李 楊,周 棟,尹彥龍,張廣凍,相彩霞,支飛杰,白芙蓉,林鵬飛,靳亞平,王愛華
(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,楊凌 712100)
布魯氏菌()引起的布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)作為一種嚴(yán)重的人畜共患病流行于世界170多 個(gè)國(guó)家和地區(qū),造成每年約50萬人感染。近年來,我國(guó)由于養(yǎng)殖量的快速提升和動(dòng)物及其產(chǎn)品流動(dòng)性的增加,布病已經(jīng)擴(kuò)散至全國(guó)各個(gè)省區(qū),牛羊布病防控形勢(shì)嚴(yán)峻。因此,全面闡明布魯氏菌的病原特點(diǎn)、揭示其免疫逃逸、毒力調(diào)控機(jī)制等致病機(jī)理,探尋新的、有效的治療靶點(diǎn),成為布病防控亟待解決的關(guān)鍵和該領(lǐng)域研究的核心。
細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞程序性死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要通路,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能增強(qiáng)非折疊蛋白反應(yīng),在蛋白糖基化作用和專有伴侶分子(binding immunoglobulin protein, BiP; also known as GRP78)的輔助下,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài);但強(qiáng)烈或持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,細(xì)胞無法維持穩(wěn)態(tài),將引起C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表達(dá)與活化,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡發(fā)生。布魯氏菌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能夠激活適度的ER Stress,抑制CHOP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,確保自身在胞內(nèi)的生存與增殖。
外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)是布魯氏菌細(xì)胞壁的主要組成成分,具有較強(qiáng)的免疫原性和保護(hù)性,在維持菌體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)攝取、激活宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,影響細(xì)菌毒力。OMP16在不同布魯氏菌菌株中高度保守,能被免疫系統(tǒng)模式受體識(shí)別,作為自佐劑疫苗和病原檢測(cè)靶點(diǎn)已被廣泛研究;本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),布魯氏菌缺失16基因菌體致死,低表達(dá)16降低布魯氏菌在巨噬細(xì)胞及小鼠體內(nèi)的存活,改變機(jī)體免疫因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達(dá),但OMP16蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡及免疫活性的調(diào)控研究仍未闡明。本試驗(yàn)利用OMP16處理RAW264.7細(xì)胞為模型,檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性因子GRP78和CHOP的表達(dá)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞上清液中免疫因子的變化,為深入研究宿主細(xì)胞與布魯氏菌感染互作關(guān)系提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中,細(xì)胞長(zhǎng)至70%~80%時(shí)傳代培養(yǎng),用于后續(xù)試驗(yàn)。
DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購于Hyclone公司;MTT試劑購于Sigma公司;凱基全蛋白提取試劑盒,凱基BCA蛋白測(cè)定試劑盒,Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購于凱基生物公司;抗Caspase-3標(biāo)簽抗體購于Abcam公司;抗GRP78標(biāo)簽抗體,抗CHOP標(biāo)簽抗體購于SANTA公司;PrimeScriptRT reagent ki、RNAiso Plus和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
離心機(jī)購于德國(guó)Eppendorf公司;二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國(guó)Thermo公司;蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購于美國(guó)BioRAD公司。
