豬鏈球菌在呼吸道上皮細(xì)胞中感染特性的研究

張 浩，楊 巍

（1.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是球形革蘭氏陽(yáng)性菌。由S.suis感染引起的豬鏈球菌病是一種非常重要的人獸共患傳染病，在全世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，不僅嚴(yán)重制約了全球范圍內(nèi)生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，也給人類的公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了巨大的隱患[1-2]。S.suis作為一種條件致病菌，廣泛存在于豬呼吸道、消化道和生殖道中，其中呼吸系統(tǒng)是鏈球菌感染的重要靶器官，可以引起肺炎、腦炎、關(guān)節(jié)炎等多系統(tǒng)疾病[3]。但是，目前S. suis在呼吸系統(tǒng)中的感染特性和致病機(jī)制仍不清楚，鏈球菌定植的靶細(xì)胞及吸附特性也有待進(jìn)一步研究。呼吸道上皮作為呼吸系統(tǒng)重要組成部分，是多種呼吸道病原體感染的靶器官。其組成主要包括纖毛細(xì)胞、粘液生成細(xì)胞和基底細(xì)胞。有研究表明，不同的呼吸道病原體利用不同的靶細(xì)胞感染呼吸道上皮細(xì)胞：例如，A 型流感病毒主要感染纖毛細(xì)胞也可以感染粘液生成細(xì)胞[4]；人呼吸道合胞體病毒不僅能夠感染纖毛細(xì)胞而且還能夠感染基底細(xì)胞，從而影響呼吸道上皮細(xì)胞的修復(fù)和分化功能[5]。

本研究建立了兩種豬呼吸系統(tǒng)體外培養(yǎng)體系：豬肺組織精細(xì)切片（Precision-cut lung slices，PCLS）和上皮細(xì)胞氣液培養(yǎng)體系（Gas-liquid interface，ALI）。PCLS 是一種肺組織的原代培養(yǎng)體系，在肺組織精細(xì)切片中所有細(xì)胞均處于原生位置。因此，PCLS 為觀察肺臟組織的組織學(xué)結(jié)構(gòu)、呼吸道收縮功能、揭示呼吸道病原體在肺組織中的感染特性提供了一種有用的研究模型[6]。ALI 是模擬呼吸道上皮的原代細(xì)胞培養(yǎng)體系，在空氣-液體界面條件下培養(yǎng)的原代呼吸道上皮細(xì)胞能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為杯狀細(xì)胞、非纖毛和纖毛上皮細(xì)胞等不同亞型細(xì)胞的呼吸道上皮細(xì)胞[7]，與常規(guī)細(xì)胞系相比，ALI 培養(yǎng)體系不僅是分析呼吸道上皮功能的優(yōu)秀模型，也是研究病原體感染機(jī)制的有效技術(shù)平臺(tái)。在2019 年暴發(fā)的新冠病毒的研究中，Hoffmann 等科學(xué)家利用人呼吸系統(tǒng)體外培養(yǎng)體系鑒定出新型冠狀病毒SARS-CoV-2 的S 蛋白能夠利用上皮細(xì)胞的跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS2）感染呼吸道上皮細(xì)胞[8]。

細(xì)菌的吸附與定植過(guò)程是其成功感染宿主的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究利用構(gòu)建的上述兩種豬呼吸系統(tǒng)體外培養(yǎng)體系，分析了S. suis在呼吸系統(tǒng)的感染特性，鑒定了S.suis主要感染的靶細(xì)胞和吸附特點(diǎn)，為今后S. suis在呼吸系統(tǒng)的感染研究提供平臺(tái)和基礎(chǔ)，為闡明S.suis在豬呼吸系統(tǒng)中的致病機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料3 月齡SPF 豬購(gòu)自達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Promega 公司；DMEM 和1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、β-微管蛋白抗體和羊抗兔IgG-FITC 購(gòu)自Sigma 公司；胎牛血清購(gòu)自Clark 公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所診斷中心；卡那霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鏈球菌10 型菌株及anti-S. suis多抗由本實(shí)驗(yàn)室保存；上皮細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自Lonza 公司；上皮細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)自Corning 公司。

