迷迭香酸對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖和凋亡的影響及機(jī)制

楊曉南 丁玉忠 楊桃 李雪松 褚斌

(武威市中醫(yī)醫(yī)院 1中醫(yī)內(nèi)科，甘肅 武威 733000；2普外科；3甘肅省腫瘤醫(yī)院消化腫瘤內(nèi)一科；4武威市中醫(yī)醫(yī)院胃鏡室)

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，但因臨床表現(xiàn)隱匿，缺乏辨識(shí)度，大部分患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期〔1～4〕。盡管手術(shù)、放療、化療等治療手段可抑制胃癌的病程，但仍有較大的毒副反應(yīng)〔5〕，且預(yù)后效果不佳，患者5年生存率較低〔6〕。

迷迭香酸(RA)主要來源于迷迭香、薄荷、鼠尾草、百里香等植物中〔7〕。具有廣泛的藥理活性，抗氧化〔8～10〕、抗微生物〔11〕、抗炎〔12,13〕、抗病毒〔14〕、抗癌〔15〕等作用。鑒于前期學(xué)者研究顯示，RA對(duì)多種癌細(xì)胞的抑制作用顯著。本課題探討RA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901生長、增殖、凋亡的影響及機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2主要試劑 RA(美國Sigma公司)；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)；胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京譜析科技有限公司)；抗膽囊收縮素細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，活性氧(ROS)檢測試劑盒(碧云天生物工程有限公司)，放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液、磷酸化蛋白酶抑制劑、顯影定影試劑、β-actin(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.3主要儀器 Navios流式細(xì)胞分析儀，美國Beckman Coulter公司；酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；細(xì)胞粉碎機(jī)，安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司；ECO1.2超凈工作臺(tái)及CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；Ne0fuge15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Heal Force 力康儀器(上海)有限公司；DYCZ-24K型雙板垂直電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌細(xì)胞SGC-7901接種于培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI1640)，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中。后續(xù)試驗(yàn)中，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，并用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化處理。

1.4.2CCK8法測細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長期SGC-7901胃癌細(xì)胞，經(jīng)消化離心后，加入培養(yǎng)液，以1×105細(xì)胞密度，接種于96孔板中，置培養(yǎng)箱24 h。加入10 μl不同濃度的RA溶液培養(yǎng),濃度分別為0.00、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μmol/L，設(shè)定3個(gè)平行組，48 h后，每孔加入10 μl的CCK8試劑，放置培養(yǎng)箱孵育2 h后用酶標(biāo)儀(450 nm)測吸光度值(OD)。根據(jù)下列公式計(jì)算:細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)孔OD/對(duì)照孔OD×100%。

1.4.3BrdU檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞SGC-7901，經(jīng)消化離心后，加入培養(yǎng)液，以1×105細(xì)胞密度，接種于96孔板中，置培養(yǎng)箱24 h。加入10 μl不同濃度的RA溶液(0、10、20、40 μmol/L)培養(yǎng)48 h后，分別加入BrdR試劑，按照說明書進(jìn)行操作處理。

1.4.4流式檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞SGC-7901，經(jīng)消化離心后，加入培養(yǎng)液，以1×105細(xì)胞密度，接種于96孔板中，置培養(yǎng)箱24 h。加入10 μl不同濃度的RA溶液(0、10、20、40 μmol/L)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，經(jīng)低溫離心、PBS洗滌，于4℃避光水浴染色5 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.5ELISA檢測氧化應(yīng)激標(biāo)志物 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞SGC-7901，經(jīng)消化離心后，加入培養(yǎng)液，以1×105細(xì)胞密度，接種于96孔板中，置培養(yǎng)箱24 h。加入10 μl不同濃度的RA溶液(0、10、20、40 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后，分別依據(jù)試劑盒說明書步驟,配制測定孔及各種空白對(duì)照孔；將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀，測定450 nm吸光度，根據(jù)所測OD值分別計(jì)算LDL活力及MDA含量。

1.4.6熒光探針檢測活性氧(ROS) 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞SGC-7901，經(jīng)消化離心后，加入培養(yǎng)液，以1×105細(xì)胞密度，接種于96孔板中，置培養(yǎng)箱24 h。加入10 μl不同濃度的RA溶液(0、10、20、40 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后，吸凈清液，每孔中加入100 μl的H2DCFDA染液(5 μmol/L)，放置于避光條件反應(yīng)30 min后，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和吸收波長分別為488和490 nm。熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，ROS水平越高。

1.4.7流式檢測線粒體膜電位的變化 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞SGC-7901，加入培養(yǎng)液，以1×105細(xì)胞密度，接種于6孔板，置培養(yǎng)箱24 h，加入不同濃度的RA處理(0、10、20、40 μmol/L)，藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，經(jīng)PBS重懸細(xì)胞、染色及過濾處理后，采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.8Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞SGC-7901，加入培養(yǎng)液，以1×105細(xì)胞密度，接種于6孔板，置培養(yǎng)箱24 h，加入不同濃度的RA處理(0、10、20、40 μmol/L)，藥物作用48 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌，加入裂解液處理30 min，收集細(xì)胞，離心15 min(4℃，12 000 r/min)，收集上清液。按照BCA試劑盒說明，進(jìn)行蛋白定量。取樣后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、一抗、二抗處理后，加入顯色劑進(jìn)行檢測。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1CCK8測定RA對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長的影響 RA 10 μmol/L組細(xì)胞生長率〔(79.38±5.88)%〕，與對(duì)照組〔(100.00±4.90)%〕相比，RA對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用較小，不具有顯著性差異。隨藥物濃度的增加，自20 μmol/L開始〔20 μmol/L(52.92±8.82)%、40 μg/L(29.40±7.84)%、80 μmol/L(12.74±5.88)%、160 μmol/L(7.84±6.68)%〕，RA細(xì)胞生長的抑制作用增加，具有顯著性差異(P<0.05)。由CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0、10、20、40 μmol/L RA濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2BrdU檢測RA對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組(RA 0 μmol/L)Brd U陽性細(xì)胞率(92%±6%)相比，除RA 10 μmol/L組(88%±6%)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，20、40 μmol/L組BrdU陽性細(xì)胞率均顯著降低(42%±7%、17%±8%，P<0.05)。見圖1。

