雞毒支原體MG-HY株感染雞氣管的轉(zhuǎn)錄組學分析

吳春琳，鐘樂苗，趙 妍，李文跡，黃曉紫，吳異健,2,3*

(1.福建農(nóng)林大學動物科學學院, 福州 350002; 2.中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高等學校重點實驗室, 福州 350002; 3. 福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室, 福州 350002; 4.中科國創(chuàng)(南平)生物科技股份有限公司，南平 354200)

雞毒支原體(，MG)是一種大小介于細菌和病毒之間的微生物，富含黏附蛋白，能頑固地黏附在呼吸道或泌尿道上皮細胞。能夠引發(fā)雞、火雞及其他禽類的嚴重慢性呼吸道疾病(CRD)。典型癥狀表現(xiàn)為咳嗽、流漿液性鼻液、濕性啰音。MG自報道以來廣泛分布于世界上所有的養(yǎng)禽國家，每年給各養(yǎng)殖戶帶來嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計，雞群在遭受MG感染之后弱雛增長率在10%左右；蛋雞的產(chǎn)蛋量下降20%左右；肉雞減重近40%。國內(nèi)外學者對MG感染的研究超過了60年，但MG感染仍然是現(xiàn)代集約化養(yǎng)禽業(yè)的防控重點。

目前，疫苗仍是預防雞毒支原體感染的主要方法，特別是在種雞預防方面。然而，疫苗對MG感染不能完全保護，這可能是由于對MG與宿主相互作用以及宿主在感染后的免疫反應(yīng)等方面認識有限。以往的研究證實了MG的致病作用與其在代謝過程中產(chǎn)生的神經(jīng)氨酸酶、過氧化氫酶、卵磷脂酶、溶菌酶或溶血素有關(guān)；也與出現(xiàn)在早期定植過程中的Gapa、CrmA和Pvpa等黏附蛋白存在高度相關(guān)性。此外，體外雞胚氣管環(huán)研究檢測發(fā)現(xiàn)，幾種趨化因子和炎性細胞因子的表達釋放，包括IL-18、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CCL20等，與黏膜炎癥性病變存在高度相關(guān)性。盡管人們對MG與宿主之間的互作有所了解，但MG感染引起雞氣管黏膜炎性病變和黏膜免疫反應(yīng)機制仍有待探索。

轉(zhuǎn)錄組測序已被應(yīng)用于提供對分子機制的新見解，并探索宿主與病原體之間的相互作用。因此，本研究首先利用MG-HY株菌液建立SPF雛雞感染模型。隨后，使用RNA-seq分析探索了感染組和對照組氣管的全面基因表達譜。將表達量不同的基因(DEG)進行功能注釋和分類，為雞氣管黏膜免疫相關(guān)基因的鑒定提供參考。最后，為了進一步證實轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果，作者使用qRT-PCR驗證了一些免疫相關(guān)基因表達，包括黏附分子(ALCAM、CD34、NECTIN1、CDH3)、炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL18、IL1R1)和趨化因子(CCL4、CXCL8、CXCL13、CXCL14、CCL20)。該數(shù)據(jù)為進一步研究MG與宿主之間的相互作用提供基礎(chǔ)，并對臨床上MG感染的防治具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 毒株和實驗動物

SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司，SPF雛雞由實驗室自行孵化飼養(yǎng)。MG-HY株(TOC-ID為10·0.2 mL)，由本實驗室分離鑒定保存。

1.2 動物感染和樣本采集

將60只1日齡的健康SPF雛雞隨機分為兩組(=30)，按照標準的育雛方法隔離飼養(yǎng)，兩組飼養(yǎng)管理條件一致。在20日齡時，感染組和對照組雛雞通過點眼滴鼻方式各接種0.2 mL·羽的MG-HY菌液和滅菌生理鹽水，每日觀察各組雞只的臨床癥狀，并對發(fā)病時間和臨床癥狀特征進行詳細記錄。于接種后3、5、7和15 d，每次隨機抽取6只雛雞進行心臟采血處死后剖檢，先觀察氣囊病變，根據(jù)Zhang等的研究方法，評估氣囊病變。后迅速采集氣管組織。將部分氣管組織用4%多聚甲醛固定，進行組織病理學分析。剩余的氣管樣品放置-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 通過qRT-PCR定量氣管中的MG負荷