1.2 PCLS 的制備及S. suis感染后的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[9]，取3 月齡SPF 豬的新鮮肺臟組織，分別分離5個(gè)肺小葉，將1%的低熔點(diǎn)瓊脂溶液注入到新鮮健康的肺小葉中。待瓊脂凝固后，將豬肺小葉制備成適當(dāng)大小的組織塊，然后用活組織切片機(jī)制備精細(xì)切片并培養(yǎng)于24 孔板中，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察纖毛擺動(dòng)情況，選取纖毛活性良好的PCLS 用于后續(xù)試驗(yàn)。制備的PCLS 用含有抗生素的DMEM 培養(yǎng)基處理24 h，再用無(wú)抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將S. suis接種到PCLS 上并培養(yǎng)4 h（1.0×107cfu/孔）。孵育4 h 后洗去未吸附的細(xì)菌，用PBS 洗3 次后，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，分別以cy3-β-微管蛋白抗體（1：300）和anti-S. suis多抗（1：200）為一抗，羊抗兔IgG-FITC（1：500）為二抗，經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）檢測(cè)。

1.3 豬呼吸道上皮纖毛細(xì)胞的制備及S. suis感染后的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[10]，分離新鮮的原代豬呼吸道上皮細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)小室中培養(yǎng)，培養(yǎng)小室的上部和下部均加入新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)小室內(nèi)的細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，去除半透膜上部的培養(yǎng)液，讓細(xì)胞處于氣-液條件下培養(yǎng)3 周～4 周。待上皮細(xì)胞分化良好后，可用光學(xué)顯微鏡觀察纖毛分化程度，當(dāng)纖毛分化達(dá)到60%時(shí)，該上皮細(xì)胞即為高度分化的豬呼吸道上皮細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

分離的上皮細(xì)胞在氣-液條件下培養(yǎng)4 周以后，選取上皮細(xì)胞纖毛分化超過(guò)60%的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，用針頭小心在部分上皮細(xì)胞表面劃出創(chuàng)面，人為造成損傷，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后用1.0×107cfu 的S. suis感染損傷和未損傷的上皮細(xì)胞ALI 培養(yǎng)體系的基頂側(cè)，孵育4 h 后棄去未吸附的細(xì)菌，用PBS 洗3 次。感染后的上皮細(xì)胞ALI 培養(yǎng)物保持在氣-液培養(yǎng)條件下，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別以cy3-β-微管蛋白抗體（1：300）和anti-S. suis多抗（1：200）為一抗，羊抗兔IgG-FITC（1：500）為二抗，經(jīng)IFA 檢測(cè)。

1.4 掃描電鏡檢測(cè)S. suis在ALI 培養(yǎng)體系中的吸附特性為更直觀的鑒定S. suis在上皮細(xì)胞ALI 培養(yǎng)體系中的吸附特性，本研究分別選取1.3 中S.suis感染后的上皮細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[11]，利用戊二醛預(yù)固定24 h，鋨酸處理2 h，乙醇脫水，使用臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥，采用離子濺射鍍膜法對(duì)樣品進(jìn)行導(dǎo)電處理后在掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 S. suis在PCLS 中定植的IFA 檢測(cè)結(jié)果PCLS是一種原代肺組織體外培養(yǎng)體系，既包含肺組織也包含支氣管，在PCLS 中所有細(xì)胞均處于原生位置，與自然機(jī)體保持一致。利用PCLS 研究S.suis在肺組織中感染24 h 后的吸附情況，結(jié)果顯示，S. suis能夠感染PCLS，并且在感染24 h 后能夠檢測(cè)到大量的S.suis吸附在支氣管管腔表面，其中紅色標(biāo)記的上皮細(xì)胞指示的是支氣管上皮管腔表面，綠色標(biāo)記的是S.suis菌體（圖1A、圖1B）。表明，S.suis能夠吸附、定植于支氣管上皮細(xì)胞表面，也證實(shí)PCLS培養(yǎng)體系能夠應(yīng)用于S.suis在肺組織及支氣管中感染特性的研究。

圖1 S.suis（綠）感染PCLS中纖毛上皮細(xì)胞（紅）的IFA檢測(cè)Fig.1 Detection of S.suis(green)infection on ciliated epithelial cells(red)by immunofluorescence staining

