鹿茸菇多糖對小鼠抗疲勞能力的影響

李欣

（天津師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

鹿茸菇（Lyophyllum decastes）又名荷葉蘑、荷葉離褶傘，屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、離褶傘屬，主要分布在我國黑龍江、吉林、四川、云南、青海等地，是非常珍貴的藥食兩用食用真菌，味道鮮美、營養(yǎng)豐富[1-2]。鹿茸菇中富含氨基酸，其中必需氨基酸的比例很高，脂肪含量很低，而且還含有人體必需的維生素和微量元素，具有多種功效，包括降血脂、降血壓、預(yù)防糖尿病、抗腫瘤、抗炎和抗過敏等[3-5]。Miura等[6]研究發(fā)現(xiàn)鹿茸菇多糖可改善高胰島素血癥小鼠胰島素功能、降低血糖水平；Ukawa等[7-8]通過高脂血癥大鼠攝入鹿茸菇發(fā)現(xiàn)，鹿茸菇可以促進大鼠膽汁酸分泌、降低血清總膽固醇含量；體內(nèi)生長肉瘤細胞的小鼠攝入鹿茸菇，可降低肉瘤細胞活性、抑制細胞增殖；Pushpa等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹿茸菇對培養(yǎng)基中7種細菌和5種真菌具有抑菌作用；Nakamura等[10]對小鼠攝入鹿茸菇多糖后進行X射線照射，發(fā)現(xiàn)放射的副作用有效降低。近年來國內(nèi)對鹿茸菇營養(yǎng)價值、活性成分的研究逐漸興起，但相關(guān)資料較少[11]。本研究從鹿茸菇中分離純化鹿茸菇多糖，對力竭運動小鼠進行鹿茸菇多糖干預(yù)，分析鹿茸菇多糖對抗氧化和抗運動性疲勞的作用，為鹿茸菇多糖功能性產(chǎn)品的研發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明小鼠[雄性，5周齡]：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；鹿茸菇：江蘇江南生物科技公司；紅景天：廣州賽健生物科技有限公司。

葡萄糖（glucose，GLU）含量檢測試劑盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）含量檢測試劑盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性檢測試劑盒、肝/肌糖原測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性檢測試劑盒、鈉鉀三磷酸腺嘌呤核苷酸酶（Na+K+-adenosine triphosphatase，Na+K+-ATPase）活性檢測試劑盒、鈣鎂三磷酸腺嘌呤核苷酸酶（Ca2+Mg2+-adenosine triphosphatase，Ca2+Mg2+-ATPase）活性檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

血液分析儀（LH750）：美國貝克曼庫爾特有限公司；勻漿機（FSH-2）：江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；全自動生化分析儀（iMagic-M7）：深圳市庫貝爾生物科技有限公司；真空冷凍干燥機（ALPHA 1-2 LD plus）：德國Christ公司；小鼠恒溫游泳池（JD-XSC）：上海繼德教學(xué)實驗器械廠；分析天平（FA1204T）：廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司；高速臺式離心機（TGL-20B）：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 鹿茸菇多糖的配制

將鹿茸菇置于50℃烘箱中干燥至恒重，用粉碎機粉碎至100目，按料液比1∶20（g/mL）加入85% 乙醇，在70℃下水浴8 h，重復(fù)處理至溶液無顏色，將樣品脫脂后，于50℃烘箱中烘干至恒重。將樣品置于料液比1∶26（g/mL）、89 ℃下蒸餾水中浸提 3 h，得到鹿茸菇粗多糖浸提液，浸提后7 000 r/min離心10 min，取上清液，按體積比1∶4加入無水乙醇，靜置24 h，去除蛋白質(zhì)，7 000 r/min離心10 min得沉淀物。依次用DEAE cellulose-52色譜、DEAE-FF凝膠色譜層析法和超凈水透析法分離純化粗多糖，經(jīng)冷凍干燥得到鹿茸菇多糖（Lyophyllum decastes polysaccharides，LDP）[12-13]。

