鴿副黏病毒Ⅰ型(川沙株)的分離與鑒定

張俊平，楊惠萍，蔣鳳英，倪建平，張春玲，李春華*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106;2.上海佳牧生物制品有限公司，上海201106)

上海市川沙地區(qū)發(fā)生一種流行性疾病，其來(lái)勢(shì)兇猛，傳播速度極快，病乳鴿幾乎100%死亡，青年鴿和成年鴿死亡也相當(dāng)嚴(yán)重，造成極大經(jīng)濟(jì)損失[1]。通過(guò)對(duì)該病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和病理變化觀(guān)察，初步判定為鴿副黏病毒Ⅰ型感染。為進(jìn)一步確定感染病原，采集病料進(jìn)行了病毒的分離鑒定。

1 材料

1.1 病料在上海川沙某發(fā)病鴿場(chǎng)無(wú)菌采取死亡鴿的腦、肝臟、脾臟、腎臟。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF種蛋、SPF雛雞，均購(gòu)北京梅里亞-維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;SPF雞胚為SPF種蛋自行孵化至所需日齡。30日齡抗體陰性幼齡鴿(HI抗體≤2)，購(gòu)自上海青浦養(yǎng)鴿場(chǎng)。試驗(yàn)雞、鴿隔離飼養(yǎng)。

1.3 參考血清 抗雞新城疫病毒(NDV)陽(yáng)性血清、減蛋綜合征病毒(EDS76V)陽(yáng)性血清，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;禽流感病毒(AIV)H5、H9、H7陽(yáng)性血清，購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.4 1%紅細(xì)胞懸液 取4～5月齡的SPF雞血液，按常規(guī)方法[2]洗滌制備。

2 方法

2.1 病原體分離培養(yǎng)

2.1.1 病料的采集與細(xì)菌學(xué)檢查 菌采取死亡鴿的腦、肝臟、腎臟、脾臟病料進(jìn)行涂片，革蘭氏染色后鏡檢，觀(guān)察結(jié)果;同時(shí)將上述病料分別接種于普通肉湯、普通瓊脂和血瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h后，觀(guān)察結(jié)果。

2.1.2 病料的處理 將上述病料混合研磨，用生理鹽水作1∶5稀釋?zhuān)?500 r/min離心15 min，取上清液除菌過(guò)濾、分裝，標(biāo)識(shí)為川沙株，-20℃以下保存作為病毒分離用[3]。

2.1.3 細(xì)菌培養(yǎng) 將上述處理的病料上清液分別接種于普通肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)96 h，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

2.1.4 病毒的分離 取上述細(xì)菌培養(yǎng)陰性的病料上清液尿囊腔接種于10日齡 SPF雞胚，0.1 mL/胚。置37℃孵箱孵育，棄去24 h死亡雞胚，以后每6 h觀(guān)察一次，并隨時(shí)取出死亡雞胚，置4℃冰箱中過(guò)夜，收集尿囊液并觀(guān)察雞胚病變，并盲傳5代(E1～E5)，收集死亡雞胚尿囊液。

2.2 病毒鑒定

2.2.1 血凝(HA)試驗(yàn) 應(yīng)用β-微量法，對(duì)收集的各代尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，檢測(cè)有無(wú)血凝性及血凝效價(jià)。

2.2.2 血凝抑制(HI)試驗(yàn) 分別應(yīng)用NDV陽(yáng)性血清、AIV-H5、AIV-H9和AIV-H7陽(yáng)性血清和EDS76V陽(yáng)性血清，與分離株尿囊液按β-微量法進(jìn)行 HI試驗(yàn)[4]。

2.2.3 中和試驗(yàn) 取分離株尿囊液分成2份，分別與NDV陽(yáng)性血清和正常血清等量混合，室溫下作用1 h后，將中和后的尿囊液用滅菌的生理鹽水作 10 倍系列稀釋?zhuān)?10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-86個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，0.1 mL/胚，37℃繼續(xù)孵育，接種后每24 h照胚一次，24 h前死亡的雞胚棄去不計(jì)，24～120 h死亡的雞胚隨時(shí)取出，記錄雞胚死亡情況，計(jì)算中和前后尿囊液的ELD50，并對(duì)雞胚尿囊液檢測(cè) HA 效價(jià)[4]。

