蟲種群和寄主之間的關(guān)系。張治宇等在測定松材線蟲和擬松材線蟲致病性時(shí)，表明線蟲群體的致病力差異明顯，RHS系數(shù)變化較大[33?34]。本研究通過對(duì)多次接種不同抗性松幼樹中的線蟲RHS系數(shù)的測定，較好的反映了松材線蟲種群在寄主體內(nèi)適應(yīng)性的變化。在第1次接種測定中，各松材線蟲種群的RHS系數(shù)在0～10之間，其中，在抗性馬尾松幼樹體內(nèi)的弱毒蟲株種群不能正常繁殖，線蟲數(shù)量很少；而隨著反復(fù)的侵染，線蟲的寄生適應(yīng)性得到提高，在第3次接種測定中，線蟲所有種群的RHS系數(shù)均處于上升趨勢(shì)，而在抗性馬尾松幼樹體內(nèi)的強(qiáng)毒蟲株ZJ?Ma種群的RHS系數(shù)甚至超過了第1次測定中在感病寄主黑松幼樹體內(nèi)蟲株的水平。該結(jié)果表明，無論是強(qiáng)毒還是弱毒松材線蟲，通過反復(fù)侵染寄主，其種群適應(yīng)性均可得到較大的提高，最終都可在高抗寄主中生存并增殖。可以推測，如果繼續(xù)侵染不同抗性寄主，松材線蟲弱毒蟲株的致病力會(huì)得到增強(qiáng)，同時(shí)原本高抗的松樹種群也可能因線蟲種群適應(yīng)性的提高而抗性下降。

有研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)條件可以調(diào)節(jié)生物種群性比[35]。如馬尾松松毛蟲幼蟲在饑餓條件下，性比下降為0. 67，對(duì)照性比為0. 95，表明在饑餓條件下存在明顯的雄性化傾向，而試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)雌蟲食量大，資源需求閾值較高，饑餓導(dǎo)致雌蟲死亡比例明顯偏高[36]。本研究對(duì)接種不同抗性松幼樹松材線蟲種群雌雄性比的變化進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在易感黑松幼樹體內(nèi)，松材線蟲種群適應(yīng)性較好，種群雌雄性比也保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。而在高抗寄主幼樹體內(nèi)松材線蟲種群適應(yīng)性較低（第1次接種）時(shí)，雌雄性比值小于1，種群中雄成蟲數(shù)量相對(duì)較多；隨著線蟲種群適應(yīng)性的提高（第3次接種），雌雄性比值也隨之升高，比值大于1，說明通過不斷侵染寄主其雌蟲數(shù)量逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，種群繁殖量也隨之增長。因此，當(dāng)線蟲種群適應(yīng)性提高時(shí)，其種群繁殖力增強(qiáng)從而使高抗松幼樹抗病力下降。在對(duì)松材線蟲相關(guān)基因的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默與松材線蟲生存相關(guān)基因如半胱氨酸蛋白酶基因（Bx-cpls）及自噬相關(guān)基因（Bx-ATG1及BxATG8）后，松樹體內(nèi)的線蟲數(shù)量相應(yīng)減少，且松樹的發(fā)病推遲。由此說明線蟲的繁殖力減弱相應(yīng)地會(huì)降低其致病力[37?38]。

松材線蟲種群分泌的纖維素酶一直被認(rèn)為是松材線蟲可能的致病因素之一，相關(guān)研究也反映了纖維素酶在發(fā)病過程中所起的一定作用，即松材線蟲侵染松樹過程中，可通過分泌纖維素酶軟化松樹細(xì)胞壁，從而有利于其侵染[39?43]。本研究比較了來自不同抗性松幼樹上松材線蟲纖維素酶活性的變化。結(jié)果表明，強(qiáng)毒蟲株的纖維素酶活性整體高于弱毒蟲株，接種高抗寄主幼樹的松材線蟲種群的纖維素酶活力明顯高于接種低抗寄主幼樹的松材線蟲種群；循環(huán)接種后，接種不同抗性寄主幼樹的松材線蟲種群的纖維素酶活力隨著接種次數(shù)的增加均有一定程度的提高。這暗示在多次接種過程中，松材線蟲致病力的增強(qiáng)與松材線蟲分泌的纖維素酶活提高有一定關(guān)系。

上述研究表明松材線蟲通過不斷侵染松幼樹，其在寄主松幼樹體內(nèi)的種群性比會(huì)不斷上升并趨于穩(wěn)定，線蟲種群持續(xù)增殖，分泌的纖維素酶活力增強(qiáng)，從而表現(xiàn)出對(duì)寄主適生性和致病力的提高。同時(shí)，在自然環(huán)境中，松材線蟲的寄主發(fā)生轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象是存在的。因此推測，當(dāng)線蟲從易感寄主由媒介昆蟲轉(zhuǎn)換至高抗寄主時(shí)，其種群適應(yīng)性最初還不高，短期內(nèi)可能并不會(huì)對(duì)寄主產(chǎn)生嚴(yán)重影響，但如果這種情況持續(xù)發(fā)生，存活的線蟲種群的寄生適應(yīng)性就會(huì)不斷提高，導(dǎo)致線蟲致病力增強(qiáng)而最終成功侵染為害抗病的寄主種群。本研究結(jié)果有助于解釋在松材線蟲病傳入我國初期，大多數(shù)馬尾松是較抗病的而如今馬尾松普遍發(fā)病的現(xiàn)象。至于目前松材線蟲在我國的寄主范圍不斷擴(kuò)大是否與此有一定關(guān)聯(lián)尚待進(jìn)一步研究。

松材線蟲無論是強(qiáng)毒還是弱毒蟲株，均可通過不斷侵染松幼樹的方式提高其種群適應(yīng)性、雌雄性比和分泌的纖維素酶活性，進(jìn)而增強(qiáng)其致病力，且循環(huán)侵染高抗松幼樹的增強(qiáng)效應(yīng)更為顯著。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示松材線蟲病在我國的發(fā)生流行規(guī)律提供了重要的科學(xué)依據(jù)。