金黃色葡萄球菌在生物被膜態(tài)與浮游態(tài)的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

毛彥妮，常佳偉，李 娜，王 鑫，康馨勻，馬 強(qiáng)，馬 靚，王桂琴

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

生物被膜是引起細(xì)菌持續(xù)感染和慢性傷口感染的重要原因，細(xì)菌形成生物被膜后通常能夠抵抗宿主的免疫反應(yīng)，相比于浮游態(tài)菌，其對抗生素、殺生物劑的耐受性更高。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是人類皮膚的共生菌，可通過感染傷口并蔓延至植入裝置，形成生物被膜。研究表明，葡萄球菌形成生物被膜后使治療更加困難。

尋找新的和有效的抗生物被膜手段將有助于對抗金黃色葡萄球菌的感染。本研究比較了生物被膜態(tài)和浮游態(tài)生長條件下，金黃色葡萄球菌在形態(tài)和生理學(xué)上的不同以及兩種狀態(tài)下表達(dá)差異顯著的基因，通過對差異表達(dá)基因的功能和信號通路富集的研究，以期了解生物被膜菌的高持久性和高抗性，為進(jìn)一步深入探究金黃色葡萄球菌的耐藥性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)菌株、試劑及儀器

本研究使用的的金黃色葡萄球菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離純化，保存于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25923)購自中國藥品與生物制品鑒定所；MHB肉湯和TSB肉湯購自北京陸橋技術(shù)有限公司；抗菌藥物購自中國藥品與生物制品鑒定所；細(xì)菌RNA提取試劑購自TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購自諾唯贊公司；熒光定量PCR儀購自德國Jena公司；Simpli Nano超微量分光光度計(jì)購自美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1 浮游態(tài)細(xì)菌培養(yǎng) 試驗(yàn)菌株接入MHB肉湯中于37 ℃下以210 r·min振蕩過夜培養(yǎng)，離心(10 min，12 000 r·min)收集浮游態(tài)細(xì)菌。

1.2.2 生物被膜態(tài)細(xì)菌培養(yǎng) 根據(jù)Yooh等報(bào)道的培養(yǎng)皿法培養(yǎng)靜態(tài)的生物被膜。將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌株培養(yǎng)物稀釋至1×10cfu·mL， 接種到添加了葡萄糖的新鮮TSB肉湯培養(yǎng)基中，于96孔板中培養(yǎng)生物被膜。離心收集被膜態(tài)菌用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 生物被膜態(tài)菌觀察分析 采用結(jié)晶紫染色半定量法檢測金黃色葡萄球菌生物被膜，37 ℃培養(yǎng)生物被膜8、24、48、72、96 h后，棄掉浮游菌，用0.1 mol·L磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)沖洗3次，4 ℃ 使用戊二醛固定，經(jīng)結(jié)晶紫染色后，使用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡(SEM)對生物被膜進(jìn)行觀察。

1.2.4 金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的敏感性試驗(yàn) 采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測定9種抗菌藥物對32株金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)和浮游態(tài)的最低抑菌濃度(MIC)。首先將梯度稀釋的不同濃度抗菌藥物按照每孔100 μL加到96孔板中，將濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏纳锉荒B(tài)以及浮游態(tài)的金黃色葡萄球菌菌液稀釋100倍后分別取100 μL接種到不同藥物濃度的孔中。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以MHB肉湯作為陰性對照，ATCC25923作為質(zhì)控菌株。置于37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判定參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 文庫構(gòu)建及測序 文庫構(gòu)建及RNA-seq測序委托北京諾禾致源科技有限公司完成。首先，通過加入帶有oligo(DT)的磁珠于總RNA中富集帶有poly-A尾的mRNA，然后通過片段化緩沖液進(jìn)行片段化，隨后使用試劑盒合成雙鏈cDNA。對合成的cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，并在3′末端加上一個(gè)A堿基。根據(jù)Illumina配對末端樣品制備試劑盒的說明書，制備RNA-seq文庫并測序。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每種生長條件下分別提取3份RNA樣本。

1.2.7 測序數(shù)據(jù)的處理與分析 測序后，使用軟件SeqPrep對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。質(zhì)控完成后再使用軟件HISAT2將原始數(shù)據(jù)置于NCBI上進(jìn)行比對，獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝和表達(dá)量計(jì)算等的mapped reads，比對完成后對轉(zhuǎn)錄組測序的比對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估。

1.2.8 表達(dá)量差異分析及GO、KEGG富集分析 為了確定差異表達(dá)基因的功能，使用檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具(STRING)進(jìn)行了GO和KEGG通路的富集分析。并用UniProt信息庫確定未被STRING鑒定的蛋白質(zhì)的功能。

