河北地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒的遺傳變異分析

何云鳳，趙鴻潔，郭霄慧，賈青輝，李蘊(yùn)玉，李佩國

（河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004）

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的高度傳染性的家禽疾病，IBV 屬于冠狀病毒科、γ 冠狀病毒屬，有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，可在呼吸道、腎、生殖和消化系統(tǒng)的各種組織上皮細(xì)胞中復(fù)制，從而侵害呼吸、消化道和泌尿生殖系統(tǒng)[1]。IBV 是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，Hawn 于1931 年首次報(bào)道了該病毒，并認(rèn)為其是引起雞呼吸急促、精神沉郁的“一種新的雞呼吸道疾病”[2]。1956 年Jungherr 等報(bào)道感染IBV 的Conn 株與Mass 株的病雞表現(xiàn)出相似的癥狀，但兩者之間不能提供交叉保護(hù)，由此證明IBV 存在多種血清型[3]。1972 年鄺榮祿等首次報(bào)道我國廣東省存在IBV[4]，隨后IB 在我國開始流行并對我國養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

IBV 編碼纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）、小膜蛋白（E）及15 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。S 蛋白又稱纖突蛋白，可裂解為S1 和S2 兩個(gè)亞基。S1 亞基攜帶受體結(jié)合位點(diǎn)，決定S 蛋白的主要抗原決定簇，影響病毒的組織嗜性與毒力[5]。S1 蛋白是中和性抗體和特異性抗體的主要誘導(dǎo)劑，同時(shí)在保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要作用[6]。此外S1 基因的突變及重組對IBV新基因型、血清型及突變株的出現(xiàn)起決定性作用[7]，因此主要基于S1 基因分析IBV 變異的遺傳、變異等[8]。目前多采用Valastro 等制定的IBV 分型系統(tǒng)[9]，基于全長IBV S1 基因分為GI～GVII 7 個(gè)基因型，涉及36 個(gè)分支，其中GI 基因型包括GI-1～GI-29 共計(jì)29個(gè)分支，GI-1 基因型又稱為Mass 型（H120、M41、Ma5 株），GI-13 基因型又稱為793B 型（4/91、CR88株），GI-19 基因型又稱為QX 型（LX4 株）；GII 基因型包括GII-1 和GII-2；GIII～GVII 分別包括GIII-1、GIV-1、GV-1、GVI-1、GVII-1。

研究顯示，國內(nèi)主要流行QX 型、4/91 型、LDT3型、Mass 型IBV[10-11]，且病毒間的重組現(xiàn)象非常普遍，因而導(dǎo)致病毒的不斷進(jìn)化[12]。為此，本研究通過對河北省主要養(yǎng)雞地區(qū)疑似IB 的病例進(jìn)行病毒的分離及鑒定，并對分離病毒的S1 基因序列進(jìn)行同源性及其編碼氨基酸序列的比對分析，為了解河北地區(qū)IBV 的遺傳演化特征及IB 的防控和疫苗的選擇提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料SPF 雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；2×EsTaqMasterMix 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；IBV、新城疫病毒（NDV）、禽白血病病毒（ALV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）核酸由本實(shí)驗(yàn)保存；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；pMD18-T 載體、DNA 連接酶、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購自寶生物工程（大連）有限公司；第一鏈cDNA 高效合成（反轉(zhuǎn)錄）試劑盒購自亞太恒信（北京）生物科技有限公司。

1.2 樣品的來源和處理118 份疑似IBV 感染病雞的氣管、肺、腎、法氏囊等組織樣品來自河北石家莊、邢臺(tái)、承德、秦皇島等地區(qū)的養(yǎng)雞場。將組織樣品剪碎并與無菌PBS 混合后，利用組織勻漿機(jī)充分勻漿，勻漿液反復(fù)凍融3 次后，4 ℃12 000 r/min離心2 min，取上清液，無菌檢測后加入雙抗（青鏈霉素）至終濃度100 U/mL，置于-80 ℃保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成以GenBank 中已登錄的IBV S1 基因（AF193423）、ILTV gD 基因（MK894999）、NDV NP 蛋白編碼基因（KY076039）、ALV gp85 基因（Z46390）為參考，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)相應(yīng)引物（表1），并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Sequence of PCR amplification primer

1.4 病毒的分離取上述病料樣品的勻漿上清液分別接種9 日齡SPF 雞胚尿囊腔，0.2 mL/胚，并設(shè)陰性對照，置孵化器內(nèi)孵育。棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚，72 h 后取出雞胚于4 ℃過夜。收集雞胚尿囊液后再接種9 日齡SPF 雞胚，連續(xù)盲傳3 代。收獲每一代的雞胚尿囊液，并觀察雞胚病變情況。

