1株雞滑液囊支原體的分離鑒定與全基因組分析

許李鋒，賈晨宇，陳福再，方夢(mèng)園，劉孝丹，陳吉龍，李訓(xùn)良

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建省畜禽病原感染與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省-尼泊爾畜禽重大疫病防控聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

雞滑液囊支原體(，MS)屬于柔膜體綱支原體屬，直徑0.2～0.4 μm，以芽生方式或二分裂法繁殖，經(jīng)姬姆薩染色后可以更好地觀察其多形性，在電子顯微鏡下觀察呈圓形或梨形等；MS只有一個(gè)血清型，但不同基因型的菌株致病力卻存在差異，引起的癥狀也有所差異，部分菌株可能不產(chǎn)生或很少產(chǎn)生臨床癥狀。MS基因組的特點(diǎn)是G+C含量低，由于其有限的遺傳信息，支原體表達(dá)少量的細(xì)胞蛋白并且缺乏許多酶活性和代謝途徑。因此，它們的營養(yǎng)需求很復(fù)雜，許多營養(yǎng)素都依賴于宿主。MS主要引起雞等禽類的上呼吸道疾病、氣囊炎、滑膜炎、腱鞘炎和滑囊炎。MS感染與蛋殼頂端異常(EAA)有關(guān)，使蛋的品質(zhì)下降和質(zhì)量減輕，導(dǎo)致出現(xiàn)異常卵增多，蛋殼易脆等問題。MS感染在中國非常普遍，一年四季均可發(fā)生。MS既可以水平傳播也可以垂直傳播，對(duì)任何年齡的雞都可以造成感染。由于其感染隱蔽，不易根除，造成家禽生長(zhǎng)遲緩、飼料利用率下降等，是目前導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要因素。

為了減少因野生型MS菌株感染引起的疾病和經(jīng)濟(jì)損失，可以使用3種不同的措施用以預(yù)防和控制：雞場(chǎng)凈化，抗生素治療和預(yù)防接種。雞場(chǎng)凈化主要是檢測(cè)雞群MS的感染，通過淘汰患病雞群，培育無MS感染的種雞群。但由于中國禽業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)的規(guī)模和管理級(jí)別的不同，加之雞場(chǎng)凈化的成本高昂，很難建立和維護(hù)無MS感染的種雞群，因此這種方法采用較少。而抗生素的頻繁使用，不僅容易導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性，而且存在藥物殘留影響食品安全的風(fēng)險(xiǎn)。目前，市場(chǎng)上存在兩種預(yù)防MS的減毒活疫苗，分別是對(duì)溫度敏感的弱毒MS-H疫苗株和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)非依賴性MS1疫苗株。MS-H疫苗株目前已在全世界廣泛使用，有效地控制了MS感染，降低了雞群死亡率，延長(zhǎng)了產(chǎn)蛋期，提高了雞群產(chǎn)蛋量和飼料轉(zhuǎn)化率；MS1疫苗由Nobilis公司生產(chǎn)，目前，在該公司已經(jīng)找不到該疫苗的相關(guān)信息，該疫苗也未在我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部注冊(cè)。MS弱毒疫苗雖然可以減輕MS感染引起的臨床癥狀，提高雞的生產(chǎn)性能，但其也存在一些缺點(diǎn)，它只能應(yīng)用于無MS感染的雞場(chǎng)，這在很大程度上限制了其應(yīng)用。此外，MS弱毒疫苗具有水平傳播的風(fēng)險(xiǎn)，并可能在同一雞場(chǎng)的圈舍中相互傳播，導(dǎo)致未接種疫苗的禽感染MS?；蚬こ桃呙缫蚱浒踩愿摺⒁琢慨a(chǎn)、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成為未來MS疫苗研發(fā)方向，因此篩選具有良好免疫效果的抗原就成為了研制基因工程疫苗的關(guān)鍵因素。