1.2.9 RT-qPCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)，選擇10個(gè)生物被膜形成相關(guān)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。使用Primer premier 5設(shè)計(jì)引物并用NCBI Primer-BLAST對引物特異性進(jìn)行評價(jià)，挑選出合格的引物進(jìn)行試驗(yàn)(表1)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用諾唯贊的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用SYBR Green I Real-Time PCR試劑盒進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以16S rRNA為內(nèi)參基因，ddHO為陰性對照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 RT-qPCR引物信息

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2法計(jì)算生物被膜態(tài)和浮游態(tài)金黃色葡萄球菌 mRNA的表達(dá)量。其中△△Ct=[Ct(處理組目的基因)-Ct(處理組內(nèi)參基因)]-[Ct(對照組目的基因)-Ct(對照組內(nèi)參基因)]。使用one-way ANOVA進(jìn)行差異分析，≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程的觀察

光學(xué)顯微鏡觀察金黃色葡萄球菌生物被膜的形成過程。如圖1所示，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)晶紫染色后的生物被膜，可見表面云絮樣、團(tuán)塊樣。8～72 h隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，表面云絮樣物質(zhì)逐漸緊密，聚集黏附形成小菌落，雜亂無章，逐步遍布整個(gè)觀察視野(圖1A～D)。培養(yǎng)8 h后，生物膜已初具規(guī)模，但數(shù)量較少；24 h后，玻片上形成了厚厚且緊密的生物被膜，層層堆集。此后，生物被膜開始分散，96 h時(shí)生物被膜結(jié)構(gòu)開始疏散，玻片上形成的生物膜結(jié)構(gòu)較為稀松(如圖1E)。

A～E. 培養(yǎng)時(shí)間分別為8、24、48、72、96 hA-E. Culture time are 8, 24, 48, 72, 96 h, respectively圖1 光學(xué)顯微鏡下金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程(100×)Fig.1 The biofilm formation process of S.aureus under optical microscope(100×)

掃描電鏡觀察金黃色葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)。掃描電鏡能更直觀地展現(xiàn)金黃色生物被膜形成過程的結(jié)構(gòu)變化。如圖2所示，8～72 h時(shí)生物被膜菌胞外基質(zhì)更加黏稠、濃密，膜內(nèi)金黃色葡萄球菌更加聚集(圖2A～D)。96 h時(shí)，細(xì)菌生物被膜立體結(jié)構(gòu)被破壞，緊密的結(jié)構(gòu)變的稀松，零散的游離菌聚集形成小型團(tuán)狀。生物被膜內(nèi)細(xì)胞開始凹陷形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2E)。

A～E. 培養(yǎng)時(shí)間分別為8、24、48、72、96 hA-E. Culture time are 8, 24, 48, 72, 96 h, respectively圖2 掃描電鏡下金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程(3 000×)Fig.2 The biofilm formation process of S.aureus under SEM(3 000×)

2.2 金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)和浮游態(tài)對抗菌藥物敏感性

金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)和浮游態(tài)對抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，菌株形成生物被膜后，膜內(nèi)細(xì)菌在胞外聚合物的屏障作用保護(hù)下，其抗藥性較游離態(tài)菌增加，最高增加4 096倍，最低增加8倍。

本文對某規(guī)模化豬場長白豬、大白豬、長大二元豬的第一、二、三胎的妊娠期、總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、產(chǎn)健仔數(shù)、仔豬初生窩重等繁殖指標(biāo)進(jìn)行整理，并采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，旨在為豬場下一步的選種、選配及提高母豬的繁殖性能提供可靠的理論依據(jù)，同時(shí)為其他豬場提供方法參考。

表2 32株金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)與浮游態(tài)對9種抗菌藥物的耐藥情況

2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估與比對統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)中的測序質(zhì)量評價(jià)和對比統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)匯總?cè)绫?所示。每個(gè)樣本中有97%以上的重復(fù)比對率，數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。剔除低質(zhì)量片段后組裝到試驗(yàn)組轉(zhuǎn)錄組中，組成轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)錄組序列上的標(biāo)記數(shù)分別為18 190 880、16 375 516、19 683 816、20 619 370、 16 578 378和19 221 314 bp，分別占文庫的97.95%、98.03%、98.03%、98.12%、98.16%和97.88%。記錄序列大小相同的unigenes的數(shù)量，得到unigenes的長度。這些結(jié)果證明了本研究中組裝的unigenes是高質(zhì)量的。

表3 總讀取數(shù)和與參考基因組對應(yīng)的總讀取百分比

圖3為生物被膜態(tài)菌和浮游態(tài)菌的轉(zhuǎn)錄本讀數(shù)密度。如圖所示，生物被膜態(tài)菌的lg(FPKM+1)在0～4內(nèi)表達(dá)值較低，而在相同范圍內(nèi)，浮游態(tài)具有更多的表達(dá)基因。而且，浮游態(tài)的lg(FPKM+1)在3～4有大多數(shù)讀數(shù)偏向，因此浮游態(tài)具有較高的基因表達(dá)水平?？傮w而言，兩種樣品類型之間大約90%的基因表達(dá)水平相似。