1.5 分離病毒的PCR 鑒定及序列分析分別提取第3 代尿囊液的DNA 和RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以上述DNA 和cDNA 為模板，采用表1 中的相應(yīng)引物，PCR 擴(kuò)增IBV、NDV、ALV、ILTV 的相應(yīng)基因，并以實(shí)驗(yàn)室保存的相應(yīng)病毒株作為陽性對照，用等量超純水作為陰性對照。將IBV 陽性樣品S1 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后連接pMD18-T 載體，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

以GenBank 中的IBV 疫苗株、國內(nèi)外部分流行株共計(jì)53 株作為參考病毒，利用DNAStar 7. 1 軟件和MEGA 7. 0 軟件分析S1 基因序列的同源性和遺傳進(jìn)化特征；利用RDP4 軟件對S1 基因進(jìn)行重組分析，采 用7 種 統(tǒng) 計(jì) 方 法（RDP、 Chimaera、 BootSscan、3Seq、GENECONV、MaxChi、SiScan）篩選出可能提供重組片段的病毒及重組事件，并利用SimPlot 將重組事件可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒的分離結(jié)果將病料樣品的勻漿上清液接種9 日齡雞胚后，初次傳代的雞胚在接種后120 h 內(nèi)無死亡，但取出胚體后可見胚體小于對照組。收集尿囊液并用濾膜過濾除菌，繼續(xù)接種雞胚，傳至第3 代時(shí)，雞胚在接種后48 h 開始出現(xiàn)死亡，打開雞胚氣室可見雞胚絨毛尿囊膜增厚，胚體取出后可觀察到胚體蜷縮、雙腳抱頭、死亡胚體表面可見明顯出血點(diǎn)，符合IBV 致雞胚病變的表現(xiàn)，而對照胚體無肉眼可見病變，初步表明在雞胚尿囊液中分離到IBV。

2.2 分離病毒的PCR 鑒定結(jié)果分別以病料樣品第3 代雞胚尿囊液的DNA 和cDNA 為模板，采用IBV、NDV、ALV、ILTV 特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，病料樣品僅IBV 擴(kuò)增結(jié)果為陽性，擴(kuò)增出約1 700 bp 的目的條帶（圖1，僅展示IBV 的鑒定結(jié)果），其余病毒均為陰性結(jié)果。表明經(jīng)雞胚尿囊液分離出了IBV，且共分離到11 株IBV，分別命名為HB.XT.1、HB.CD.2、HB.SJZ.8、HB.XT.9、HB.SJZ.21、HB.CD.23、HB.SJZ.24、HB.SJZ.WJ.1、HB.QHD.2、HB.SJZ.WJ.3、HB.QHD.5。

圖1 IBV分離株S1基因的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification of S1 gene of IBV isolates

2.3 IBV S1 基因序列的同源性分析利用DNAMAN軟件對S1 基因測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示11 株分離株S1 基因序列長度為1 609 bp～1 619 bp，編碼536～539 個(gè)氨基酸。利用DNAStar 7.1 軟件中的MegA-lign 程序分析分離IBV S1 基因的同源性，結(jié)果顯示，11 株分離株S1 基因序列間的同源性為92.8%～99.9%，與53 株國內(nèi)外IBV 參考株S1 基因序列的同源性為73.0%～96.7%，其中和國內(nèi)GI-19 基因型參考株S1 基因序列的同源性為92.9%～96.7%，與國內(nèi)常用疫苗株的同源性為74.7%～96.1%。上述結(jié)果表明河北IBV 流行株之間S1 基因序列的同源性較高，與國內(nèi)GI-19 基因型參考株相比發(fā)生了部分變異。除GI-19 基因型疫苗株以外，11 株分離株與H120、Ma5、M41、W93、Mass 等GI-1 基因型常用疫苗株的同源性均普遍較低。該結(jié)果與尹丹等的研究結(jié)果一致[13]，表明IBV S1 基因的變異性較大，且與常用疫苗株同源性較低。

2.4 IBV S1 基因的遺傳進(jìn)化分析利用MEGA7.0 軟件中的Neighbor-Joining 方法繪制IBV 分離株及參考株S1 基因的進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)為1 000。結(jié)果顯示，所有參考株共形成4 個(gè)不同的進(jìn)化分支，其中11 株分離株與17 株國內(nèi)流行株、2 株QX 型疫 苗 株（MH743141、HC455885）以 及8 株 國 外 參考株形成GI-19 基因型進(jìn)化分支（圖2），表明GI-19型IBV 是河北省流行的主要基因型，上述結(jié)果與王旭貞等報(bào)道的山西晉中地區(qū)IBV 流行基因型一致[14]。11 株分離株與H120、M41、Ma5、W93、4/91 等常用疫苗株遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，變異較大，可能是在長期使用活疫苗的免疫選擇壓力下造成了IBV 主要基因的變異，使得傳統(tǒng)疫苗產(chǎn)生的保護(hù)效力已經(jīng)不能完全抵抗流行株對雞體的攻擊[15]。

