利用氧化石墨烯納米片構(gòu)建黃曲霉毒素B1熒光快速檢測(cè)方法

葉華，劉洪順，俞玥，李占明，鐘建軍，郭元新

（江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212100）

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝物，具有分布廣、毒性強(qiáng)的特點(diǎn)，常污染花生、核桃、玉米等產(chǎn)品[1-3]，嚴(yán)重威脅人體健康，已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌物質(zhì)[4]。為保障食品安全和人體健康，世界各國都對(duì)AFB1在食品中的含量制定了最高限量標(biāo)準(zhǔn)，其中歐盟最為嚴(yán)格，將花生中AFB1最高限量標(biāo)準(zhǔn)定為2 mg/kg，新加坡和日本的最高限量標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)置為5 mg/kg和10mg/kg[5]。我國標(biāo)準(zhǔn)GB2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》將花生中AFB1最高限量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為20mg/kg[6]。因此，開發(fā)食品中黃曲霉快速檢測(cè)方法對(duì)食品安全監(jiān)控和人體健康保障具有重要意義。傳統(tǒng)的真菌毒素檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[7-8]、質(zhì)譜法[9]等，存在儀器設(shè)備昂貴、操作技術(shù)要求高、檢測(cè)費(fèi)時(shí)等不足[10-11]；近年來發(fā)展的免疫分析法雖然具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但同樣存在抗體制備繁瑣耗時(shí)、免疫反應(yīng)需要多步遞進(jìn)和反復(fù)洗滌以及成本高等缺點(diǎn)[12-14]。

核酸適配體，又稱“化學(xué)抗體”，是一種能折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，以較高親和力和特異性識(shí)別各種靶標(biāo)分子的單鏈寡核苷酸序列，通常通過體外合成技術(shù)——指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 制備獲得，無需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，合成方便且制備成本低[15-16]。作為一種新型分子識(shí)別探針，在食品安全檢測(cè)尤其是真菌毒素檢測(cè)方面受到廣泛關(guān)注和研究[17-18]。Zhu等[19]利用核酸適配體作為分子探針構(gòu)建了一種雙競(jìng)爭(zhēng)橫向測(cè)流試紙條并成功用于多種食品和飼料樣品中黃曲霉毒素的檢測(cè)。Geleta等[20]合成了一種還原氧化石墨烯/二硫化鉬/聚苯胺納米復(fù)合材料，并以此構(gòu)建了一種電化學(xué)適配體傳感器，該傳感器對(duì)AFB1具有較好的選擇性、靈敏性和穩(wěn)定性。

氧化石墨烯（graphite oxide，GO）是石墨烯的氧化產(chǎn)物，由于其合成方便、具有較好的親水性、分散性以及卓越的熒光猝滅能力，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[21-22]。本試驗(yàn)以AFB1為檢測(cè)對(duì)象，利用氧化石墨烯納米片建立一種熒光核酸適配體生物傳感器，通過優(yōu)化試驗(yàn)條件應(yīng)用于花生樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生米：市售。黃曲霉毒素核酸適配體TAF序列具體為 5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3'[23]，其 5'端標(biāo)記有四甲基羅丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）熒光基團(tuán)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化（HPLC級(jí)）。黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、伏馬菌素（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）：青島普瑞邦生物工程有限公司；氧化石墨烯水溶液：江蘇先豐納米材料科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、六水合氯化鎂：上海麥克林生化科技有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max i3多功能酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；HR-AFM原子力顯微鏡：美國AFM Workshop公司；Centrifuge 5427 R冷凍高速離心機(jī)：德國艾本德eppendorf公司；RS-FS1401多功能粉碎機(jī)：合肥榮事達(dá)小家電有限公司；PHS-25型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Medium-e400 up超純水儀：上海和泰儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 氧化石墨烯濃度優(yōu)化