2.2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 以1 mL的分離毒株E5代尿囊液對(duì)10只30日齡抗體陰性幼齡鴿進(jìn)行肌肉注射、滴鼻和點(diǎn)眼感染，連續(xù)記錄21 d，逐日觀(guān)察記錄發(fā)病和死亡情況以及剖檢變化。采存活鴿血清測(cè)定抗體水平，并觀(guān)察能否從病死鴿脾、腦中分離到該病毒。

2.3 RT-PCR鑒定

2.3.1 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[5]，針對(duì)NDV F基因序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，用于擴(kuò)增F基因，其序列為16s:5’-ATGGGCTCCAAACCTTCTACC-3’;P16a:5’-GCATTCATGCTCTTGTAGTGGCTCT-3’。引物由上海博亞生物工程有限公司合成。

2.3.2 病毒RNA的提取 取病毒尿囊液和正常SPF雞胚尿囊液各200 μL，參照BIOMIGA公司的EZgeneTMVirus RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 RT-PCR 以上述提取的總RNA為模板，用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，采用20 μL 反應(yīng)體系:總 RNA 8.0 μL，隨機(jī)引物(20 pmol/μL)1.0 μL，70 ℃變性10 min，然后在冰上加入5×RT Buffer 4.0 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)2.0 μL，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1.0 μL，Ribonuclease Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL，補(bǔ)加滅菌超純水至20 μL。將上述所有成分輕彈混勻，短暫離心，42℃反應(yīng)60 min后95℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物立即進(jìn)行PCR或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用50 μL體系進(jìn)行PCR，各反應(yīng)成分如下:cDNA 模板5 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，P16s、P16a 引物(20 pmol/μL)各1.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.5 μL，補(bǔ)加超純水至50 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。陰性對(duì)照為正常SPF雞胚尿囊液，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.4 理化特性鑒定

2.4.1 氯仿敏感性試驗(yàn) E5代尿囊液經(jīng)3000 r/min離心20 min，棄沉淀。將氯仿以5%的量加入上清液中，充分搖勻后，置于4℃振蕩10 min。再經(jīng)500 r/min離心5 min，吸上層液接種10日齡SPF雞胚5枚，0.2 mL/胚，37℃孵育5 d。收取不同時(shí)間死亡雞胚的尿囊液并作血凝試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立未處理病毒作為對(duì)照組。氯仿處理組病毒的滴度比對(duì)照組下降2個(gè)數(shù)量級(jí)以上者，判為對(duì)氯仿敏感。

2.4.2 乙醚敏感性試驗(yàn) 將無(wú)水乙醚和E5代尿囊液以1∶4的比例混合，振蕩數(shù)分鐘，2000 r/min離心20 min。取下層病毒液，接種10日齡SPF雞胚5枚，0.2 mL/胚。37℃孵育5 d，收取不同時(shí)間死亡雞胚的尿囊液并作血凝試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立未處理病毒作為對(duì)照組。如系乙醚敏感病毒，則病毒效價(jià)明顯降低。

2.4.3 耐酸性試驗(yàn) 用0.1 mol/L HCl將E5代尿囊液pH值分別調(diào)至3.0、5.0，置37℃作用2 h，用5.6%NaHCO3，將尿囊液pH調(diào)至7.2左右，然后接種5枚SPF雞胚，0.1 mL/胚。37℃孵育5 d，收取不同時(shí)間死亡雞胚的尿囊液并作血凝試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立未處理病毒作為對(duì)照組。如果試驗(yàn)組的病毒效價(jià)比對(duì)照組降低兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上乃至完全滅活者，則表明該病毒對(duì)酸敏感;相差不到1個(gè)對(duì)數(shù)者為對(duì)酸有耐受性。