2.5 IBV S1基因編碼氨基酸序列的比對利用MEGA7.0 軟件對分離株與參考株S1 基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，與國內(nèi)現(xiàn)用GI-19 基因型疫苗株相比，分離株HB.SJZ.8、HB.SJZ.21 以及HB.WJ.3 和HB.QHD.5 在兩個(gè)相同位點(diǎn)發(fā)生了相同的氨基酸突變，分別是G38R、R66C；分離株HB.SJZ.8、HB.WJ.3 和HB.QHD.5 在多個(gè)相同位點(diǎn)均發(fā)生了相同的氨基酸突變，分別是L97F、R113W、C122S、I290T、 H350P、 F351Y、 K352R、 K353R、 S357N、 M368T、M373K、A384F；分離株HB.XT.1、HB.CD.2、HB.XT.9、HB.SJZ.21、HB.CD.23、HB.SJZ.24、HB.SJZ.WJ.1、HB.QHD.2 在多個(gè)相同位點(diǎn)均發(fā)生了相同的氨基酸突變，分別是C130R、L279P、I285V、V325G、F359S、Q364P、R365L、P369L、T370I、L371H、A374V、K379R、I382T；HB.XT.9 株在3 個(gè)位點(diǎn)處均發(fā)生了突變，分別是C52R、S309N、V315M；分離株HB.SJZ.21、HB.SJZ.24、HB.QHD.2、HB.QHD.5 在不同位點(diǎn)也發(fā)生了突變，分別是L317V、I288V、C304F、V335E。突變位點(diǎn)均位于aa38～aa67、aa 91～aa141 和aa 274～aa387，這與S1 蛋白含有的與血清型特異性和病毒中和表位相關(guān)的高變區(qū)（HVR）一致。IBV 基因組在復(fù)制過程中極易發(fā)生基因突變、缺失、插入及重組等，從而使IBV不斷發(fā)生變異，造成不同血清型IBV之間的交叉保護(hù)性低。研究表明S1基因僅有5%的變化就可以使得疫苗的保護(hù)力改變[16]。上述結(jié)果表明，2019年～2021 年河北地區(qū)IBV 的流行株與疫苗株相比出現(xiàn)了不同程度的變異。

2.6 IBV S1基因的重組分析結(jié)果利用RDP4 軟件分析11 株分離株S1 基因中可能存在的重組事件，結(jié)果顯示，有兩株分離株存在符合7 種算法的重組事件，分 別 為HB.SJZ.21 株=HB.XT.9 株+HB.SJZ.8 株、HB.XT.1 株=HB.SJZ.8 株+智利株MF043938，由此初步判定IBV 分離株HB.SJZ.21 和HB.XT.1 為兩株重組病毒。為了驗(yàn)證RDP4 軟件鑒定的重組事件，利用SimPlot軟件對重組事件可視化分析，結(jié)果顯示，為HB.SJZ.21 株提供重組片段的主要親本株為HB.XT.9 株，次要親本株為HB.SJZ.8 株，在nt253 處存在重組斷點(diǎn)（圖3A）；為HB.XT.1 株提供重組片段的主要親本株為HB.SJZ.8 株，次要親本株為智利株MF043938，在HB.XT.1 株S1 基因有兩個(gè)重組斷點(diǎn)，形成一段重組區(qū)域nt1 059～nt1 225（圖3B）。重組分析結(jié)果表明HB.SJZ.21 株可能是由HB.XT.9 株和HB.SJZ.8 株重組而成，HB.XT.1 株可能是由HB.SJZ.8 株和智利株MF043938 重組而成。已經(jīng)報(bào)道了許多IBV 的重組事件，不僅在野生型病毒和疫苗株之間，而且在野生病毒之間也存在許多重組事件[17]，從而產(chǎn)生了新的IBV 基 因 型[18]。

圖3 HB.SJZ.21（A）和HB.XT.1（B）分離株S1基因的Simplot重組分析Fig.3 Recombination analysis of S1 gene of HB.SJZ.21(A)and HB.XT.1(B)isolates by Simplot

目前世界范圍內(nèi)主要流行GI-19 基因型IBV，與其他型IBV 相比表現(xiàn)出嚴(yán)重的致病性[19]。因此，選擇合適的疫苗株和正確的免疫程序是有效控制IB 的關(guān)鍵[20]，反之可能會(huì)導(dǎo)致新型變異株的出現(xiàn)。同時(shí)還需對IBV 進(jìn)行持續(xù)的流行病學(xué)監(jiān)測，尤其應(yīng)注意不同基因型IBV 的混合感染、共同流行的情況，為IB 的防控和新疫苗的開發(fā)提供參考。