目前，MS基因工程亞單位疫苗的研究還處于起步階段，因此需要依托大量基因組數(shù)據(jù)為疫苗免疫保護(hù)性抗原的篩選提供信息，然而對(duì)MS基因組測(cè)序分析的文章仍然較為缺乏。因此本文對(duì)分離獲得的福建雞滑液囊支原體菌株MS-FJ01進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，利用COG、GO 和KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了基因功能注釋和富集分析；與GenBank中公布的其他MS分離株的16S rRNA等基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析比對(duì)；對(duì)該菌株的耐藥基因、毒力基因等關(guān)鍵基因進(jìn)行分析。研究結(jié)果為該病原菌致病性相關(guān)分子機(jī)制的深入解析以及基因工程亞單位疫苗的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

病料來源于福州某雞場(chǎng)疑似感染MS的病雞腫脹跗關(guān)節(jié)腔內(nèi)容物；改良Frey氏液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基購自青島海博生物公司；0.45 μm過濾器購自Biosharp 公司；SPF雛雞購自廣東新興大華農(nóng)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；核酸 Marker、2×PCR Master Mix購自Biomed公司；慶大霉素、鏈霉素、林可霉素、泰樂菌素、替米考星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素購自芊守生物科技有限公司。

1.2 雞滑液囊支原體的分離

采集疑似感染MS病雞的關(guān)節(jié)液及內(nèi)容物，接種于改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，待菌液變?yōu)辄S色時(shí)，用0.45 μm過濾器過濾后按1∶10的比例重新接種到新的液體培養(yǎng)基，收取第2代菌液用于病原菌鑒定。

1.3 雞滑液囊支原體的鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)觀察 取分離的第2代菌液接種于改良Frey氏固體培養(yǎng)基上，并置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)7 d，于顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.3.2 菌體L型鑒定 菌體L型鑒定方法參照丁美娟2014年《雞滑液囊支原體的分離和鑒定研究》。

1.3.3 活菌計(jì)數(shù) 取15支裝有0.9 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基的EP管，在第1管中加入0. 1 mL第2代菌液，充分混勻后從第1管吸出0.1 mL液體加入第2管，再混勻，吸出0.1 mL加入第3管，依次類推，直到第15管。另取2支含1 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基的EP管作為對(duì)照，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，做3組重復(fù)。2周后觀察培養(yǎng)基顏色變化，并判定結(jié)果。

1.3.4 人工感染鑒定 取分離的第2代菌液0.5 mL，滴鼻點(diǎn)眼0.4 mL，腳墊內(nèi)注射0.1 mL接種于5日齡SPF雛雞，持續(xù)觀察雞的生長(zhǎng)及發(fā)病情況。

1.3.5 分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)GenBank中登錄的MS基因全序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，分別為MS-JD506-1：5′-CTTCTATGCTTAAACTTTCC-3′，MS-JD506-2：5′-TAAAGATATTACAACGACAT-3′，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小為506 bp。并根據(jù)文獻(xiàn)[15]合成目的片段大小為208 bp的一對(duì)引物，MS-208-F：5′-GAAGCAAAATAGTGATATCA-3′，MS-208-R：5′-GTC-GTCTCCGAAGTTAACAA-3′。用MS特異性引物PCR擴(kuò)增此分離株。采用20 μL PCR體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，無菌水8 μL，上下游引物各0.5 μL，菌液1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

參考Hannan推薦的微量稀釋法測(cè)定分離株MIC。

1.5 MS-FJ01總基因組的提取

取MS-FJ01菌液5 mL接種于含45 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基的離心管中，在37 ℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，在15 000 ×4 ℃條件下離心30 min 收集MS-FJ01沉淀物，超純水清洗1遍后，再次離心收集MS-FJ01沉淀物。參照OMEGA細(xì)菌基因組抽提試劑盒步驟提取MS-FJ01的總DNA，利用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。

1.6 MS-FJ01測(cè)序、組裝

使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性，將檢驗(yàn)合格的基因組DNA隨機(jī)打斷、消化、修復(fù)，之后使用0.45X的PB磁珠進(jìn)行二次篩選純化，獲得測(cè)序文庫。對(duì)文庫質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果達(dá)到要求后，使用PacBio Sequel Ⅱ 進(jìn)行文庫的測(cè)序，然后使用SMRT LINK 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并使用Illumina二代測(cè)序進(jìn)行補(bǔ)充和準(zhǔn)確性復(fù)核。