分別取100 nmol/L核酸適配體溶液200 μL加入到等體積不同濃度氧化石墨烯溶液中（0、5、10、20、30、40 μg/mL）， 并用 pH7.4 的結(jié)合緩沖溶液（binding buffer，BB，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2·6H2O，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl）補(bǔ)至總體積為 500μL，使氧化石墨烯終濃度為 0、2、4、8、12、16 μg/mL，混勻后每孔取200 μL測(cè)定其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長547 nm，發(fā)射波長584 nm），試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行取平均值。所有操作均在避光條件下進(jìn)行，以不加GO為對(duì)照組。

1.3.2 核酸適配體濃度優(yōu)化

根據(jù)1.3.1結(jié)果取最佳濃度的氧化石墨烯溶液200 μL 和等體積不同初始濃度的適配體（70、80、90、100、110、120、130 nmol/L） 于 1.5 mL 棕色離心管中混合，補(bǔ)加BB緩沖溶液至500 μL，則適配體終濃度分別為 28、32、36、40、44、48、52 nmol/L。 室溫下避光孵育20 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長547 nm，發(fā)射波長584 nm），試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，取平均值。

1.3.3 孵育時(shí)間優(yōu)化

采用酶標(biāo)儀熒光動(dòng)力學(xué)模式進(jìn)行氧化石墨烯和適配體孵育時(shí)間的優(yōu)化，具體程序設(shè)置如下：延遲3 s，振板5 s，運(yùn)行時(shí)長5 min，檢測(cè)間隔20 s。取一定體積最佳濃度適配體溶液先進(jìn)行動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)5 min后，立即快速加入等體積最佳濃度氧化石墨烯溶液，然后按照上述程序進(jìn)行熒光動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。

1.3.4 檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化

最佳檢測(cè)時(shí)間同樣采用動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置程序如下：延遲3 s，振板5 s，運(yùn)行時(shí)長45 min，檢測(cè)間隔20 s。在1.3.3步驟優(yōu)化結(jié)果基礎(chǔ)上，向氧化石墨烯/適配體孵育體系中加入一定體積AFB1溶液（終濃度為0.5 μg/mL），按照上述程序進(jìn)行熒光動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。

1.3.5 檢測(cè)靈敏度分析

在優(yōu)化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別取等體積氧化石墨烯溶液和適配體溶液于1.5 mL離心管中混勻，室溫下避光孵育最佳時(shí)間后，加入100 μL一系列不同濃度AFB1（終濃度分別為 0、1、5、10、50、100、200 ng/mL），繼續(xù)混勻避光孵育最佳時(shí)間后，每孔分別取200 μL測(cè)定其熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，取平均值。記對(duì)照組（不加AFB1組）的熒光強(qiáng)度為F0，試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度為Fi。以ΔF（ΔF=Fi-F0）為縱坐標(biāo)，以AFB1濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)限。

1.3.6 特異性分析

以與AFB1結(jié)構(gòu)或功能類似的FB1、OTA、ZEN 3種真菌毒素代替靶標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)方法的特異性分析。取最佳濃度的氧化石墨烯溶液和適配體溶液各200 μL，待孵育完全后分別加入上述3種毒素（終濃度500 ng/mL）和AFB1各100 μL，室溫混勻孵育后分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度記為Fi。對(duì)照組以100 μL BB緩沖溶液代替毒素，其熒光強(qiáng)度記為F0。根據(jù)熒光強(qiáng)度變化情況ΔF（ΔF=Fi-F0）分析檢測(cè)方法的特異性。

1.3.7 樣品檢測(cè)