2.3流式檢測細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(4.7%±0.8%)相比，除RA 10 μmol/L組(5.0%±1.0%)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，RA 20、40 μmol/L組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(28.4%±4.1%、36.8%±3.3%，P<0.05)，見圖2。

圖1 不同濃度RA對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響(BrdU染色，×200)

圖2 不同濃度RA對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

2.4ELISA檢測氧化應(yīng)激標(biāo)志物 與對(duì)照組相比，除RA 10 μmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，RA 20、40 μmol/L組LDL、MDA水平顯著增加(P<0.05)，見表1。

2.5熒光探針檢測ROS 與對(duì)照組(6±4)相比，除RA 10 μmol/L組(7±3)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，RA 20、40 μmol/L組熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，ROS水平顯著升高(29±6、76±9，P<0.05)，見圖3。

表1 各組SGC-7901細(xì)胞中LDL和 MDA含量比較

圖3 不同濃度RA對(duì)SGC-7901細(xì)胞ROS的影響(免疫熒光染色，×200)

2.6流式檢測線粒體膜電位的變化 與對(duì)照組〔(123.88±8.07)%〕相比，RA組(RA 10、20、40 μmol/L)綠色熒光細(xì)胞(紅色熒光百分比/綠色熒光百分比)增加〔(20.96±4.77)%、(3.03±1.29)%、(1.28±0.78)%〕,其中20、40 μmol/L組促進(jìn)線粒體膜去極化的效果顯著(P<0.05)。

2.7Western印跡檢測線粒體損傷標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，除RA 10 μmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余兩組(RA 20、40 μmol/L)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白指標(biāo)B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白/B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bax/Bcl-2)及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)3/caspase3顯著上升(P<0.05)，見表2、圖4。

2.8Western印跡檢測核因子E2相關(guān)因子2/血紅素氧合酶(Nrf2/HO)-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，除RA 10 μmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余兩組(RA 20、40 μmol/L)Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白p-Nrf2/Nrf2、NAPDH醌氧化還原酶(NQO)1、HO-1表達(dá)均顯著上升(P<0.05)，見表3、圖5。

表2 各組SGC-7901細(xì)胞中線粒體損傷 標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá)比較

1～4：對(duì)照組，RA 10 μmol/L組，RA 20 μmol/L組，RA 40 μmol/L組，下圖同圖4 不同濃度RA對(duì)SGC-7901細(xì)胞線粒體 損傷標(biāo)記物相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 各組SGC-7901細(xì)胞中Nrf2/HO-1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖5 不同濃度RA對(duì)SGC-7901細(xì)胞 Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

胃癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制受到多種因素的調(diào)控。與前期相比，胃癌的治療水平有所提高，患者的預(yù)后得到一定程度的改善，但治療效果仍不令人滿意〔5〕。前期學(xué)者研究顯示，RA對(duì)口腔癌〔16〕、乳腺癌〔17〕、肝癌〔18〕、直腸癌〔19〕等腫瘤細(xì)胞的生長和增殖具有抑制作用顯著。本研究結(jié)果顯示RA對(duì)細(xì)胞生長及增殖有抑制作用，與上述研究一致。

細(xì)胞凋亡是在復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制下，細(xì)胞受相關(guān)因子調(diào)控的自主死亡，對(duì)機(jī)體具有重要的生理學(xué)意義〔20，21〕。Xie等〔22〕的研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制細(xì)胞生長與增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率顯著升高，與上述研究一致。因此，推斷RA抑制SGC-7901細(xì)胞的生長及增殖，可能與調(diào)控細(xì)胞凋亡有關(guān)。

在生物體內(nèi)，MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，反映脂質(zhì)的過氧化程度及膜系統(tǒng)的受損程度〔23〕。載脂蛋白結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)中負(fù)電性的蛋白聚糖引起LDL駐留在內(nèi)膜〔24〕，而線粒體解聯(lián)的呼吸鏈，會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，氧化相關(guān)脂質(zhì)物質(zhì)〔25〕。本研究結(jié)果提示膜系統(tǒng)受損及細(xì)胞過氧化程度嚴(yán)重；熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，ROS水平顯著升高，說明發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，結(jié)果與前面標(biāo)志物水平吻合。因此，說明RA通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。

線粒體轉(zhuǎn)膜電位不平衡，其中高表達(dá)的Bcl-2及Bax能影響膜電位的耗散，導(dǎo)致膜穿透性的改變，線粒體表面發(fā)生聚合并形成孔道，使線粒體內(nèi)的促凋亡因子和細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)引發(fā)凋亡〔26〕。caspase-3是細(xì)胞凋亡中重要的效應(yīng)因子及主要執(zhí)行者。其活化形式為Cleaved caspase-3，同樣是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的重要標(biāo)志〔27〕。本研究與上述研究一致。因此，說明RA通過調(diào)控線粒體損傷相關(guān)指標(biāo)水平，促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者〔28〕。NQO1及HO-1均是Nrf2調(diào)控的抗氧化因子。李慧等〔29〕研究表明，Nrf2/HO-1是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路。本研究結(jié)果提示RA通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。