采用Microbial Assembly(smrtlink8)、HGAP4軟件(smrtlink8)和Canu(v1.6)軟件對(duì)純?nèi)鷶?shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行組裝，通過 Glimmer(v3.02)軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行基因模型預(yù)測(cè)。

1.7 基因功能的注釋

利用tRNAscan-SE(v2.0)，RNAmmer(v1.2)進(jìn)行細(xì)菌基因組的tRNA、rRNA的預(yù)測(cè)；使用trf409.legacylinux64軟件預(yù)測(cè)基因組中串聯(lián)重復(fù)序列(TRF)；利用MinCED(v0.3.2)對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用軟件IslandPath-DIOMB預(yù)測(cè)基因組的基因島；采用PhiSpy(v2.3)軟件預(yù)測(cè)基因組中的前噬菌體結(jié)構(gòu)；預(yù)測(cè)到的編碼序列利用NR(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db)、SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)、COG(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG)、KEGG(http://www.kegg.jp/orhttp://www.genome.jp/kegg/)、GO(http://www.geneontology.org)、CARD(http://arpcard.mcmaster.ca)、CAZy(http://www.cazy.org/)、PHI(http://www.phi-base.org/index.jsp)、VFDB(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)、TCDB(http://www.tcdb.org/)、RMS(http://rebase.neb.com/rebase/rebase)進(jìn)行比對(duì)，注釋功能基因。使用軟件EffectiveT3(v2.0.2)進(jìn)行T3SS效應(yīng)蛋白的注釋。

1.8 比較基因組學(xué)

在全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，將MS-FJ01的Eno和16S rRNA基因分別登錄NCBI，通過BLAST與GenBank中的已知序列比對(duì)，選取HN01、G3、A4、WVU1853等十幾株相似性高的MS相應(yīng)基因序列，利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。將MS-FJ01的基因信息與NCBI上已公布的15個(gè)完整菌株進(jìn)行比對(duì)。使用MUMmer軟件對(duì)MS-FJ01和中國流行株HN01和5-9基因組進(jìn)行共線性比較。

2 結(jié) 果

2.1 雞滑液囊支原體的分離鑒定

取過濾后的菌種接種于改良Frey氏固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后在顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)細(xì)小、光滑、致密的小菌落，表現(xiàn)為“煎蛋樣”，半凹陷于培養(yǎng)基內(nèi)(圖1)。菌體L型鑒定的結(jié)果顯示為陰性；活菌計(jì)數(shù)不低于10CCU·mL。

圖1 雞滑液囊支原體菌落圖Fig.1 Colony diagram of Mycoplasma synoviae in chicken

取過濾后的菌種攻毒SPF雛雞，25 d后可發(fā)現(xiàn)感染雞出現(xiàn)精神沉郁、跛行、癱瘓、膝關(guān)節(jié)發(fā)炎腫大、關(guān)節(jié)和氣囊內(nèi)有干酪樣沉積物等明顯的病變(圖2)。

圖2 雞滑液囊支原體攻毒至SPF雞后出現(xiàn)的病變Fig.2 Pathological changes of Mycoplasma synoviae in SPF Chickens

用MS特異性引物PCR擴(kuò)增此分離株，能擴(kuò)增出約506和208 bp的特異性片段(圖3)。通過以上各項(xiàng)鑒定結(jié)果表明，所分離的菌株符合MS特性。收集60～100 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，離心收集菌體沉淀物，并進(jìn)行凍干保存，送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏。所述的雞滑液囊支原體其分類命名為MS-FJ01，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC No.: M 2021210。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.本研究設(shè)計(jì)引物的鑒定結(jié)果；2.引用參考文獻(xiàn)[15]的引物鑒定結(jié)果M.DNA Marker; 1. The identification results of primers designed in this study; 2. The identification result of primers quoted from references [15]圖3 雞滑液囊支原體核酸電泳鑒定圖Fig.3 Electrophoretic identification of Mycoplasma synoviae in chicken