為了測定侵入氣管內(nèi)的細菌載量，在感染后3、5、7和15 d(分別記作3、5、7和15 dpi)無菌取雛雞氣管(每組=6)，使用PBS沖洗后稱取100組織在無菌條件下勻漿。按參考文獻[11]建立的雞毒支原體qRT-PCR檢測方法，使用Roche Light Cycler儀器(Roche，上海)通過qRT-PCR檢測雛雞氣管中MG的DNA含量。

1.4 基因文庫構(gòu)建與測序

將氣管組織保存在干冰中送Sangon Biotech有限公司進行測序分析，采用Total RNA Extractor(Trizol)提取試劑盒提取樣品的Total RNA，經(jīng)Qubit 2.0熒光計和Qubit2.0RNA試劑盒(Thermo，上海)評估合格后，使用Sangon Biotech(上海)的Illumina測序平臺(Hiseq X Ten)上對cDNA文庫進行測序。

1.5 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析

Hiseq X Ten系統(tǒng)生成的原始序列數(shù)據(jù)首先運用Fast-QC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)做質(zhì)量評估，去除 3′端測序接頭序列和低質(zhì)量(質(zhì)量低于 20 個堿基)的堿基。干凈讀數(shù)以FASTQ格式存儲并用于定量分析。然后采用Map Splice軟件將過濾后序列與NCBI數(shù)據(jù)庫參考基因組進行比對，通過使用Picard工具(http://picard.sourceforge.net/)確定映射到每個基因的讀數(shù)總數(shù)來推斷每個基因的轉(zhuǎn)錄水平。運用DESeq軟件進行差異表達的基因篩選，以logFC>1或<-1且FDR<0.05為閾值篩選差異表達基因，合并兩組間的差異表達基因，通過基于MA繪圖分析得到表達強度值。

1.6 差異表達基因的功能注釋

對DESeq軟件鑒定的log倍數(shù)變化≥2的DEGs進行分析，通過基因本體(GO) (http://www.geneontology.org/)鑒定富集的生物學過程。最后，為了解 DEGs 相關(guān)的生物學途徑，使用由 KEGG 自動注釋服務(wù)器(KAAS)(http://www.genome.jp/tools/kaas/)運行的京都基因與基因組百科全書(KEGG)途徑分析程序來獲得功能注釋。所有表達數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和可視化均通過R包軟件進行(http://www.r-project.org/)。本研究中討論的所有數(shù)據(jù)均已錄入NCBI的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)，收錄號為SRR5186264。

1.7 差異表達基因qRT-PCR驗證

為了驗證細菌感染氣管差異表達基因的測序結(jié)果，選擇黏附分子、細胞因子和趨化因子差異表達的基因(、34、1、3、-α、18、1R1、-1β、4、13、20、14)進行qRT-PCR，檢測這些選定基因的mRNA水平。β-actin被用作參考基因以標準化靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)NCBI中雞()的參考序列使用Primer 6.0軟件設(shè)計引物，引物相關(guān)信息見表1。qRT-PCR檢測信號通路相關(guān)基因表達量的數(shù)據(jù)采用相對定量2-ΔΔ方法進行計算，使用Graph Pad Prism 8軟件展開表達量分析(在qRT-PCR反應(yīng)中，設(shè)-為內(nèi)參)。

表1 qRT-PCR引物

圖1 氣管中細菌的載量分析Fig.1 Analysis of bacterial load in trachea

2 結(jié) 果

2.1 MG感染雞的臨床癥狀和剖檢病變分析

雛雞在感染MG后3 d(3 dpi)均無明顯臨床癥狀出現(xiàn)；7 dpi，感染組個別雛雞首先出現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀；15 dpi，感染組所有雞均出明顯的呼吸啰音，有4只雞表現(xiàn)出咳嗽、眼部腫脹等癥狀。直至全群剖殺前，各組雞均未出現(xiàn)死亡。

在3、5、7和15 dpi，對雛雞進行剖檢，剖檢結(jié)果顯示，感染組的雞出現(xiàn)不同程度的氣囊炎，氣囊顏色渾濁和氣囊壁增厚。對照組雞均無明顯病變，氣囊透明無分泌物。雛雞氣管中的細菌DNA含量統(tǒng)計如圖1所示，在健康雛雞氣管中未檢測到MG；但感染組樣本細菌載量在3 dpi約為1×10copies·μL，5 dpi約為1×10copies·μL，在7和15 dpi顯著增長，15 dpi 時細菌載量約為1×10copies·μL。