按照實(shí)驗(yàn)室建立的OMP16原核表達(dá)純化方法,表達(dá)純化OMP16蛋白。pET-32a-OMP32重組質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,1 mmol·LIPTG,30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h,收集菌體后超聲破碎,SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)形式,按Ni-NAT說明書步驟純化并收集蛋白,PBS透析,TritonX-114去除內(nèi)毒素,BCA法檢測(cè)蛋白濃度后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞,按照2×10個(gè)細(xì)胞·孔接種于96孔板,細(xì)胞融合80%時(shí),將OMP16蛋白按用0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μg·mL的濃度梯度添加于培養(yǎng)液中;24 h后添加MTT試劑,20 μL·孔,37 ℃ 培養(yǎng)4 h后,加入150 μL DMSO試劑,充分輕搖混勻,于490 nm處測(cè)量吸光值。
將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞,按照5×10個(gè)細(xì)胞·孔均勻接種于48孔板,置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱,培養(yǎng)過夜;OMP16蛋白按照設(shè)置的濃度梯度添加入48孔板內(nèi),24 h后棄去培養(yǎng)液,每孔加入0.5 mL固定液固定10 min, 洗滌后,每孔0.5 mL細(xì)胞染色液,避光放置于4 ℃冰箱20~30 min;洗滌后,使用熒光倒置顯微鏡檢測(cè)。
將RAW264.7細(xì)胞接種于事先在孔底放有圓形爬片的24孔板中,置于37 ℃、5% CO飽和濕度條件培養(yǎng)過夜;加入OMP16蛋白作用36 h后,棄去培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,4% 多聚甲醛固定細(xì)胞爬片30 min,PBS洗滌3次;加入0.5%Triton-100,室溫透膜20 min,PBS洗滌3次;5%牛血清白蛋白,室溫封閉1 h;孵育1∶100稀釋的Caspase-3抗體,4 ℃ 過夜,PBS洗滌3次;室溫避光孵育1∶2 000稀釋的GFP標(biāo)記抗兔熒光二抗1 h,洗滌3次;滴加DAPI染核,避光孵育15 min,PBS洗滌3次;用中性樹脂封片,激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。
利用RIPA裂解液提取OMP16刺激的RAW264.7細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE跑膠分離后,60 V恒壓濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,1∶200 稀釋的Caspase-3抗體和1∶2 000稀釋的β-actin 抗體4 ℃孵育過夜;TBST洗滌5次,1∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗,室溫孵育1 h, 使用凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)。使用Image J 軟件分析條帶灰度值,目的蛋白與β-actin灰度值的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
利用Trizol裂解液提取OMP16刺激的RAW264.7細(xì)胞總RNA,測(cè)定濃度后,使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA合成cDNA。根據(jù)GenBank中山羊78(NM_001163434.1)及P(NM_007837.3)的序列號(hào)設(shè)計(jì)引物,78-F(5′-AGAAACTCCGGCGTGAGGTAGA-3′)、78-R(5′-TTCCTGGACAGGCTTCATGGTA-3′)以及-F(5′-AGCTGGAAGCCTGGTATGAGGA-3′)、-R(5′-AGCTAGGGACGCA-GGGTCAA-3′)以及內(nèi)參序列-F(5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′)、-R(5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′)。以cDNA為模板,參照TaKaRa公司的PrimeScriptRT reagent Kit說明書,進(jìn)行定量PCR反應(yīng)體系配制:SYBRPremix Ex TaqII 10 μL, DNAase/RNase-free水 6.8 μL,cDNA1.6 μL,PCR Forward Primer (10 μmol·L) 0.8 μL,PCR Reverse Primer (10 μmol·L) 0.8 μL,總體積20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè) 循環(huán),72 ℃3 min。以為內(nèi)參,采用2-△△計(jì)算78和的轉(zhuǎn)錄情況。
取生長(zhǎng)良好的RAW264.7細(xì)胞均勻鋪板在六孔板內(nèi),設(shè)置對(duì)照組及OMP16刺激組,收集數(shù)量為1×10左右的細(xì)胞,PBS洗滌后加入200 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞;加入10 μL Annexin V-FITC混勻,避光室溫條件下反應(yīng)15 min;加入300 μL Binding Buffer及5 μL PI,1 h之內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
RAW264.7細(xì)胞與0.1、1、10、50、100 μg·mL的濃度的OMP16作用24 h后,通過MTT與Hoechst方法確定OMP16作用的最佳濃度(圖1、2)。
*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001圖1 MTT法篩選OMP16作用于RAW264.7細(xì)胞最佳濃度Fig.1 The optimal concentration of OMP16 on RAW264.7 screened by MTT assay