2.2 MS-FJ01對(duì)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

通過微量肉湯稀釋法，測(cè)得泰樂菌素、替米考星素等8種抗菌藥物對(duì)MS-FJ01的MIC。試驗(yàn)結(jié)果表明，MS-FJ01對(duì)氟喹諾酮類耐藥，而四環(huán)素和泰樂菌素對(duì)其則有較好的抑制作用。

2.3 MS-FJ01的基本信息

MS-FJ01總DNA提取濃度≥50 ng·μL，樣品純度：OD/OD=1.85，OD/OD=2.0。使用三代測(cè)序得到MS-FJ01的基因組全長(zhǎng)為795 381 bp，GC含量為28.39%，編碼基因704個(gè)，34個(gè) tRNA以及7個(gè)rRNA。MS-FJ01基因組的圈圖如圖4所示。

圈圖從外到內(nèi)第1圈為基因組大小；第2圈散在分布的點(diǎn)為限制性修飾酶分布情況；第3圈和第4圈分別為正鏈和負(fù)鏈的堿基修飾；第5圈和第6圈分別為正鏈和負(fù)鏈上的CDS；第7圈為tRNA和rRNA的分布；第8圈為GC-skew值，一般前導(dǎo)鏈GC-skew>0，后滯鏈GC-skew<0，也可以輔助判斷復(fù)制起點(diǎn)(累計(jì)偏移最小值)和終點(diǎn)(累計(jì)偏移最大值)，尤其對(duì)環(huán)狀基因組最為重要；最內(nèi)圈為GC含量，向外部分表示該區(qū)域的GC含量高于基因組的平均水平，向內(nèi)部分表示該區(qū)域的GC含量低于基因組的平均水平The first circle of the circle from outside to inside is genome size; The scattered points in the second circle are the distribution of restrictive modification enzymes. The third and fourth circles are the base modification of plus and minus chains respectively. The fifth and sixth circles are CDS on the positive and negative chains respectively; The seventh circle is the distribution of tRNA and rRNA. The eighth circle is GC-skew value, generally leading chain GC-skew>0, lag chain GC-skew<0, which can also assist in determining the starting point (minimum cumulative offset) and end point (maximum cumulative offset) of replication, especially for circular genomes. The innermost circle is GC content, with the outward part indicating that GC content in this region is higher than the average level of the genome, and the inward part indicating that GC content in this region is lower than the average level of the genome圖4 MS-FJ01基因組圈圖Fig.4 Genome circle of MS-FJ01

本研究預(yù)測(cè)TRF有79個(gè)，TRF的長(zhǎng)度變化范圍從1～500 bp不等，表現(xiàn)出種屬組成特異性，可作為物種的遺傳性狀、進(jìn)化關(guān)系的研究。預(yù)測(cè)CRISPR序列2個(gè)，CRISPR序列存在于許多細(xì)菌和古細(xì)菌中，其與CRISPR相關(guān)基因構(gòu)成CRISPR-Cas系統(tǒng)，目前的研究證明，該系統(tǒng)很可能是原核細(xì)菌抵御外來入侵者重要的防御系統(tǒng)。

基因島與多種生物功能相關(guān)，因此一直以來都是研究的熱點(diǎn)，本研究預(yù)測(cè)到3個(gè)基因島。前噬菌體序列的存在可能會(huì)允許一些細(xì)菌獲取抗生素抗性，增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，提高黏附力或使細(xì)菌成為致病菌，本研究預(yù)測(cè)出1個(gè)前噬菌體結(jié)構(gòu)。MS-FJ01全基因組數(shù)據(jù)已收錄GenBank，收錄號(hào)為CP079705。

2.4 基因功能注釋分析

為進(jìn)一步解析MS-FJ01基因組的功能，將其基因組序列在COG、GO和KEGG共3個(gè)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋。

