電子束輻照對(duì)核桃青皮醌類物質(zhì)提取及活性的影響

何涵茜，鄒光銘，姬敏慧，張瑩瑩，馬海敏，蔡瑩瑩，羅安偉*，白俊青，蔚江濤

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.楊凌核盛輻照技術(shù)有限公司，陜西 楊凌 712100）

核桃青皮，又稱青龍衣，是胡桃科胡桃屬胡桃楸（Juglans regia L.）或胡桃的外果皮。核桃青皮廣泛地用于中醫(yī)藥領(lǐng)域，其味辛、苦、澀、平，有清熱解毒、止痢鎮(zhèn)痛等功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，核桃青皮具有抑菌、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等功效[2]。核桃青皮作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物，易破壞田間的生態(tài)平衡，造成環(huán)境污染。因此，如何有效地將這一農(nóng)業(yè)廢棄物利用在醫(yī)藥、食品、染料[3-5]等領(lǐng)域，變廢為寶顯得至關(guān)重要。

醌類物質(zhì)是核桃青皮中主要的活性物質(zhì)之一，具有抗菌[6]、抗氧化[7]及染色[3-5]作用。目前核桃青皮醌類物質(zhì)的提取方法主要有超高壓提取[8]、亞臨界水提取[9]、堿提酸沉淀法提取[10]、有機(jī)溶劑萃取法[11]、微波輔助法[12]等。以上方法存在提取率不夠高，提取不充分等問(wèn)題。超聲輔助提取具有提取效率高、時(shí)間短、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[13-14]。電子束輻照具有對(duì)環(huán)境影響小、穿透率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，且電子束輻照為低溫處理，對(duì)熱敏性活性物質(zhì)也有保護(hù)作用。利用電子束輻照對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理可以破壞植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)細(xì)胞中活性物質(zhì)的溶出，提高活性物質(zhì)的提取率[15-16]。通過(guò)電子束輻照預(yù)處理耦合超聲輔助的方法，能促進(jìn)核桃青皮中醌類物質(zhì)的提取。

本文以干燥后的核桃青皮為原料，用電子束輻照技術(shù)預(yù)處理，再用超聲輔助乙醇溶劑提取核桃青皮粉末中的醌類物質(zhì)，并對(duì)提取物的抑菌活性和抗氧化活性進(jìn)行研究，為電子束輻照技術(shù)在天然產(chǎn)物提取及核桃青皮的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮（新新2號(hào)核桃的成熟外果皮）：2020年8月25日采收自新疆阿克蘇核桃基地；胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98% ）、慶大霉素：上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；無(wú)水乙醇、水楊酸-乙醇、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、抗壞血酸（VC）（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基：北京路橋技術(shù)股份有限公司；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器設(shè)備

Spark多功能酶標(biāo)儀：奧地利Tecan Austria GmbH公司；UV-2550雙光束紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：衢州普潤(rùn)日用品有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；無(wú)菌工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BXM-30R蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DHP9025電熱恒溫生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；D2-10 MeV/20 kV高能電子直線型加速器（功率為20kW，掃描寬度80cm，額定能量為10 MeV）：陜西楊凌核盛輻照技術(shù)有限公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡：美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將成熟的核桃鮮果外果皮進(jìn)行手工剝皮，自然曬干（水分含量9.03% ），粉碎過(guò)篩（60目），得到的核桃青皮粗粉即為試驗(yàn)所需原料。

1.3.2 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以胡桃醌為標(biāo)準(zhǔn)品，研究核桃青皮中醌類物質(zhì)的得率。用60% 乙醇溶液配制濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg/mL 的胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液。對(duì)胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定吸光值最大峰處的波長(zhǎng)。以60% 乙醇溶液作為空白對(duì)照，讀取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)波長(zhǎng)處的吸光值，每個(gè)濃度重復(fù)3次，最后繪制吸光值與胡桃醌質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程。

1.3.3 醌類物質(zhì)的提取

稱取1.0 g核桃青皮粗粉，加入30 mL濃度為60% 乙醇溶液，在提取溫度60℃[17-18]，超聲功率350 W條件下提取120 min，將得到的樣品提取液離心，取上層清液。將上清液定容到50 mL，移取5 mL樣品液至25 mL容量瓶中，用60% 乙醇溶液定容至25 mL，在檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值，每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.3.4 醌類物質(zhì)得率的測(cè)定