花生米樣品預(yù)處理參考Ye等[24]的方法進(jìn)行處理，略有改動(dòng)。將花生米樣品用粉碎機(jī)粉碎，再用研缽搗碎較大顆粒后研磨成粉末。準(zhǔn)確稱取粉末樣品5.0 g于50 mL透明離心管中，并加入25 mL 50% 甲醇溶液渦旋振蕩30 min，室溫靜置25 min后在4℃下冷凍離心20 min（5 000 r/min），收集上清液過濾后即為花生米空白提取液。在空白提取液中加入不同濃度（5、50、200 ng/mL）的AFB1溶液，充分振蕩。按照1.3.5步驟進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)所得檢測(cè)值和實(shí)際添加濃度計(jì)算回收率?；厥章拾匆韵鹿竭M(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行，熒光強(qiáng)度值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Origin 8.5軟件進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)原理

本試驗(yàn)所構(gòu)建的檢測(cè)方法原理如圖1所示。

圖1 氧化石墨烯-核酸適配體傳感器檢測(cè)原理Fig.1 Schematic presentation of graphene oxide-based fluorescence aptasensor assay

因?yàn)檠趸┍砻娲嬖谥豕倌軋F(tuán)和共軛結(jié)構(gòu)，它能夠?qū)ARMA熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體通過π-π堿基堆積作用非共價(jià)固定在氧化石墨烯表面，這樣由于熒光基團(tuán)與GO靠近而發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，適配體上的熒光被猝滅。在體系中沒有AFB1的情況下，核酸適配體仍然被吸附在GO表面，熒光強(qiáng)度基本保持不變。當(dāng)體系中存在AFB1時(shí)，由于適配體與AFB1的高親和性，使得適配體從GO上解離下來而與AFB1結(jié)合，熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離GO，從而熒光強(qiáng)度得到恢復(fù)。因此，可以根據(jù)體系熒光強(qiáng)度前后變化與AFB1濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)AFB1的檢測(cè)。

2.2 氧化石墨烯納米片表征及濃度優(yōu)化

氧化石墨烯納米片的原子力顯微鏡表征及濃度優(yōu)化結(jié)果見圖2。

圖2 GO表征及濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Characterization and concentration optimization of graphene oxide

由圖2a可以看出，氧化石墨烯呈明顯的片狀單層結(jié)構(gòu)，其平均寬度約為0.5 μm，平均厚度為2 nm，平均徑厚比為250∶1，有利于核酸適配體的吸附。

由圖2b可以看出，隨著氧化石墨烯濃度的增加，核酸適配體熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)氧化石墨烯濃度大于12 μg/mL時(shí)，核酸適配體的熒光強(qiáng)度下降不明顯，基本保持不變。這說明12 μg/mL的氧化石墨烯基本能將40 nmol/L濃度核酸適配體的熒光信號(hào)猝滅完全。因此，確定氧化石墨烯的最佳終濃度為12 μg/mL。

2.3 核酸適配體TAF濃度優(yōu)化

圖3是核酸適配體熒光強(qiáng)度在最優(yōu)氧化石墨烯濃度條件下的猝滅效果圖，即核酸適配體TAF濃度的優(yōu)化結(jié)果圖。

圖3 核酸適配體TAF濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Concentration optimization of TAF aptamer

從圖3可以看出，在氧化石墨烯濃度12μg/mL猝滅條件下，隨著核酸適配體TAF濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)適配體濃度大于36nmol/L時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增加，而當(dāng)繼續(xù)增加適配體的濃度至44 nmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度迅速上升。這說明36 nmol/L是適配體TAF的熒光被12 μg/mL濃度氧化石墨烯基本猝滅的臨界點(diǎn)。但為了確保適配體的熒光能完全被氧化石墨烯猝滅，最終確定32 nmol/L為適配體最佳終濃度。

2.4 孵育時(shí)間優(yōu)化

氧化石墨烯與核酸適配體TAF孵育時(shí)間熒光動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 氧化石墨烯猝滅適配體熒光時(shí)間動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Real-time fluorescence kinetic test of aptamer by graphene oxide