2.4.1 COG數(shù)據(jù)庫注釋 COG數(shù)據(jù)庫按照基因功能分為25大類，每一個(gè)COG類別均由直系同源序列構(gòu)成。因此，通過序列相似性比對(duì)，可以將某個(gè)蛋白序列歸類于某一COG簇中，從而可以推測(cè)該序列的功能。作者將預(yù)測(cè)基因的蛋白序列比對(duì)到COG庫。如圖5所示，在MS-FJ01基因組中與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源相關(guān)的基因最多，有133個(gè)基因；與復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)的基因次之，有50個(gè)基因；與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和次生代謝產(chǎn)物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝相關(guān)的基因最少，各僅有1個(gè)基因；但仍有7個(gè)功能未知的基因。

C. 能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化；D. 細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂和染色體分區(qū)；E. 氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；F. 核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；G. 碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；H. 輔酶的運(yùn)輸和代謝；I. 脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；J. 翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；K. 轉(zhuǎn)錄；L. 復(fù)制、重組和修復(fù)；M. 細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；N. 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；O. 翻譯后修飾、蛋白質(zhì)更新和伴侶蛋白；P. 無機(jī)離子的運(yùn)輸與代謝；Q. 次生代謝產(chǎn)物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；R. 一般功能預(yù)測(cè)；S. 未知功能；T. 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U. 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；V. 防御機(jī)制；X. 噬菌體和轉(zhuǎn)座子C. Energy production and conversion; D. Cell cycle control. cell division, chromosome partitioning; E. Amino acid transport and metabolism; F. Nucleotide transport and metabolism; G. Carbohydrate transport and metabolism; H. Coenzyme transport and metabolism; I. Lipid transport and metabolism; J. Translation, ribosomal structure and biogenesis; K. Transcription; L. Replication, recombination and repair; M. Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N. Cell motility; O. Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P. Inorganic ion transport and metabolism; Q. Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R. General function prediction only; S. Function unknown; T. Signal transduction mechanisms; U. Intracellular trafficking secretion, and vesicular transport; V. Defense mechanisms; X. Mobilome: prophages, transposons圖5 MS-FJ01基因組COG注釋統(tǒng)計(jì)Fig.5 COG annotation statistics of MS-FJ01 genome

2.4.2 GO數(shù)據(jù)庫注釋 GO數(shù)據(jù)庫將蛋白序列分為3大類：生物過程、分子功能和細(xì)胞組分，分別用來描述基因編碼的產(chǎn)物所參與的生物過程、所具有的分子功能及所處的細(xì)胞環(huán)境。如圖6所示，MS-FJ01基因組中，在生物過程大類中，與代謝過程(基因數(shù) 249)和細(xì)胞過程(基因數(shù) 237)相關(guān)的基因最多。在細(xì)胞組分大類中，被注釋最多的是細(xì)胞(基因數(shù) 170)、細(xì)胞部件(基因數(shù) 170)、膜(基因數(shù) 95)以及膜部件(基因數(shù) 91)。在分子功能途徑大類中，與催化活性(基因數(shù) 219)和結(jié)合(基因數(shù) 228)相關(guān)的基因最多。

圖6 MS-FJ01基因組GO注釋統(tǒng)計(jì)Fig.6 GO annotation statistics of MS-FJ01 genome

2.4.3 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 KEGG是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物和化合物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫；它整合了基因組信息、化合物和小分子信息以及生化反應(yīng)系統(tǒng)等方面數(shù)據(jù)，主要包括代謝通路、藥物、疾病、功能模型、基因序列及基因組等信息。如圖7所示，MS-FJ01基因主要分為細(xì)胞過程、環(huán)境信息加工、遺傳信息加工、人類疾病、代謝及機(jī)體系統(tǒng)6大分類。其中，在新陳代謝和遺傳信息處理中占的基因比例較高。在這些類別中，基因富集最多的類別是代謝(基因數(shù)占比34.8%)，主要包括碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝以及核苷酸代謝等。遺傳信息加工富集的基因次之(基因數(shù)占比29.1%)，其中翻譯(基因數(shù) 78)富集的基因最多。六大類中富集最少的是機(jī)體系統(tǒng)，僅占全部富集基因數(shù)的1.6%。

圖7 MS-FJ01基因組KEGG注釋統(tǒng)計(jì)Fig.7 KEGG annotation statistics of MS-FJ01 genome