1.3.2 動物分組與灌胃

50只小鼠在正常條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機分為5組（每組10只），分別為鹿茸菇多糖低劑量組[LDPL組，100 mg/（kg·d）]、鹿茸菇多糖中劑量組[LDPM組，200 mg/（kg·d）]、鹿茸菇多糖高劑量組[LDPH組，400 mg/（kg·d）]、陽性對照組[AG組，200 mg/（kg·d）]、空白對照組（BC組，等劑量蒸餾水），連續(xù)灌胃30 d。

1.3.3 小鼠負(fù)重游泳實驗

小鼠末次灌胃40 min后，在小鼠尾部固定一質(zhì)量為小鼠體重5% 的鉛條，將小鼠置于水深30 cm的游泳箱中游泳，水溫控制在（26.0±0.5）℃，記錄自游泳開始至鼻孔10 s不能浮出水面的時間，即小鼠負(fù)重游泳力竭時間。

1.3.4 血清、肌組織和肝組織的采集與制備

小鼠力竭運動后，眼球取血，在4℃下3 500 r/min離心15 min制備血清，取上清液置于試管中，-20℃保存。取血后小鼠脫頸處死，取其后腿肌肉和肝臟，分別用生理鹽水漂洗3遍，用濾紙吸干后，稱量0.5 g標(biāo)本加入4.5 mL生理鹽水，將其置于勻漿機中低溫粉碎勻漿，轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心15 min，取上清液于試管中，-20℃保存。

1.3.5 小鼠運動疲勞相關(guān)生化指標(biāo)檢測

將制備的血清用于檢測血清葡萄糖、血清乳酸、尿素氮含量和乳酸脫氫酶活性，肌組織液用于檢測肌糖原含量，肝組織液用于檢測肝糖原、丙二醛含量及谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、鈉鉀三磷酸腺嘌呤核苷酸酶、鈣鎂三磷酸腺嘌呤核苷酸酶活性，指標(biāo)檢測方法均按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0軟件，統(tǒng)計結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動時間的影響

力竭運動時長是運動能力最客觀、最直接的表現(xiàn)，實驗期間鹿茸菇多糖對小鼠負(fù)重游泳力竭時間的影響見圖1。

圖1 鹿茸菇多糖對小鼠負(fù)重游泳力竭時間的影響（n=10）Fig.1 Effect of Lyophyllum decastes polysaccharides on the exhaustive weight-loading swimming time in mice（n=10）

由圖1可知，鹿茸菇多糖各劑量組和空白對照組比較，小鼠負(fù)重游泳力竭的時間顯著延長（P＜0.05），鹿茸菇多糖低、中、高劑量組分別延長42.1% 、52.6% 、61.2% ，陽性對照組延長53.1% 。隨鹿茸菇多糖劑量的增加，小鼠負(fù)重游泳力竭的時間延長；鹿茸菇多糖各劑量組與陽性對照組比較，小鼠負(fù)重游泳力竭時間無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗結(jié)果表明鹿茸菇多糖具有提高運動耐力的作用。

2.2 鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后肌糖原和肝糖原儲備的影響

運動過程中，肌糖原和肝糖原分解為機體提供能量，能源物質(zhì)的儲備直接影響運動能力，實驗期間鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后肌糖原和肝糖原儲備的影響見圖2。

圖2 鹿茸菇多糖對小鼠肌糖原和肝糖原含量的影響（n=10）Fig.2 Effect of Lyophyllum decastes polysaccharides on the content of muscle glycogen and liver glycogen in mice（n=10）

由圖2可知，鹿茸菇多糖各劑量組和空白對照組比較，小鼠力竭運動后肌糖原和肝糖原儲備顯著增加（P＜0.05），鹿茸菇多糖低、中、高劑量組肌糖原含量分別增加13.3% 、24.8% 、29.5% ，陽性對照組肌糖原含量增加28.6% ，肝糖原含量低、中、高劑量組和陽性對照組分別增加21.9% 、34.7% 、39.9% 、36.9% 。隨鹿茸菇多糖干預(yù)劑量的增加，肌糖原和肝糖原的含量也隨之增加。鹿茸菇多糖各劑量組與陽性對照組比較，無明顯差異，表明鹿茸菇多糖可有效提高體內(nèi)肝糖原和肌糖原的儲備。