圖3 各樣本類型表達(dá)量分布密度圖Fig.3 Density graph showing the distribution of expression levels for each sample type

圖4為顯示浮游態(tài)菌和生物被膜態(tài)菌基因關(guān)系的散點(diǎn)圖。如圖所示，兩樣本之間的基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。兩樣本類型之間差異最大的上調(diào)或下調(diào)的離群值即為目標(biāo)基因。

圖4 浮游態(tài)和生物被膜態(tài)菌FPKM散點(diǎn)圖Fig.4 Scatter plot of the FPKM reads for both the planktonic and biofilm state bacteria

2.4 金黃色葡萄球菌生物被膜態(tài)和浮游態(tài)全基因表達(dá)分析

從cDNA文庫中，生物被膜態(tài)和浮游態(tài)分別獲得了2 499個(gè)和2 494個(gè)測序讀數(shù)。有37個(gè)基因僅在生物被膜態(tài)表達(dá)，32個(gè)僅在浮游態(tài)表達(dá)。如圖5A所示，重疊區(qū)域中的2 462個(gè)基因?yàn)閮煞N狀態(tài)下細(xì)菌均可轉(zhuǎn)錄的基因。為了進(jìn)行后續(xù)分析，僅考慮倍數(shù)變化大于2的基因，與浮游態(tài)菌相比，生物被膜態(tài)菌中顯著差異表達(dá)的基因共1 512個(gè)，其中，760個(gè)(50.26%)基因轉(zhuǎn)錄水平升高，而752個(gè)(49.74%)基因轉(zhuǎn)錄水平降低(圖5B)。

A. 基因表達(dá)維恩圖；B. 差異表達(dá)基因火山圖。有顯著性差異表達(dá)的基因用紅色點(diǎn)(上調(diào))和綠色點(diǎn)(下調(diào))表示，無顯著性差異表達(dá)的基因用藍(lán)色點(diǎn)表示A. Venn diagram of gene expression; B. Volcanic map of differentially expressed genes. Significantly differentially expressed genes are represented by red dots (up-regulated) and green dots (down-regulated), while not significantly differentially expressed genes are represented by blue dots圖5 基因表達(dá)水平比對圖Fig.5 Gene expression level comparison chart

2.5 差異表達(dá)基因的GO分析

從GO功能分析結(jié)果中列舉了部分功能條目，并選取了最顯著的條目繪制分類餅狀圖(圖6)。在篩選的功能條目中，有5個(gè)生物過程，3個(gè)細(xì)胞組成和7個(gè)分子功能發(fā)生變化，生物過程的分類結(jié)果表明，參與細(xì)胞過程和代謝過程的基因最多，分別占差異表達(dá)基因的28.72%和17.83%。細(xì)胞組分分類結(jié)果中，細(xì)胞實(shí)體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)組分分別占差異表達(dá)基因的49.98%和37.09%。分子功能分類結(jié)果中，結(jié)合和催化功能蛋白基因分別占差異表達(dá)基因的41.59%和27.83%。

圖6 GO富集圖Fig.6 GO enrichment pie chart

2.6 KEGG富集分析

KEGG分析結(jié)果顯示，有20條途徑顯著富集，如圖7所示，與代謝相關(guān)的通路顯著富集(<0.05)。其次為氨基酸的生物合成和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路。

圖7 差異表達(dá)基因KEGG富集散點(diǎn)圖Fig.7 KEGG enrichment scatter plot of differentially expressed genes

2.7 差異顯著基因表達(dá)分析

表4列出了生物被膜菌中轉(zhuǎn)錄上調(diào)和下調(diào)最多的10個(gè)基因。在轉(zhuǎn)錄水平下降的基因中，與編碼核糖體蛋白相關(guān)的基因?yàn)?、和，與葡萄糖代謝途徑相關(guān)的基因有SAOUHSC_01802、SAOUHSC_01064、、、、、和。而轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的基因主要包括生物被膜形成相關(guān)，如結(jié)合因子 ()、編碼相關(guān)轉(zhuǎn)移蛋白的基因、SAOUHSC_01028、、SAOUHSC_00315、1、以及SAOUHSC_02864等。

表4 差異表達(dá)基因列表

2.8 與金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關(guān)的關(guān)鍵基因的RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq鑒定的基因表達(dá)譜，選擇10個(gè)與生物被膜形成相關(guān)的主要基因，以16S rRNA為內(nèi)參基因，用RT-qPCR方法對其相對表達(dá)水平進(jìn)行定量。如圖8所示，RT-qPCR的表達(dá)趨勢與RNA-seq表達(dá)譜一致。其中、、、和基因表達(dá)上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別為5、4、8、2和5倍，而基因、、、和表達(dá)下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)分別為10、5、10、20和10倍。