2.5 特定功能注釋

將只整合某一類功能相關(guān)的數(shù)據(jù)庫和注釋方法劃分到特定功能注釋模塊，該模塊包含耐藥基因(CARD)、碳水化合物相關(guān)酶(CAZy)、病原與宿主互作(PHI)、致病菌毒力因子(VFDB)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類(TCDB)、限制性修飾系統(tǒng)(RMS)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白(T3SS)。

2.5.1 MS-FJ01基因組CARD數(shù)據(jù)庫注釋 CARD(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)是目前使用最為廣泛的細(xì)菌耐藥基因數(shù)據(jù)庫。因此使用CARD數(shù)據(jù)庫做耐藥基因注釋，本研究在CARD庫注釋到了40個(gè)細(xì)菌耐藥基因。其中對(duì)四環(huán)素具有抗性的基因最多(基因數(shù)7)，此外，基因具有多抗生素耐藥性。詳見表1。

2.5.2 MS-FJ01基因組CAZy數(shù)據(jù)庫注釋 CAZy全稱為Carbohydrate-Active enZYmes Database，碳水化合物酶相關(guān)的專業(yè)數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容包括能催化碳水化合物降解、修飾、以及生物合成的相關(guān)酶系家族。其包含6個(gè)主要分類：輔助氧化還原酶(auxiliary activities，AAs)、糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，GTs)、多糖裂解酶(polysaccharide lyases, PLs)和糖類酯解酶(carbohydrate esterases, CEs)。本研究中，在CAZy庫共注釋到4個(gè)基因，其中，3個(gè)為糖苷水解酶，1個(gè)為糖類酯解酶。

2.5.3 MS-FJ01基因組PHI數(shù)據(jù)庫注釋 PHI全稱為Pathogen Host Interactions Database，病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫， PHI是目前現(xiàn)醫(yī)療、農(nóng)業(yè)真菌和卵菌候選靶向位點(diǎn)的重要在線資源。在 PHI 數(shù)據(jù)庫中注釋到了136個(gè)與宿主互作的基因，97個(gè)基因在突變后會(huì)導(dǎo)致病原菌致病性的減弱或喪失，15個(gè)基因在突變后會(huì)使得病原菌的致病性增強(qiáng)。

2.5.4 MS-FJ01基因組VFDB數(shù)據(jù)庫注釋 VFDB數(shù)據(jù)庫全稱為Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，用于專門研究致病細(xì)菌、衣原體和支原體致病因子的數(shù)據(jù)庫。在本研究MS-FJ01共有47個(gè)基因與細(xì)菌毒力相關(guān)，其中，序列相似度在40%以上的基因只有3個(gè)，分別為膽堿激酶、脂酸蛋白連接酶和ABC(ATP結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運(yùn)體CylA，其他基因序列相似度均低于40%。另外,作者還挖掘到DnaK、PDHA、PDHB、Eno、GapA、PK、FBA、NOX等多個(gè)與細(xì)菌黏附相關(guān)的基因。

2.5.5 MS-FJ01基因組TCDB數(shù)據(jù)庫注釋 TCDB是對(duì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Membrane Transport Protein)進(jìn)行分類的一個(gè)數(shù)據(jù)庫，它制定了一套轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類系統(tǒng)(Transporter Classification), 簡(jiǎn)稱TC System，TC系統(tǒng)除了對(duì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行分類，同時(shí)還提供了其功能和進(jìn)化信息。本研究共注釋到106個(gè)與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因，其中,與初級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)的基因最多(基因數(shù) 64)。

2.5.6 MS-FJ01基因組RMS數(shù)據(jù)庫注釋 RMS主要由限制性內(nèi)切酶(restriction enzymes)及甲基化轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)兩部分所構(gòu)成。限制修飾系統(tǒng)按照組成功能上的差異主要分為基本的四種類型，分別是Type I systems、Type II systems、Type III systems、Type IV systems。該系統(tǒng)對(duì)自身基因組某些Motif的修飾可能會(huì)對(duì)其基因表達(dá)及生長(zhǎng)代謝調(diào)控有非常重要的作用。REBASE包含大量限制修飾系統(tǒng)的分類、識(shí)別修飾、識(shí)別切割位點(diǎn)等信息。在本研究,中Ⅲ型甲基化轉(zhuǎn)移酶(基因數(shù) 8)和Ⅲ型限制性內(nèi)切酶(基因數(shù) 7)注釋的基因數(shù)最多。