2.5 致病指數(shù)測(cè)定

2.5.1 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)的測(cè)定 將分離毒E1～E5代尿囊液10倍系列稀釋?zhuān)x擇10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-96 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，0.1 mL/胚，37℃繼續(xù)孵育，記錄24～120 h雞胚死亡情況，測(cè)定其ELD50。

2.5.2 最小致死量病毒致死雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)的測(cè)定 按常規(guī)方法[2]進(jìn)行，應(yīng)用10日齡SPF雞胚對(duì)分離毒E5代尿囊液進(jìn)行MDT的測(cè)定。

2.5.3 1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)的測(cè)定

取1日齡SPF雛雞10只，各腦內(nèi)注射10-1稀釋的新鮮E5代病毒液0.05 mL/只，另取2只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0.05 mL/只。接種后，每日在相應(yīng)接種的時(shí)間觀(guān)察，記錄雛雞的情況，分正常(活動(dòng)靈活，行動(dòng)無(wú)共濟(jì)失調(diào)現(xiàn)象)、發(fā)病(包括麻痹、臥地不起，但不包括只表現(xiàn)遲鈍的雞)和死亡。

觀(guān)察8日，計(jì)算正常、發(fā)病、死亡雞的總數(shù)，根據(jù)不同的權(quán)值(正常為0分，發(fā)病為1分，死亡為2分)累計(jì)總分?jǐn)?shù)。最后將所累計(jì)總分除以被觀(guān)察的累計(jì)總數(shù)，計(jì)算ICPI。

2.5.4 6周齡雛雞靜脈致病指數(shù)(IVPI)的測(cè)定

取6周齡SPF雞10只，靜脈接種10-1稀釋的E5代尿囊液0.1 mL，另取2只接種生理鹽水作對(duì)照。每日在接種的相應(yīng)時(shí)間觀(guān)察，記錄接種雞情況，分正常、發(fā)病(雞只蜷縮在一起不愿運(yùn)動(dòng)，不愿采食或飲水，但無(wú)明顯的翅、腿麻痹表現(xiàn))、麻痹(翅、腿明顯不協(xié)調(diào)，翅膀下垂)和死亡。

觀(guān)察10日后，累計(jì)正常、發(fā)病、麻痹和死亡動(dòng)物數(shù)，根據(jù)不同權(quán)值(正常為0，發(fā)病為1，麻痹為2，死亡為3)累計(jì)總分?jǐn)?shù)。以累計(jì)總分除以正常、發(fā)病、麻痹和死亡動(dòng)物的累計(jì)總數(shù)計(jì)算IVPI。

IVPI=(10日內(nèi)累計(jì)死亡數(shù)×3+10日內(nèi)累計(jì)癱瘓數(shù)×2+10日內(nèi)累計(jì)發(fā)病數(shù)×1)÷10日內(nèi)累計(jì)觀(guān)察數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 病原體分離培養(yǎng) 病料經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢查，結(jié)果為陰性。病料上清液所接種的細(xì)菌培養(yǎng)基經(jīng)37℃培養(yǎng)96 h，均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。病料上清液經(jīng)尿囊腔接種SPF雞胚盲傳5代，盲傳至第4代雞胚死亡時(shí)間出現(xiàn)規(guī)律性死亡，并且可見(jiàn)死亡雞胚全身出血、尿囊膜上也有較多的出血點(diǎn)。

3.2 病毒鑒定

3.2.1 HA和HI試驗(yàn) 以上所有死亡雞胚尿囊液均有血凝性，其中，E1～E3代尿囊液HA效價(jià)偏低，在1∶2～1∶8;E4～E5代尿囊液 HA效價(jià)均在1∶64～1∶256;HI試驗(yàn)表明，分離毒的血凝性能夠被NDV陽(yáng)性血清所抑制，但不能被 AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7陽(yáng)性血清、EDS76V陽(yáng)性血清所抑制。