從圖4可以看出，在未加入氧化石墨烯時(shí)（前300 s），適配體的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，當(dāng)加入氧化石墨烯后，體系熒光強(qiáng)度迅速降低，至550 s后體系熒光強(qiáng)度降到最低并保持穩(wěn)定。這說明加入氧化石墨烯后，經(jīng)過約250 s后TAF適配體熒光強(qiáng)度基本被猝滅完全，即此時(shí)核酸適配體基本完全吸附在氧化石墨烯表面。因此，扣除加注氧化石墨烯時(shí)間（10 s），核酸適配體和氧化石墨烯的最佳孵育時(shí)間為240 s，即孵育4 min后可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.5 檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化

熒光動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)優(yōu)化確定最佳檢測(cè)時(shí)間結(jié)果如圖5所示。

圖5 檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Real-time fluorescence kinetic test of the detection

由圖5可以看出，在GO/適配體孵育體系中，沒有AFB1存在情況下（前5 min），由于TAMRA熒光標(biāo)記的適配體已經(jīng)被完全吸附在氧化石墨烯表面，熒光被猝滅并處于一個(gè)較低值水平；當(dāng)向體系中加入AFB1后，其熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長而不斷增強(qiáng)，當(dāng)時(shí)間達(dá)到32 min后，熒光強(qiáng)度趨于平緩，基本不再增強(qiáng)。這主要是由于核酸適配體TAF與AFB1具有較強(qiáng)的親和性，適配體逐漸被AFB1從氧化石墨烯表面解離下來而特異性結(jié)合，熒光得到增強(qiáng)。因此，當(dāng)加入待分析樣品27 min后（扣除加入樣品前5 min的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)時(shí)間），體系熒光強(qiáng)度基本不再增強(qiáng)，而趨于穩(wěn)定，可進(jìn)行樣品分析檢測(cè)?？紤]到優(yōu)化的GO/適配體最佳孵育時(shí)間4 min，因此整個(gè)方法從上樣到出檢測(cè)結(jié)果約需30 min左右，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較快。

2.6 方法性能分析及應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)曲線及特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of standard curve and specificity test

從圖6a可以看出，ΔF與AFB1濃度具有良好的對(duì)數(shù)關(guān)系，其方程為y=4 295.23lnx+5 662.90，R2=0.972 7。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得該方法的檢測(cè)限為2.37 ng/mL，檢測(cè)范圍為2.37 ng/mL～200.00 ng/mL。從圖6b可以看出，OTA、FB1和ZEN對(duì)體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)基本上無影響，說明本方法特異性較好，具有較好的選擇性。

花生實(shí)際樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 花生樣品AFB1加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery of aflatoxin B1in peanut samples

由表1可知，在3種不同加標(biāo)濃度條件下，回收率為85.0% ～114.4% ，說明本方法具有較好的回收率，可用于花生實(shí)際樣品中AFB1檢測(cè)。本方法的檢測(cè)靈敏度和回收率均低于王琦等[25]的研究結(jié)果，這可能有兩個(gè)原因，一是兩者所用的適配體序列不一致（相差3個(gè)堿基）且標(biāo)記熒光基團(tuán)不一樣；二是本試驗(yàn)所使用的是花生樣品提取液，而文獻(xiàn)使用的是白酒樣品，無需進(jìn)行提取預(yù)處理，干擾因素相對(duì)較少。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用氧化石墨烯納米片構(gòu)建了一種AFB1的熒光分析檢測(cè)方法。經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn)條件，該方法的檢測(cè)范圍為2.37 ng/mL～200.00 ng/mL，檢測(cè)限為2.37 ng/mL，能滿足日常檢測(cè)限量要求。同時(shí)該方法具有較好的選擇性，基本不受OTA、FB1、ZEN等真菌毒素存在的影響。該方法操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)耗時(shí)短，整個(gè)檢測(cè)完成只需約30 min左右時(shí)間，對(duì)花生實(shí)際樣品加標(biāo)分析，回收率為85.0% ～114.4% ，結(jié)果比較可靠，具有潛在的實(shí)際應(yīng)用前景。