醌類物質(zhì)得率的計(jì)算公式如下。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

在初始試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，改變乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間3個(gè)因素條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。乙醇濃度分別為30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、80% ； 料液比分別為 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）；提取時(shí)間分別為 30、60、90、120、150、180 min。按照 1.3.3 所述方法，測(cè)定醌類物質(zhì)濃度，重復(fù)3次試驗(yàn)，按照1.3.4所述公式計(jì)算醌類物質(zhì)得率，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)核桃青皮色素提取效果影響顯著的3個(gè)主要因素進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of response surface

1.3.7 電子束輻照劑量篩選試驗(yàn)

稱取核桃青皮粉末，用PE封口袋封裝，每袋100g，單層擺放在輻照托盤上，放置于傳送帶上送入輻照室進(jìn)行處理，輻照劑量分別為 10、20、30、40、50、60 kGy，每個(gè)劑量平行3次。

根據(jù)1.3.6響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)輻照劑量的單因素試驗(yàn)，將被輻照的核桃青皮粉末作為樣品，控制乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間，按照1.3.3所述方法，測(cè)定醌類物質(zhì)濃度，重復(fù)3次試驗(yàn)，按照1.3.4所述公式計(jì)算醌類物質(zhì)得率，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

用掃描電鏡對(duì)核桃青皮粉末樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察，分析電子束輻照前后核桃青皮表面組織結(jié)構(gòu)，設(shè)置電鏡的工作電壓為5 kV，放大1 600倍。

1.3.8 活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

1.3.8.1 試液的制備

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)條件下提取，提取液旋蒸濃縮得浸膏，用蒸餾水溶解浸膏。分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯溶液萃取浸膏水溶液，將萃取后得到的萃取相旋蒸至干。分別用無(wú)水乙醇將不同萃取相萃取得到的浸膏配制成5 mg/mL的乙醇溶液，備用。

1.3.8.2 DPPH·清除率

參照Ma[19]的方法，用無(wú)水乙醇稀釋試液，配制成濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的樣品溶液，配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液。向反應(yīng)管中加入1 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL DPPH溶液，充分搖勻，靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH·清除率計(jì)算公式如下。

式中：A樣品為樣品和DPPH溶液反應(yīng)測(cè)得的吸光度；A空白為用無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)得的吸光度；A對(duì)照為用蒸餾水代替DPPH溶液測(cè)得的吸光度。

1.3.8.3 ABTS＋·清除率

參照趙國(guó)超等[20]的方法，用無(wú)水乙醇稀釋試液，配制成濃度分別 0.012、0.018、0.024、0.030、0.036 mg/mL的樣品溶液。取0.0384 g ABTS定容到10 mL配制為ABTS 溶液，0.013 4 g過(guò)硫酸鉀定容到 10 mL，1∶1 混合，避光反應(yīng)12 h，使用時(shí)稀釋20倍。向反應(yīng)管中加入1 mL不同濃度的樣液和1 mL ABTS溶液，充分搖勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS＋·清除率計(jì)算公式如下。

式中：A樣品為樣品和ABTS溶液反應(yīng)測(cè)得的吸光度；A空白為用無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)得的吸光度；A對(duì)照為用蒸餾水代替ABTS溶液測(cè)得的吸光度。

1.3.8.4 ·OH清除率

參照韓春平等[21]的方法，用無(wú)水乙醇稀釋試液，配制成濃度分別 0.1、0.4、0.7、1.0、1.3 mg/mL 的樣品溶液，配制10 mmol/mL的水楊酸-乙醇溶液、10 mmol/mL的FeSO4溶液、100 mmol/mL的H2O2溶液。向反應(yīng)管中加入0.5 mL水楊酸-乙醇溶液、1 mL不同濃度的樣液、0.5 mL FeSO4溶液和3 mL蒸餾水，最后加入5 mL的H2O2溶液，啟動(dòng)芬頓反應(yīng)，充分搖勻，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照?！H清除率計(jì)算公式如下。

式中：A樣品為樣品與溶液反應(yīng)測(cè)得的吸光度；A空白為用無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)得的吸光度；A對(duì)照為用蒸餾水代替FeSO4溶液測(cè)得的吸光度。

1.3.8.5 菌懸液的制備

用移液槍吸取100μL供試菌種接種到滅菌的LB肉湯液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下連續(xù)培養(yǎng)18h進(jìn)行增菌，離心菌懸液并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，收集菌體，在菌體中加入一定量的LB肉湯液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使菌懸液在650 nm處的麥?zhǔn)媳葷岫葹?.5，此時(shí)菌懸液濃度為1×108CFU/mL。