3.2.2 中和試驗(yàn) 將分離毒E4、E5代尿囊液分別與NDV陽(yáng)性血清和正常血清中和，試驗(yàn)結(jié)果表明:尿囊液能被NDV陽(yáng)性血清中和下降3～4個(gè)滴度。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 E4～E5代尿囊液中和試驗(yàn)結(jié)果 lgELD50/0．1 mL

3.2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 試驗(yàn)鴿接種病毒液后3日開(kāi)始發(fā)病，直至接毒后第5日全部發(fā)病，并且死亡6只，發(fā)病鴿表現(xiàn)出精神不振，食欲減退等，拉黃綠色稀便;第8日全部死亡，死亡鴿剖檢均見(jiàn)不同程度的腺胃、腸道出血和盲腸扁桃體出血、腫大。人工接種鴿癥狀和病變與自然發(fā)病鴿一致，從剖檢病死鴿體內(nèi)分離回收到相同毒株。

3.3 RT-PCR擴(kuò)增 從PPMV(川沙株)分離株擴(kuò)增到1666 bp的特異性片段，大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)，作為陰性對(duì)照的正常SPF雞胚尿囊液未出現(xiàn)擴(kuò)增片段。

3.4 病毒理化特性的鑒定 經(jīng)氯仿處理尿囊液血凝效價(jià)和對(duì)照組相差2個(gè)數(shù)量級(jí)以上，因而判定分離株對(duì)氯仿敏感。經(jīng)乙醚處理尿囊液接種雞胚全部健活，尿囊液HA陰性，表明分離株對(duì)乙醚敏感。尿囊液經(jīng)鹽酸處理后，血凝效價(jià)明顯下降，因此判定分離這株對(duì)酸敏感。

圖1 PPMV川沙分離株的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.5 致病指數(shù)測(cè)定結(jié)果 從發(fā)病鴿場(chǎng)采集病料分離物可在雞胚上增殖良好，培養(yǎng)物E1～E3代的病毒含量較低，從 E4代開(kāi)始病毒含量≥107.0ELD50/0.1 mL。E1～E5代尿囊液病毒含量分別為104.3、105.5、106.3、107.3、107.5ELD50/0.1 mL。對(duì)分離毒E5代尿囊液進(jìn)行測(cè)定，MLD為10-6，MDT為55.2 h，ICPI=144/80=1.8，IVPI=239/100=2.39(表2-表4)。

表2 E5代尿囊液MDT測(cè)定結(jié)果

表3 E5代尿囊液ICPI測(cè)定結(jié)果

表4 E5代尿囊液IVPI測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，從死亡鴿體內(nèi)分離到的病毒在雞胚上生長(zhǎng)良好，能凝集雞紅細(xì)胞，且這種凝集性可被特異的NDV陽(yáng)性血清所抑制，結(jié)合動(dòng)物回歸試驗(yàn)、RT-PCR鑒定、病毒理化特性測(cè)定結(jié)果及其臨床癥狀和剖檢變化，可確定該分離毒株為鴿副黏病毒Ⅰ型。同時(shí)，對(duì)其MDT(55.2 h)、ICPI(1.8)、IVPI(2.39)等致病指數(shù)的測(cè)定結(jié)果表明該毒株屬于強(qiáng)毒力鴿副黏病毒Ⅰ型，并將該毒株命名為鴿副黏病毒Ⅰ型(川沙株)。

動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明，通過(guò)給抗體陰性鴿注射病毒液可以復(fù)制出該病，證明分離的鴿副黏病毒Ⅰ型(川沙株)為引起該鴿場(chǎng)發(fā)病的病原。

[1]殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].第2版.北京:科學(xué)出版社，1997.

[2]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程2000年版[Z].

[3]符子華，張 波，易 忠，等.鴿新城疫病原的分離與鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，41(增刊):32-34.

[4]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二ΟΟ五年版三部[S].

[5]李春華，楊惠萍，謝 巧，等.鴿副黏病毒Ⅰ型S-1株的分子特性分析[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22(6):130-133.