圖1顯示,當(dāng)OMP16濃度達(dá)到10 μg·mL時(shí),顯著影響細(xì)胞活性(<0.05),當(dāng)濃度達(dá)到100 μg·mL時(shí),OMP16極顯著影響細(xì)胞活性(<0.001)。 0.1及1 μg·mLOMP16刺激后,細(xì)胞凋亡較少(圖2),50 μg·mLOMP16處理后細(xì)胞開始大量凋亡,直至100 μg·mLOMP16處理時(shí)細(xì)胞已全部凋亡,10 μg·mLOMP16刺激可引起部分細(xì)胞凋亡。綜上,確定10 μg·mL為OMP16作用于RAW264.7細(xì)胞的最佳濃度。
圖2 Hoechst法篩選OMP16作用于RAW264.7細(xì)胞最佳濃度Fig.2 The optimal concentration of OMP16 on RAW264.7 screened by Hoechst assay
根據(jù)上述確定的濃度10 μg·mL,設(shè)計(jì)6個(gè)時(shí)間點(diǎn),設(shè)置空白對(duì)照組及OMP16刺激組,分別將稀釋好的10 μg·mLOMP16培養(yǎng)液添加到RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)孔,作用相應(yīng)時(shí)間后采用MTT法確定最佳作用時(shí)間點(diǎn),如圖3所示,可以看出OMP16明顯抑制RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng);在24~36 h, OMP16處理的RAW264.7細(xì)胞與正常組細(xì)胞生長(zhǎng)差異極顯著(<0.001)。綜上,確定36 h 為OMP16作用于RAW264.7細(xì)胞的最佳時(shí)間。
***.P<0.001圖3 MTT法篩選OMP16作用于RAW264.7細(xì)胞最佳時(shí)間Fig.3 The optimal action time of OMP16 on RAW264.7 by MTT assay
為確定OMP16對(duì)細(xì)胞凋亡通路的影響,采用免疫熒光法及Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)。如圖4 A圖所示,OMP16處理后Caspase-3的總量顯著增多;如圖4 B圖所示,與對(duì)照組相比,OMP16組Caspase-3/β-actin比值極顯著升高(<0.001)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,OMP16能引起RAW264.7細(xì)胞顯著的早期凋亡與晚期凋亡(圖4 C,表1)。
A. 細(xì)胞爬片免疫熒光法;B. Western blot法(檢測(cè)Caspase-3,***.P<0.001); C. 流式細(xì)胞術(shù)A. Cell immunofluorescence assay; B. Western blot assay(detect Caspase-3,***.P<0.001); C. FCM assay圖4 OMP16對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的檢測(cè)Fig.4 The detection of apoptosis in RAW264.7 stimulated by OMP16
表1 流式細(xì)胞術(shù)凋亡率統(tǒng)計(jì)
ER Stress是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路。為了探討OMP16引起的RAW264.7細(xì)胞凋亡是否與ER Stress有關(guān),Wsetern blot檢測(cè)了兩個(gè)ER Stress與凋亡相關(guān)蛋白GRP78與CHOP的表達(dá)。如圖5所示,OMP16處理極顯著的引起了CHOP表達(dá)的升高(<0.001),GRP78的表達(dá)在24 h(<0.01) 和36 h(<0.001)同樣出現(xiàn)顯著的升高。
**.P<0.01; ***.P<0.001圖5 RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要因子檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The results of ERS’ main factors in RAW264.7
為了探討OMP16對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的免疫活性影響,作者檢測(cè)了對(duì)照組細(xì)胞與OMP16刺激組細(xì)胞-1β、-6、-α mRNA的轉(zhuǎn)錄情況,如圖6所示,-1β、-6、-α在OMP16刺激36 h后,轉(zhuǎn)錄量均顯著上升(<0.01,<0.01,<0.05)。
*.P<0.05; **.P<0.01圖6 RT-qPCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞免疫因子轉(zhuǎn)錄情況Fig.6 The transcription of immune factors in RAW264.7 detected by RT-qPCR assay
布魯氏菌病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康、公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)健康發(fā)展的重大人畜共患病。由于布魯氏菌為胞內(nèi)感染菌,體液免疫和抗生素很難發(fā)揮作用,在人尚缺乏成功的疫苗,應(yīng)用于家畜的疫苗對(duì)人畜均具有殘余毒力。因此,深入研究其毒力因子,揭示其致病機(jī)制對(duì)于創(chuàng)制新的疫苗和治療靶點(diǎn)均具有重要科學(xué)意義。