2.6 比較基因組學(xué)分析

2.6.1 進(jìn)化樹分析 MS的烯醇化酶(Eno)是一種重要的黏附相關(guān)因子，對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、定植和侵襲有著重要作用。因此作者使用MS的和16S rRNA基因的DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。參考菌株與MS-FJ01的16S rRNA序列構(gòu)建的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示，MS-FJ01與2020年分離的中國寧夏菌株5-9親緣關(guān)系最近，而與2018年分離的河南菌株HN01、韓國菌株G3、A4和模式MS菌株WVU1853等親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)，在基于的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中顯示出的結(jié)果也表明MS-FJ01與MS 5-9菌株親緣關(guān)系最近(圖8)。

A. MS-FJ01的16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹；B. MS-FJ01的Eno系統(tǒng)進(jìn)化樹A. 16S rRNA phylogenetic tree of MS-FJ01；B. Eno phylogenetic tree of MS-FJ01圖8 MS-FJ01的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of MS-FJ01

2.6.2 MS-FJ01與MS菌株基因組基本信息對(duì)比 本研究將MS-FJ01相關(guān)基因信息與GenBank中已公布的15個(gè)MS菌株的完整基因組序列進(jìn)行比較分析，該菌株基因信息與已公布的MS參考菌株基本相似，只有編碼基因的數(shù)目少于其他菌株。

2.6.3 基因組共線性分析 MS-FJ01與中國流行株HN01和5-9基因組進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)基因組序列之間的共線性關(guān)系及結(jié)構(gòu)變異情況，由圖9可知MS-FJ01與5-9基因組共線性程度明顯高于HN01基因組；相比于5-9基因組，HN01存在較多基因倒置、缺失和分布不同。

A.MS-FJ01和HN01基因組共線性分析；B. MS-FJ01和5-9基因組共線性分析A.Genomic collinearity analysis of MS-FJ01 and HN01；B. Genomic collinearity analysis of MS-FJ01 and 5-9圖9 MS-FJ01共線性分析Fig.9 MS-FJ01 collinearity analysis

3 討 論

本研究通過三代聯(lián)合二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)MS-FJ01進(jìn)行了全基因組精細(xì)測(cè)序，并對(duì)該基因組的基本特征進(jìn)行了分析。MS目前已有15個(gè)完整基因組被公布，但相同物種的不同菌株在基因和蛋白結(jié)構(gòu)上仍存在差異。本研究將MS-FJ01基因組預(yù)測(cè)基因的蛋白序列比對(duì)到NR數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)所有蛋白序列匹配的同源蛋白相似度最高分別是支原體屬(53.9%)和雞滑液囊支原體 (34.54%)。之后又將預(yù)測(cè)基因的蛋白序列比對(duì)到SwissProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)相似度最高的物種仍然是雞滑液囊支原體(29.6%)，剩余的相似性大部分都屬于支原體屬，包括肺炎支原體、生殖支原體等。