1.3.8.6 抑菌圈的測(cè)定

抑菌試驗(yàn)采用牛津杯法，將已滅菌的LB瓊脂培養(yǎng)基在無(wú)菌條件下倒入培養(yǎng)皿中，待LB瓊脂培養(yǎng)基冷卻凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入100 μL菌懸液并涂布均勻。取滅菌的牛津杯放于涂布了試驗(yàn)菌的LB瓊脂培養(yǎng)基上，用移液槍吸取200 μL試液于牛津杯中，每個(gè)樣品重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿37℃恒溫培養(yǎng)36 h，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈的大小，取平均直徑作為試驗(yàn)結(jié)果。以慶大霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 12.0軟件處理和分析；數(shù)據(jù)顯著性分析用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著；圖表采用Origin 2021進(jìn)行制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定

根據(jù)1.3.2的方法，利用雙光束紫外分光光度計(jì)對(duì)胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果如圖1a所示，得到吸光值最大峰處的波長(zhǎng)為426 nm。在426 nm處測(cè)定不同濃度的胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，得到胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1b所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=15.179x+0.040 3，其中回歸系數(shù)R2=0.999。

圖1 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定Fig.1 Determination of quinone standards from walnut

2.2 胡桃醌提取參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 乙醇濃度對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響

乙醇濃度對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of quinones

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，醌類物質(zhì)得率呈先增加后降低趨勢(shì)，在乙醇濃度為60% 時(shí)，達(dá)到最大得率6.11 mg/g；之后隨著乙醇濃度的增大得率逐漸下降，可能是溶劑中水分越來(lái)越少，導(dǎo)致細(xì)胞通透性越來(lái)越差，細(xì)胞內(nèi)的醌類物質(zhì)向外擴(kuò)散的難度變大，同時(shí)可能因?yàn)槠渌钚晕镔|(zhì)溶出會(huì)抑制醌類物質(zhì)的溶解[12]。

2.2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on the yield of quinones

由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，醌類物質(zhì)得率呈先增加后降低趨勢(shì)，在150 min時(shí)達(dá)到最大得率6.54 mg/g；之后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，得率逐漸下降，可能是超聲波使得醌類物質(zhì)受到破壞分解，或是與其它物質(zhì)結(jié)合，使醌類物質(zhì)得率降低。

2.2.1.3 料液比對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響

料液比對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響如圖4所示。

圖4 料液比對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of quinones

由圖4可知，隨著溶液體積的增加，醌類物質(zhì)得率逐漸增大，在料液比為 1∶25（g/mL）～1∶40（g/mL）時(shí)，得率增加幅度最大，料液比在1∶40（g/mL）后得率增加不明顯，最大得率為6.57 mg/g。當(dāng)料液比達(dá)到一定值后，醌類物質(zhì)得率基本沒(méi)有明顯變化，是由于溶劑體積增大后醌類物質(zhì)基本被提取完全。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選最佳工藝組合

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，響應(yīng)面結(jié)果方差分析如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of results of response surface test

通過(guò)回歸分析，可以得到該模型的二次回歸方程，即醌類物質(zhì)得率：Y=7.66+1.21A+0.477B+1.23C-0.012 6AB+0.181 5AC-0.728 0BC-1.51A2-0.675 8B2-0.977 8C2。最佳提取條件為乙醇濃度64.4% ，料液比1∶39.93（g/mL），超聲時(shí)間 170.31 min，預(yù)測(cè)最大醌類物質(zhì)得率為8.34 mg/g。為了便于工業(yè)化操作的控制，對(duì)最佳提取條件進(jìn)行修正，得到乙醇濃度65% ，料液比1∶40（g/mL），超聲時(shí)間170 min為最優(yōu)提取條件。通過(guò)對(duì)最優(yōu)提取條件的實(shí)際操作，重復(fù)3次平行，得到醌類物質(zhì)得率為8.31 mg/g。

模型P＜0.01，說(shuō)明該模型為極顯著模型；失擬項(xiàng)P＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，因此該模型符合要求。其中該模型的R2=0.989 1，R2Adj=0.975 0，說(shuō)明該模型的擬合性較好。

各因素交互作用對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響Fig.5 Effect of interaction of various factors on the yield of quinones

通過(guò)對(duì)各因素進(jìn)行方差分析可以發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間的影響極顯著（P＜0.01），乙醇濃度的二次方、料液比的二次方、時(shí)間的二次方影響極顯著（P＜0.01），料液比和超聲時(shí)間的交互作用影響極顯著（P＜0.01）。其中各因素的影響順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞乙醇濃度＞料液比。