布魯氏菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活是建立和維持慢性感染的基礎(chǔ)。抑制細(xì)胞凋亡是布魯氏菌逃避免疫反應(yīng)并建立慢性感染的重要策略。布魯氏菌進(jìn)化出許多特有的毒力因子或毒力系統(tǒng),如脂多糖、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系統(tǒng)及其效應(yīng)因子VceC、BspC等,調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡及免疫應(yīng)答。16基因是布魯氏菌存活的必需基因,OMP16蛋白位于布魯氏菌細(xì)胞膜的外側(cè)。前期研究表明,16基因在不同菌株中高度保守,降低OMP16的表達(dá),能有效降低布魯氏菌在胞內(nèi)及小鼠體內(nèi)的存活。本研究發(fā)現(xiàn)OMP16感染能夠降低巨噬細(xì)胞的活性,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞各種蛋白合成、加工、運(yùn)輸和分泌的主要場(chǎng)所,對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)極為重要。當(dāng)病原菌感染細(xì)胞,胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)不能及時(shí)得到恢復(fù),就會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)促凋亡分子CHOP和Caspas-3的表達(dá)活化,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。粗糙型布魯氏菌能夠引發(fā)巨噬細(xì)胞線粒體膜通透性的改變促進(jìn)凋亡,而光滑型布魯氏菌能夠抑制巨噬細(xì)胞的自發(fā)性凋亡。當(dāng)光滑型布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖達(dá)到一定程度后,可以分裂成對(duì)巨噬細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用的粗糙型菌株進(jìn)而促進(jìn)布魯氏菌的擴(kuò)散。而在此過程中,毒力因子發(fā)揮重要作用。效應(yīng)蛋白BspJ作為核調(diào)節(jié)蛋白抑制巨噬細(xì)胞的凋亡,在小鼠模型中,VceC誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子,并導(dǎo)致宿主細(xì)胞的凋亡。而在山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞中,VceC則通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路抑制CHOP引起的細(xì)胞凋亡。外膜蛋白OMP31則能抑制TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。本研究表明,OMP16能夠增強(qiáng)GRP78和CHOP的表達(dá),促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7的凋亡。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡中最主要的終末剪切酶,在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OMP16能夠引起巨噬細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量顯著增多。不同布魯氏菌菌株以及不同毒力因子等引起的凋亡反應(yīng)差異,可能是由于菌株致病機(jī)制差異以及感染細(xì)胞不同所引起。
布魯氏菌入侵機(jī)體后可引起促炎因子的表達(dá)釋放,感染初期的炎性反應(yīng)能夠協(xié)助布魯氏菌實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。在本研究中,OMP16誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α。IL-1β是經(jīng)典的炎癥因子能夠趨化、激活中性粒細(xì)胞,過量表達(dá)能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。研究表明,感染RAW 264.7細(xì)胞增加了IL-1β的表達(dá)和分泌。OMP25刺激巨噬細(xì)胞分泌大量IL-1β。IL-6具有功能二象性,并強(qiáng)烈參與抗炎和促炎功能。布魯氏菌及其外膜蛋白OMP10、OMP19、OMP25和OMP28顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α高水平表達(dá)。此外,流產(chǎn)通過IL-6減少宿主MHC-II和CIITA的表達(dá)。對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)控,是布魯氏菌破宿主壞免疫監(jiān)視,造成持續(xù)性感染的策略之一,OMP16的發(fā)病機(jī)制有待更加深入是研究。
綜上所述,布魯氏菌OMP16能夠誘導(dǎo)RAW264.7凋亡,OMP16顯著引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,CHOP作為連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路蛋白,其上調(diào)表達(dá),可能是OMP16通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子與靶點(diǎn),具體的機(jī)制需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。
布魯氏菌OMP16激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,上調(diào)CHOP的表達(dá),并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。