2.3 鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后血清葡萄糖、血乳酸、尿素氮含量和乳酸脫氫酶活性的影響

機體在力竭運動過程中，血中葡萄糖被消耗，血乳酸和尿素氮水平會增加，圖3為實驗期間鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后血清葡萄糖、血乳酸、尿素氮含量和乳酸脫氫酶活性的影響。

圖3 鹿茸菇多糖對小鼠血清葡萄糖、血乳酸、尿素氮含量和乳酸脫氫酶活性的影響（n=10）Fig.3 Effect of Lyophyllum decastes polysaccharides on GLU，BLA，BUN and LDH of serum in mice（n=10）

由圖3可知，鹿茸菇多糖各劑量組和空白對照組比較，小鼠力竭運動后血清中GLU含量和LDH活性顯著增加（P＜0.05），BLA和BUN含量顯著降低（P＜0.05）。鹿茸菇多糖低、中、高劑量組和陽性對照組血清GLU含量分別升高12.1% 、21.7% 、24.2% 、20.9% ，血清LDH活性分別升高14.9% 、25.1% 、31.2% 、23.9% ，BLA含量分別降低10.6% 、17.1% 、21.0% 、15.9% ，BUN含量分別降低18.9% 、28.8% 、32.7% 、24.5% 。隨鹿茸菇多糖劑量的增加，小鼠血清GLU含量、LDH活性明顯升高，BLA和BUN含量明顯降低。鹿茸菇多糖各劑量組與陽性對照組比較，各項指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異。以上數(shù)據(jù)表明鹿茸菇多糖具備緩解運動性疲勞的能力。

2.4 鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后肝組織抗氧化指標(biāo)的影響

力竭運動過程中機體產(chǎn)生大量自由基，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)容易出現(xiàn)失衡現(xiàn)象，實驗期間鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后肝組織抗氧化指標(biāo)的影響見圖4。

圖4 鹿茸菇多糖對小鼠肝組織抗氧化效果的影響（n=10）Fig.4 Effect of Lyophyllum decastes polysaccharides on antioxidation of liver tissue in mice（n=10）

由圖4可知，鹿茸菇多糖各劑量組和空白對照組比較，小鼠力竭運動后肝組織中SOD活性顯著升高（P＜0.05），鹿茸菇多糖低、中、高劑量組和陽性對照組分別升高11.5% 、18.2% 、27.6% 、20.7% ；CAT活性顯著升高（P＜0.05）， 各組分別升高14.2% 、25.5% 、27.5% 、26.8% ；GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05），各組分別升高 16.7% 、27.3% 、30.6% 、29.2% 。力竭運動后小鼠SOD、CAT和GSH-Px的活性，隨鹿茸菇多糖干預(yù)劑量的增加而升高。與空白對照組比較，鹿茸菇多糖低、中、高劑量組和陽性對照組MAD含量顯著降低（P＜0.05），各組分別降低13.9% 、20.8% 、26.9% 、26.2% ，隨鹿茸菇多糖干預(yù)劑量的增加，MAD含量降低越明顯。鹿茸菇多糖各劑量組與陽性對照組比較，各項指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異。以上實驗結(jié)果表明鹿茸菇多糖具備較強的抗氧化能力。

2.5 鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase的影響

Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase對能量代謝具有重要作用，機體在力竭運動過程中，這兩種酶的活性容易失衡。實驗期間鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后肝組織Na+K+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性的影響見圖5。

圖5 鹿茸菇多糖對小鼠力竭運動后Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性的影響（n=10）Fig.5 Effect of Lyophyllum decastes polysaccharides on activities of Na+K+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase in mice（n=10）