作者在MS-FJ01基因組的編碼基因中預(yù)測(cè)到長(zhǎng)度為1 010 bp的煙酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和長(zhǎng)度為674 bp的3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶，Yongjun等在韓國分離株的基因組中發(fā)現(xiàn)這兩種編碼序列僅存在于NAD非依賴性MS的基因組中。Yagihashi等在日本發(fā)現(xiàn)的菌株也具有NAD非依賴性。MS-FJ01是否具有NAD非依賴性還有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，如果MS-FJ01等中國菌株具有NAD非依賴性，那么NAD非依賴性則可能是亞洲MS菌株的共同特征，這一發(fā)現(xiàn)不僅可以降低MS的培養(yǎng)成本，還可以引起人們對(duì)亞洲MS菌株的研究興趣在CARD數(shù)據(jù)庫，作者預(yù)測(cè)到、等多個(gè)氟喹諾酮類耐藥基因，MIC結(jié)果也驗(yàn)證了MS-FJ01對(duì)其耐藥，這可能是由于臨床上常使用大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類抗生素對(duì)MS感染進(jìn)行治療，從而導(dǎo)致MS對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥性嚴(yán)重。此外，作者注釋到MsbA具有多藥耐藥性，MsbA是一種多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源物，屬于含有三磷酸腺苷結(jié)合盒的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，該盒也被稱為核苷酸結(jié)合域(NBD)。MsbA是革蘭陰性菌中必不可少的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將脂質(zhì)A和脂多糖從細(xì)胞質(zhì)小葉運(yùn)輸?shù)絻?nèi)膜的周質(zhì)小葉，而脂質(zhì)A是細(xì)菌細(xì)胞外膜的主要成分，也是唯一對(duì)細(xì)胞活力至關(guān)重要的細(xì)菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以作為新抗生素的可行靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。

在CAZy庫，作者注釋到4個(gè)基因，其中,3個(gè)為糖苷水解酶，研究表明，糖苷水解酶通過水解糖苷鍵，釋放糖類產(chǎn)物，用于生物體代謝途徑。糖基轉(zhuǎn)移酶參與細(xì)胞內(nèi)多種生命活動(dòng)，將體內(nèi)活性物質(zhì)的單糖部分轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖和核酸中形成糖基化。這些酶在生物體的次級(jí)代謝活動(dòng)中起著不可替代的作用。

支原體的侵襲性由表面的黏附素、輔助蛋白、莢膜多糖、侵襲性酶和生物被膜介導(dǎo)；而黏附是支原體感染過程中的初始步驟，也是確保它們?cè)谒拗黧w內(nèi)定植和傳播的重要步驟。

在MS-FJ01基因組中挖掘出、、、、、、、等與黏附素相關(guān)的基因，這些都與其他支原體相同，如肺炎支原體、牛支原體、豬肺炎支原體、雞毒支原體等。在VFDB數(shù)據(jù)庫，注釋到相似度最高的33號(hào)基因(基因相似性41.67%)編碼磷酸膽堿，磷酸膽堿可以作為HepI或HepIII的末端部分摻入并修飾脂多糖，通過與上皮細(xì)胞上的血小板激活因子 (PAF) 受體結(jié)合而增加了對(duì)抗菌肽(人導(dǎo)管素LL-37)的抗性與黏附性；由于磷酸膽堿表達(dá)是相位可變的，因此可以促進(jìn)逃避抗原特異性宿主免疫防御，并在不同宿主微環(huán)境中定植。

4 結(jié) 論

從福州雞場(chǎng)疑似感染雞滑液囊支原體的病雞中分離到一株福建雞滑液囊支原體菌株MS-FJ01，通過三代聯(lián)合二代測(cè)序技術(shù)對(duì)MS-FJ01進(jìn)行全基因組測(cè)序，經(jīng)過拼接后得到細(xì)菌基因組完成圖，測(cè)序結(jié)果顯示MS-FJ01全長(zhǎng)為795 381 bp，GC含量為28.39%；預(yù)測(cè)編碼基因數(shù)為704個(gè)，GC含量為28.64%；共鑒定出34個(gè)tRNA和7個(gè)rRNA；通過數(shù)據(jù)庫對(duì)組裝基因進(jìn)行COG、GO和KEGG富集及分析，其中，在COG數(shù)據(jù)庫注釋到476個(gè)基因，GO數(shù)據(jù)庫注釋到382個(gè)基因，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到425個(gè)基因。在抗生素抗性基因中發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥基因MsbA可能成為新抗生素的潛在靶點(diǎn)；在毒力基因中發(fā)掘到多個(gè)與黏附相關(guān)的基因，其在MS入侵宿主中可能有著至關(guān)重要的作用；對(duì)這些基因的注釋將有助于全面認(rèn)識(shí)MS致病相關(guān)基因及其與宿主互作過程中的致病性。