2.2 測序數(shù)據(jù)處理與分析

15 dpi取感染組和對照組試驗雞的氣管組織樣本進行了轉(zhuǎn)錄組測序,分別獲得了超過5 500萬條原始讀數(shù)，質(zhì)控后得到讀數(shù)分別為57 745 164(98.05%)、54 132 380(98.35%)。定位到雞參考基因組，兩組分別獲得的定位讀長為48 771 234和50 886 334，定位比例分別為92.93%和91.48%，所有樣本的唯一映射讀數(shù)率均>90%。此外，所有樣本的GC含量均>50%以上，樣本的基礎(chǔ)質(zhì)量評價指標(Q30)均>94%(表2)。均一性評估結(jié)果顯示(圖2)，reads分布曲線平滑，未出現(xiàn)有斷崖式上升或者下降。表明轉(zhuǎn)錄組文庫中的mRNA片段化的隨機性高，可以滿足后續(xù)分析。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控統(tǒng)計表

圖2 試驗樣本的Reads在參考基因上的均一化分布統(tǒng)計Fig.2 Homogeneous distribution statistics of reads on reference genes for test samples

2.3 差異表達基因(DEGs)篩選

使用R包中的DESeq軟件對15 dpi雛雞氣管的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異表達分析。結(jié)果顯示，感染組與對照組之間共篩選出3 112個顯著(<0.01)差異表達基因(DEGs)，其中,1 646個上調(diào)基因，1 466個下調(diào)基因。通過MA圖顯示了DEGs的分布幅度(圖3)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫以雞RefSeq mRNA數(shù)據(jù)庫進行blastn相似性搜索，來實現(xiàn)差異表達基因的注釋。

圖3 比較組表達差異基因分布火山圖Fig.3 Volcano plot of differential gene distribution in comparison group

2.4 GO功能注釋的差異性分析

使用生物信息學工具DAVID對通過DESeq分析鑒定的差異表達基因功能進行了GO分析，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組文庫的基因表達譜概述。根據(jù)它們的GO術(shù)語，總的差異基因被11 377個GO術(shù)語所標注，其中,1 518個GO術(shù)語為顯著富集(<0.05)，根據(jù)GO注釋將雞Unigenes分為生物過程(1 986 Unigenes)、細胞組分(2 030 Unigenes)和分子功能(1 855 Unigenes)。因為一些基因被分為一個以上的子類別，所以這些子類別中的基因總和可能超過100%。對每個功能類別的前15個GO項進行了富集，并顯示在(圖4)，生物過程類別中最豐富的GO術(shù)語包括對生物調(diào)節(jié)(1 264 Unigenes)、刺激的反應(yīng)(886 Unigenes)、多細胞生物過程(758 Unigenes)和細胞成分組織或生物發(fā)生(677 Unigenes)。至于細胞組分，1 592 和1 588個Unigenes被分配到細胞和細胞部分GO術(shù)語，1 188 個Unigenes被分配到細胞器術(shù)語，1 015 個Unigenes個被分配到膜術(shù)語。在分子功能類別中，結(jié)合(1 380 Unigenes)、蛋白質(zhì)結(jié)合(792 Unigenes)催化活性(774 Unigenes)是豐度最高的GO術(shù)語(圖4)。說明感染MG-HY株的雛雞氣管發(fā)生了復雜的生物學變化。

圖4 差異表達基因前15個最高的GO富集Fig.4 Top 15 highest GO enrichment of differentially expressed genes

2.5 KEGG-Pathway差異基因分析

為了鑒定雛雞的活躍生物學通路，使用KEGG注釋系統(tǒng)對差異表達的Unigenes進行映射。對3 112個Unigenes進行KEGG注釋，以(<0.01)為條件判定差異表達基因Pathway富集的顯著性(圖5)。結(jié)果表明，有827個Unigenes顯著富集于30條的通路中，其中，幾個高代表性的通路與雞的黏膜免疫系統(tǒng)有關(guān)，包括細胞因子-細胞因子受體相互作用(240 Unigenes)，細胞黏附分子(CAMs)(178 Unigenes)，細胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用(142 Unigenes)、緊密連接(178 Unigenes)、PPAR信號通路(48 Unigenes)和MAPK信號通路(12 Unigenes)等(表3)。對這些途徑的分析表明，MG感染影響了宿主氣管免疫防御反應(yīng)相關(guān)信號通路，使氣管正常的生理活動和穩(wěn)態(tài)受到異常調(diào)節(jié)，最終破壞氣管組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并引起嚴重的炎癥。