2.2 S. suis在ALI 中吸附定位的IFA 檢測(cè)結(jié)果本研究建立了豬呼吸道支氣管上皮纖毛細(xì)胞ALI 培養(yǎng)體系，利用該體系分析S.suis在支氣管上皮細(xì)胞中的吸附特性。ALI 是能夠模擬呼吸道上皮屏障結(jié)構(gòu)的原代細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。在空氣-液體界面條件下培養(yǎng)的原代呼吸道上皮細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化為不同種類的呼吸道上皮細(xì)胞，比如杯狀細(xì)胞、非纖毛和纖毛上皮細(xì)胞等[7]。有報(bào)道稱，S. suis可以通過(guò)皮膚的傷口感染宿主，并引起多系統(tǒng)疾病[12]。因此，在上皮纖毛細(xì)胞ALI 培養(yǎng)體系中，用針頭在分化四周的細(xì)胞表面劃出創(chuàng)面，人為造成上皮細(xì)胞損傷后，利用S. suis感染正常的或者受損的上皮纖毛細(xì)胞ALI 培養(yǎng)物，經(jīng)IFA 檢測(cè)，結(jié)果顯示，S. suis能夠吸附于上皮纖毛細(xì)胞表面，主要吸附于纖毛細(xì)胞表面（圖2A，紅色顯示為纖毛細(xì)胞，綠色顯示S. suis菌體）。由于纖毛細(xì)胞的纖毛中含有豐富的微管蛋白，因此抗β-微管蛋白抗體能夠特異性鑒定纖毛細(xì)胞。創(chuàng)傷細(xì)胞感染試驗(yàn)顯示受損細(xì)胞處的細(xì)菌數(shù)明顯高于未損傷細(xì)胞表面吸附的細(xì)菌數(shù)（圖2B），上皮細(xì)胞的細(xì)胞核被標(biāo)記為藍(lán)色（圖2C、圖2D）。表明S. suis更容易定植于受損傷的ALI 細(xì)胞創(chuàng)面周圍，進(jìn)一步證實(shí)上皮細(xì)胞損傷能夠促進(jìn)S.suis的吸附作用。

圖2 S.suis吸附在ALI中的纖毛細(xì)胞及損傷的上皮組織周圍的IFA檢測(cè)Fig.2 Decetion of adherence of S.suis to ciliated cells and around injured epithelial tissue of ALI culture by immunofluorescence staning

2.3 S. suis在ALI 培養(yǎng)體系中吸附特性的掃描電鏡觀察結(jié)果在上述基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步通過(guò)掃描電鏡技術(shù)鑒定了S. suis在上皮細(xì)胞ALI 培養(yǎng)體系中的吸附特性，結(jié)果顯示，S. suis呈長(zhǎng)鏈狀吸附在纖毛上皮細(xì)胞的纖毛表面（圖3 紅色箭頭所示）。

圖3 S.suis吸附在纖毛細(xì)胞纖毛表面（箭頭指示吸附的S.suis）的電鏡檢測(cè)Fig.3 Decetion of adherence of S.suis to ciliated cells(Arrow indicates attached S.suis)by scanning electron microscopy

呼吸系統(tǒng)利用纖毛細(xì)胞的擺動(dòng)功能和黏液生成細(xì)胞分泌的黏液共同執(zhí)行自潔功能，將呼吸道黏液吸附的病原微生物排出呼吸系統(tǒng)。細(xì)菌吸附與定植的過(guò)程是其成功感染宿主的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當(dāng)細(xì)菌感染呼吸系統(tǒng)并干擾宿主的自潔功能時(shí)，將會(huì)增加細(xì)菌在宿主體內(nèi)定植的能力，從而增加細(xì)菌的致病力。本研究電鏡觀察結(jié)果表明，S. suis吸附在纖毛表面不利于呼吸系統(tǒng)清除該菌，宿主不能利用纖毛-黏液清除功能將S. suis清除出機(jī)體，反而增加了S. suis在支氣管上皮中定植的能力。

本研究利用兩種呼吸系統(tǒng)體外培養(yǎng)體系進(jìn)行了S. suis在呼吸系統(tǒng)中的感染特性，首次直觀地鑒定了S. suis主要感染的靶細(xì)胞為支氣管上皮纖毛細(xì)胞，并且利用掃描電鏡首次證明了S.suis在纖毛細(xì)胞中吸附的位置為纖毛表面。該研究結(jié)果說(shuō)明當(dāng)S.suis感染呼吸系統(tǒng)時(shí)，宿主不能通過(guò)纖毛的自潔功能將其清除體外。本研究為闡明S.suis在豬呼吸系統(tǒng)中的致病性提供數(shù)據(jù)支持，為今后鏈球菌在呼吸系統(tǒng)的感染的研究提供平臺(tái)和基礎(chǔ)。