圖8 各基因mRNA的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression of mRNA of each gene

3 討 論

細(xì)菌生物被膜是由多糖、DNA和/或蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜生物群落。除了幫助細(xì)菌在表面定植外，生物被膜還能增強(qiáng)對抗生素的耐藥性。金黃色葡萄球菌是引起人與動(dòng)物感染的重要致病菌之一，感染范圍從皮膚和黏膜的淺表感染到高侵襲性和潛在的致命感染。金黃色葡萄球菌感染，如心內(nèi)膜炎、骨髓炎和與留置醫(yī)療器械相關(guān)的感染，均與細(xì)菌生物被膜的形成有關(guān)。因此，對生物被膜態(tài)和浮游態(tài)細(xì)菌進(jìn)行生理和遺傳差異分析十分有意義。

本試驗(yàn)首先通過光學(xué)顯微鏡與掃描電鏡觀察金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程中的生理狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在生物被膜生長的過程中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，生物被膜聚集面積越來越大，其結(jié)構(gòu)也越來越緊密。在生物被膜態(tài)菌表面還可觀察到一些黏性物質(zhì)，可能是生物被膜形成過程中分泌的胞外多糖，可以促進(jìn)細(xì)胞間黏附與成熟生物被膜三維立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，有助于生物被膜態(tài)菌落的形成。但隨著培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步增加，生物被膜內(nèi)細(xì)胞開始凹陷形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與大多數(shù)生物被膜態(tài)細(xì)菌如變形鏈球菌和肺炎鏈球菌類似，可能是在生物被膜態(tài)細(xì)菌生長過程中，隨著細(xì)菌密度的增加，生物被膜內(nèi)營養(yǎng)和氧氣不足導(dǎo)致的。

在本研究中，與浮游態(tài)菌相比，生物被膜態(tài)菌的耐藥性增加，這與Cargill和Upton報(bào)道的結(jié)果相似，可能是生物被膜中細(xì)菌代謝狀態(tài)的多樣性及生物被膜基質(zhì)的保護(hù)，或者是抗菌藥物難以滲透生物被膜，細(xì)菌生長速度緩慢以及存在抗菌藥物降解酶等，從而使耐藥性增加。除此之外，與浮游態(tài)菌相比，生物被膜的存在使細(xì)菌增加了突變的頻率，并且生物被膜菌中的基因會(huì)發(fā)生頻繁的水平轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致耐藥基因迅速擴(kuò)散?？傊?，生物被膜的產(chǎn)生為細(xì)菌提供了重要的保護(hù)屏障，阻止抗菌藥物接觸細(xì)菌，干擾抗菌藥物作用的正常發(fā)揮，從而加劇了細(xì)菌的感染性。

基因表達(dá)譜可以揭示有關(guān)細(xì)菌物種適應(yīng)特定環(huán)境的重要信息。生物被膜是細(xì)菌的一種高度動(dòng)態(tài)的活性成分，生物被膜的存在有助于細(xì)菌持續(xù)性感染。本研究分析了金黃色葡萄球菌的生物被膜態(tài)和浮游態(tài)的基因轉(zhuǎn)錄情況，在生物被膜態(tài)細(xì)菌中，與生物被膜形成相關(guān)的基因表達(dá)較活躍，如編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平在生物被膜態(tài)細(xì)菌中升高，銅綠假單胞菌和加德納菌也表現(xiàn)出這種現(xiàn)象。而參與代謝的基因(如與糖酵解相關(guān)的基因)和翻譯的基因(如編碼核糖體蛋白的基因)轉(zhuǎn)錄水平呈下調(diào)趨勢，與表皮葡萄球菌和變形鏈球菌的報(bào)道一致，可能是由于生物被膜包裹著的細(xì)菌，其獲得的營養(yǎng)成分和轉(zhuǎn)錄翻譯所需的原材料有限，從而限制了其代謝和轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。這些信息為研究金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程中代謝情況以及基因功能提供了重要的參考。

4 結(jié) 論

金黃色葡萄球菌在生物被膜態(tài)和浮游態(tài)的基因表達(dá)中呈現(xiàn)出顯著的差異。這些變化可能與生物被膜態(tài)菌的持久性密切相關(guān)，同時(shí)可能與細(xì)菌毒性的發(fā)揮息息相關(guān)。生物被膜態(tài)和浮游態(tài)生物過程中的代謝差異可能對控制由金黃色葡萄球菌引起的感染有所幫助，此研究為了解金黃色葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。