圖5 差異表達基因的KEGG顯著性注釋(top30)Fig. 5 KEGG significance annotation of differentially expressed genes (top30)

表3 免疫相關(guān)通路及其相關(guān)差異表達基因的富集

2.6 qRT-PCR對DEGs的驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序的可靠性，對選擇黏附分子、細胞因子和趨化因子差異表達的基因(、34、1、3、-α，18、1R1、-1β、4、13、20、14)進行qRT-PCR檢測。結(jié)果如圖6所示，qRT-PCR檢測結(jié)果與通過RNA-seq數(shù)據(jù)的結(jié)果趨勢一致。從而證實了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。

A.趨化因子mRNA相對水平；B.細胞因子mRNA相對水平；C.黏附分子mRNA相對水平A. Relative chemokine mRNA level； B.Relative cytokines mRNA level；C.Relative icytadherence molecules mRNA level圖6 qRT-PCR 驗證 RNA-Seq 中的差異表達基因Fig. 6 qRT-PCR validation of differentially expressed genes in RNA-Seq

3 討 論

MG是家禽慢性呼吸道疾病的主要病原體，感染后會造成巨大的經(jīng)濟損失。在禽類呼吸系統(tǒng)中，氣管充當與外界氣體交換的通道，也是抵御外源污染物的第一道防線，因此使其成為MG攻擊的首要目標。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)MG感染引起雛雞氣管明顯的組織學病變：包括雛雞氣管纖毛脫落、結(jié)構(gòu)破壞、黏膜炎性細胞浸潤等，導致氣管炎癥和呼吸功能障礙。本研究為了進一步探究MG感染對雞氣管黏膜上皮損傷和黏膜免疫的作用機制，首先使用雞毒支原體感染SFP雛雞，隨后，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析(RNA-seq)探索了感染組和對照組雞氣管的全面基因表達譜。將 DEGs 進行功能注釋和分類，篩選出與免疫相關(guān)的通路及其差異表達基因，對雛雞氣管與MG之間的互作機制提供了新的見解。

動物試驗結(jié)果顯示，MG感染組，15 dpi 的所有雛雞出現(xiàn)典型的臨床癥狀和剖檢病變：明顯的呼吸啰音，咳嗽、眼部腫脹等癥狀，氣囊增厚、積液，與先前研究結(jié)果一致。同樣，研究表明，菌液接種后，MG在雛雞氣管內(nèi)也顯著增殖，感染組樣本細菌載量在15 dpi對比3 dpi呈現(xiàn)4倍增長。說明細菌在氣管內(nèi)增殖與氣管黏膜病變成正相關(guān)。然而，MG在宿主體內(nèi)致病的機制研究仍不充分。

為了深入了解宿主的轉(zhuǎn)錄組譜如何響應(yīng)MG感染的變化，作者運用RNA-seq技術(shù)對感染組和對照組的雞氣管組織進行轉(zhuǎn)錄組分析。在感染組和對照組的雞氣管組織中共鑒定出3 112個顯著(<0.01)差異表達基因(DEGs)，其中,1 646個上調(diào)基因，1 466個下調(diào)基因(圖3)。數(shù)據(jù)分析顯示，這些DEGs顯著富集于免疫相關(guān)術(shù)語和途徑，可能在抵抗MG感染中發(fā)揮重要作用。根據(jù)GO富集分析的結(jié)果顯示，參與黏膜免疫應(yīng)答子類別中差異基因顯著失調(diào)，主要體現(xiàn)在生物調(diào)節(jié)、刺激的反應(yīng)、多細胞生物過程、細胞成分組織或生物發(fā)生等生物過程。這表明MG定植在宿主氣管的過程中，改變了宿主細胞膜的穩(wěn)定性。先前的研究報道了MG脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs)是MG主要的毒力因子之一，它們可以刺激宿主細胞產(chǎn)生促炎細胞因子并誘導細胞凋亡和壞死。本研究中，MG通過LAMPs與細胞受體結(jié)合后介導雞氣管上皮細胞的炎癥反應(yīng)，刺激下游信號通路幾種促炎細胞因子(IL-1β、INF-α、IL18、IL1R1)和趨化因子(CCL20、CXCL13、CXCL14、CCL4)的活化。因此，誘導炎癥細胞的激活和募集是MG發(fā)病機制的關(guān)鍵。