由圖5可知，鹿茸菇多糖各劑量組和陽性對照組與空白對照組比較，小鼠力竭運動后肝組織中Na+K+-ATPase和 Ca2+Mg2+-ATPase活性顯著增加（P＜0.05），鹿茸菇多糖低、中、高劑量組Na+K+-ATPase活性分別增加12.5% 、24.1% 、26.7% ，陽性對照組增加23.4% ，與鹿茸菇多糖中劑量組相當(dāng)；Ca2+Mg2+-ATPase活性低、中、高劑量組和陽性對照組分別增加16.1% 、21.8% 、23.2% 、22.5% 。隨鹿茸菇多糖干預(yù)劑量的增加，Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性明顯升高。與陽性對照組比較，鹿茸菇多糖各劑量組該酶活性無顯著差異，結(jié)果表明鹿茸菇多糖可有效提高能量代謝酶的活性。

3 討論與結(jié)論

運動性疲勞是機體在力竭運動中產(chǎn)生的自我保護的生理現(xiàn)象，其發(fā)生的機制尚未定論，可能與能源物質(zhì)耗竭、代謝產(chǎn)物堆積、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)、大腦皮質(zhì)保護性抑制、自由基損傷等因素有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸菇多糖可有效延長小鼠負(fù)重游泳力竭時間，隨攝入劑量的增加，效果越明顯，分析其原因，鹿茸菇多糖可增加小鼠負(fù)重游泳后肝糖原、肌糖原、血清中葡萄糖的含量，高劑量組分別提高39.9% 、29.5% 、24.2% ，提高能源儲備能夠有效地保障能源供給，提高小鼠運動耐力[15-16]；而且鹿茸菇多糖提高供能酶鈉鉀三磷酸腺嘌呤核苷酸酶和鈣鎂三磷酸腺嘌呤核苷酸酶的活性，該酶可使細胞膜兩側(cè)Na+/K+和Ca2+/Mg2+正常運輸，維持膜電位的均衡，催化ATP供能，使機體供能代謝保持較高水平，延緩游泳力竭的時間[17]；同時，鹿茸菇多糖可減少代謝產(chǎn)物乳酸和尿素氮的堆積，高劑量組分別降低21.0% 和32.7% 。乳酸可使H+濃度升高、pH值降低，加速疲勞的產(chǎn)生[18]，鹿茸菇多糖可提高乳酸脫氫酶的活性，高劑量組提高31.2% ，加速乳酸分解，降低乳酸含量[19]；而且能源儲備增加，減少了蛋白質(zhì)分解供能，尿素氮的產(chǎn)生也相應(yīng)降低，有效地控制代謝產(chǎn)物的含量[20-21]。在力竭運動中，機體產(chǎn)生大量的活性氧，高濃度活性氧可導(dǎo)致細胞氧化損傷及細胞凋亡，加速疲勞的產(chǎn)生[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸菇多糖可有效提高抗氧化酶系統(tǒng)活性[23]，高劑量組谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性分別提高30.6% 、27.6% 、27.5% ；同時降低丙二醛的含量，丙二醛是反映機體過氧化程度的重要指標(biāo)[24]，鹿茸菇多糖高劑量組可顯著降低丙二醛的含量（26.9% ）。鹿茸菇多糖通過提高抗氧化酶系統(tǒng)的活性，清除了體內(nèi)過剩的活性氧，減少其對細胞的損傷，有效延緩疲勞的產(chǎn)生[25]。

綜上所述，鹿茸菇多糖可有效延長小鼠負(fù)重游泳力竭時間，增加體內(nèi)肝糖原和肌糖原的能源儲備、提高能源代謝酶鈉鉀三磷酸腺嘌呤核苷酸酶和鈣鎂三磷酸腺嘌呤核苷酸酶的活性，增加谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，降低乳酸、尿素氮和丙二醛的含量，有效提高機體的抗疲勞、抗氧化能力。