2.4 輻照強(qiáng)度對(duì)醌類物質(zhì)提取效果的影響

輻照強(qiáng)度對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響如圖6所示。

圖6 輻照強(qiáng)度對(duì)醌類物質(zhì)得率的影響Fig.6 Effect of radiation intensity on the yield of quinones

由圖6可知，醌類物質(zhì)的得率隨輻照劑量的增加先上升后下降，在10 kGy～30 kGy時(shí)，得率隨劑量的升高而增加。當(dāng)輻照強(qiáng)度較小時(shí)，核桃青皮細(xì)胞破裂不充分，活性物質(zhì)溶出較少，醌類物質(zhì)得率較?。惠椪諒?qiáng)度達(dá)到30 kGy時(shí)，醌類物質(zhì)的提取效果較好，得率為8.35 mg/g；而當(dāng)輻照劑量超過(guò)30 kGy時(shí)，隨著劑量的增大，醌類物質(zhì)得率反而呈逐漸下降趨勢(shì)。

核桃青皮輻照處理前后掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）如圖7所示。

圖7 核桃青皮粉末掃描電鏡圖Fig.7 SEM images of green walnut husk powder

在掃描電鏡下觀察，經(jīng)電子束輻照處理后的核桃青皮組織細(xì)胞壁出現(xiàn)微斷裂和斷裂；未輻照樣品的核桃青皮組織表面結(jié)構(gòu)相對(duì)規(guī)則、致密和交聯(lián)。在輻照劑量（30 kGy）下，核桃青皮粉末的表面微觀結(jié)構(gòu)比未輻照的樣品更加不均勻和分散。同時(shí)，隨著輻照劑量的增加，出現(xiàn)了大量的孔洞、碎片和裂紋。表明電子束輻照預(yù)處理改變了核桃青皮的內(nèi)部和表面結(jié)構(gòu)，包括孔隙度和滲透性，這能有效增強(qiáng)活性物質(zhì)的溶解，提高活性物質(zhì)得率。而當(dāng)劑量超過(guò)30 kGy時(shí)，醌類物質(zhì)得率逐漸下降，可能是過(guò)高劑量的電子束輻照對(duì)醌類物質(zhì)結(jié)構(gòu)有破壞作用，導(dǎo)致醌類物質(zhì)分解而使其含量下降，得率降低。

2.5 不同萃取相的核桃青皮提取物抗氧化活性

2.5.1 DPPH·清除率

不同萃取相活性物對(duì)DPPH·的清除作用如圖8所示。

圖8 不同萃取相活性物對(duì)DPPH·的清除作用Fig.8 Scavenging effect of active compounds in different extract phases on DPPH·

由圖8可知，核桃青皮乙醇提取液經(jīng)過(guò)不同萃取相萃取后得到的提取物有一定的DPPH·清除能力。其清除作用隨溶液濃度增大而增大，即DPPH·清除能力與提取液濃度有明顯的正相關(guān)性。其中乙酸乙酯萃取相對(duì)DPPH·的清除效果最好，最大清除率可達(dá)95.8% ，二氯甲烷和石油醚相萃取得到的溶液對(duì)DPPH·的清除效果相差不大。

2.5.2 ABTS＋·清除率

不同萃取相活性物對(duì)ABTS＋·的清除作用如圖9所示。

圖9 不同萃取相活性物對(duì)ABTS＋·的清除作用Fig.9 Scavenging effect of active compounds in different extract phases on ABTS＋·

由圖9可知，核桃青皮乙醇提取液經(jīng)過(guò)不同萃取相萃取后得到的提取物有一定的ABTS＋·清除能力。其清除作用隨溶液濃度增大而增大，即ABTS＋·清除能力與提取液濃度有明顯的正相關(guān)性。其中乙酸乙酯萃取相對(duì)ABTS＋·的清除效果最好，清除率最大可達(dá)70.7% ，二氯甲烷萃取相對(duì)ABTS＋·的清除效果次之，清除率最大達(dá)57.7% ，石油醚萃取相對(duì)ABTS＋·的清除效果最差，清除率最大僅43.2% 。

2.5.3 ·OH清除率

不同萃取相活性物對(duì)·OH的清除作用如圖10所示。

圖10 不同萃取相活性物對(duì)·OH的清除作用Fig.10 Scavenging effect of active compounds in different extract phases on·OH