大多數(shù)已鑒定的DEGs參與宿主黏膜上皮免疫防御反應(yīng)(≤0.01)，如表3所示。當在生物學途徑的背景下進行分析時差異基因顯著富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用，細胞黏附分子(CAMs)，細胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用、緊密連接、PPAR信號通路、MAPK信號通路和p53信號通路等。對這些途徑的分析表明，在疾病發(fā)展過程中MG可能刺激一種或多種生理過程并引起氣管免疫防御反應(yīng)。免疫相關(guān)通路富集的DEGs在防御MG感染的潛在致病機制中發(fā)揮重要作用。細胞黏附分子是免疫系統(tǒng)的重要信號傳遞者，它們起到將抗原信號從細胞外傳遞到細胞內(nèi)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，許多顯著富集在細胞黏附分子通路中，具有病原體識別、信號傳遞和調(diào)控白細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附等功能的黏附分子，包括ALCAM、CD34、NECTIN1和CDH3，在MG感染組雛雞氣管組織中下調(diào)。研究證實當黏附分子功能被下調(diào)后，宿主抗原呈遞和加工能力會降低，使病原體逃避宿主的免疫系統(tǒng)進入呼吸道上皮細胞使其致病。

宿主氣管黏膜免疫應(yīng)答的一個重要特征是參與炎癥反應(yīng)的DEGs活性增強，通過將免疫細胞吸引到炎癥部位，直接參與炎癥反應(yīng)，并促進免疫反應(yīng)和傷口愈合。在本研究中檢測到，主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路的炎癥因子和趨化因子，如IL18、IL1R1、TNF-α、IL-1β、CCL4和CXCL13等，在感染MG的雛雞的氣管組織中表達增強。IL18和IL1R1是促炎介質(zhì)，參與許多細胞因子誘導的免疫和炎癥反應(yīng)。TNF-α和IL-1β具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答功能，并在機體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用；CCL4和CXCL13等趨化因子可以將免疫細胞募集到感染部位，進一步促進免疫細胞浸潤，加劇氣管組織病變。MG感染后CXCL14的表達量降低了6倍，這與其他顯著上調(diào)的趨化因子形成鮮明對比，如CXCL13(4倍)，CCL4(3.5倍)和CCL20(3倍)。CXCL14在上皮組織中的穩(wěn)定表達和高豐度，是一種針對呼吸道細菌的高活性抗菌肽(AMP)，有助于肺部的細菌清除。然而，尚未有任何關(guān)于家禽感染后產(chǎn)生的炎癥刺激使趨化因子被抑制的報道。本研究CXCL14 mRNA表達水平受到炎癥刺激的顯著抑制，據(jù)此，作者推測CXCL14是在維持上皮組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，在炎癥條件建立之前就發(fā)揮滅菌功能，而不是直接參與炎癥反應(yīng)驅(qū)動的免疫過程，具體作用機制有待進一步驗證。這些免疫相關(guān)的DEGs有助于闡明MG感染后雛雞的免疫反應(yīng)，但是，MG感染后通常無法清除，伴隨著持續(xù)性免疫原性炎癥使禽類易于合并感染其他病原體并導致CRD的發(fā)展。

本研究不僅豐富了雞現(xiàn)有的序列信息數(shù)據(jù)，并且為進一步完善MG 感染導致宿主氣管上皮損傷和黏膜免疫機制提供依據(jù)。然而，仍然需要探索雞毒支原體誘導強烈宿主反應(yīng)的關(guān)鍵成分，雛雞氣管黏膜免疫的潛在機制也需要進一步研究證實。

4 結(jié) 論

運用RNA-seq探索了感染組和對照組雞氣管的全面基因表達譜。將 DEGs進行功能注釋和分類，鑒定出1 646個上調(diào)基因和1 466個下調(diào)基因。差異基因主要涉及生物調(diào)節(jié)、對刺激的反應(yīng)、多細胞生物過程和細胞成分組織或生物發(fā)生等生物學過程和氣管黏膜免疫相關(guān)信號通路。