由圖10可知，核桃青皮乙醇提取液經(jīng)過(guò)不同萃取相萃取后得到的提取物有一定的·OH清除能力，但總體效果不理想。其清除作用隨溶液濃度增大而增大，即·OH清除能力與提取液濃度有明顯的正相關(guān)性。其中石油醚萃取相對(duì)·OH的清除效果較差，最大為13.2% ，二氯甲烷和乙酸乙酯萃取相對(duì)·OH的清除效果相對(duì)較好，但相差不大，清除率最大分別為30.3% ，27.7% 。

2.5.4 不同萃取相的核桃青皮提取物抗氧化活性分析

由于石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯極性逐漸增大，萃取得到的物質(zhì)極性也逐漸增大。據(jù)“相似相溶”原理，核桃青皮中抗氧化有效成分應(yīng)多為極性較大的物質(zhì)，易溶解在極性大的溶劑中，所以乙酸乙酯層抗氧化能力突出[22]。極性大的有機(jī)萃取物的結(jié)構(gòu)中可能含有較多的羥基，由于羥基具有天然的抗氧化活性，核桃青皮中不同極性部位的抗氧化活性與其中天然物質(zhì)的成分含量相關(guān)，而梯度萃取實(shí)現(xiàn)了核桃青皮乙醇提取物中抗氧化成分的富集，使核桃青皮乙醇提取物中具有抗氧化作用的成分主要集中在乙酸乙酯部位，從而導(dǎo)致乙酸乙酯相的抗氧化活性較強(qiáng)[23]。

2.6 不同萃取相的核桃青皮提取物抑菌活性

核桃青皮提取物的抑菌活性結(jié)果如表4所示。

表4 不同萃取相抑菌效果比較Table 4 Comparison of antibacterial effects of different extraction phases

由表4可知，核桃青皮乙醇提取液經(jīng)不同有機(jī)相萃取后得到的活性物質(zhì)均有一定的抑菌活性。不同萃取相對(duì)大腸桿菌的抑菌活性強(qiáng)弱依次為乙酸乙酯相>石油醚相>二氯甲烷相，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性強(qiáng)弱依次為乙酸乙酯相>石油醚相>二氯甲烷相，對(duì)沙門氏菌的抑菌活性強(qiáng)弱依次為乙酸乙酯相>二氯甲烷相>石油醚相，對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性強(qiáng)弱依次為乙酸乙酯相>石油醚相>二氯甲烷相。其中乙酸乙酯相的抑菌效果最好，尤其是對(duì)大腸桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)（13.81±0.42）mm。核桃青皮乙醇提取液經(jīng)不同有機(jī)相萃取后得到的活性物質(zhì)抑菌活性不同是由于不同的萃取相，萃取出來(lái)的活性物質(zhì)不一樣，石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯的極性逐漸增大，萃取出來(lái)的物質(zhì)極性也逐漸增大，從而對(duì)不同的細(xì)菌有不同的抑菌效果。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)核桃青皮提取條件的研究表明，電子束輻照耦合超聲輔助提取核桃青皮醌類物質(zhì)的適宜參數(shù)為核桃青皮粉碎60目，電子束輻照劑量30 kGy，乙醇濃度 65% ，料液比 1∶40（g/mL），超聲時(shí)間 170 min，此條件下醌類物質(zhì)得率達(dá)到8.35 mg/g。通過(guò)對(duì)核桃青皮乙醇提取液經(jīng)過(guò)不同萃取相萃取后得到的提取物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)得到，65% 乙醇提取物的不同有機(jī)溶劑萃取相活性物均有一定抗氧化能力，能清除DPPH·、ABTS＋·、·OH，且乙酸乙酯相萃取物的抗氧化活性最強(qiáng)，對(duì) DPPH·、ABTS＋·、·OH 的清除率分別達(dá) 95.8% ，70.7% 和27.7% ；不同萃取相活性物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌均有一定的抑制效果，其中乙酸乙酯相的抑菌效果最好，尤其是對(duì)大腸桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)（13.81±0.42）mm。適宜劑量的電子束輻照預(yù)處理能有效破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)活性物質(zhì)溶出，提高活性物質(zhì)提取效率，在天然產(chǎn)物提取中具有較好的應(yīng)用前景。核桃青皮醌類等活性物質(zhì)具有較好的抑菌和抗氧化活性，在開(kāi)發(fā)為抑菌劑及抗氧化劑等綜合利用上具有良好的潛力。