正交試驗法優(yōu)選宮衣凈酊滲漉提取工藝研究

崔東安，王學(xué)智，王旭榮，張景艷，王磊，秦哲，李建喜，楊志強(qiáng)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州730050;農(nóng)業(yè)部新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗室，蘭州730050;甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州730050)

宮衣凈酊主要由益母草、紅花、葛根和車前子等中藥組成，用于奶牛胎衣不下的防治，可有效促進(jìn)滯留胎衣排出，改善奶牛產(chǎn)后繁殖性能[1]。目前該制劑屬臨床中試產(chǎn)品，其工藝繁雜、生產(chǎn)周期長、有效成分轉(zhuǎn)移率低。合理的提取工藝是中藥生產(chǎn)的一個重要操作單元，直接關(guān)系到中藥制劑的質(zhì)量和臨床應(yīng)用效果[2-3]。目前，中藥生產(chǎn)常用的提取工藝評價指標(biāo)是以中藥提取浸出物的收得率和某一確切成分的浸提收得率或含量為指標(biāo)[4]。紅花是宮衣凈酊主藥之一，其主要生物活性成分是以羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor yellow A，HSYA)為代表的查耳酮類化合物[5]。本研究旨在探討乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒用量、滲漉速度和浸漬時間等因素對滲漉提取工藝的影響，采用 L9(34)正交設(shè)計方法，以HSYA含量和浸膏得率為指標(biāo)對宮衣凈酊的滲漉提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

1 材料

1.1 儀器 戴安U-3000高效液相色譜儀，美國戴安公司;Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，安捷倫科技公司;超聲波清洗器KQ-250型，昆山市超聲儀有限公司;SNW ultra-pure water system:力康公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELAN-1100;ME235S微量分析天平。

1.2 藥品 HSYA(批號:111637-201106，含量92.5%)，中國藥品生物制品檢定所。益母草、紅花、葛根和車前子等藥材，甘肅蘭州黃河藥材市場。甲醇、磷酸、三乙胺和乙醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗設(shè)計 建立宮衣凈酊中HSYA高效液相色譜測定方法，以HSYA含量和滲漉浸膏得率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗法，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒用量、滲漉速度和浸漬時間為考察因素，優(yōu)選宮衣凈酊滲漉提取工藝。

2.2 宮衣凈酊中HSYA的含量測定方法研究

2.2.1 樣品制備

2.2.1.1 宮衣凈酊樣品溶液制備:按比例稱取處方下各藥材粗粉(粉碎各藥材并過二號篩)，按照正交設(shè)計表1進(jìn)行滲漉提取，收取滲漉液，40℃減壓濃縮回收乙醇，流浸膏用50%乙醇稀釋至1 mL藥液含0.5 g原生藥材，即為正交提取樣品，標(biāo)記備用。

2.2.1.2 供試品溶液制備:精密量取宮衣凈酊樣品溶液10 mL，蒸干，殘渣用25%甲醇溶解，置于10 mL量瓶中，25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.3 對照品溶液制備:精密稱取HSYA對照品，加25%甲醇制得每1 mL溶液中含2.26 mg HSYA的對照品貯備液，4℃冷藏備用

2.2.1.4 陰性樣品溶液制備:另取不含紅花藥材的陰性樣品溶液，按照供試品溶液制備方法制備成陰性樣品溶液。

2.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 ZORBAX E-clipse Plus C18色譜柱;甲醇-0.5%磷酸(三乙胺調(diào)pH至4.0)(25:75)為流動相;檢測波長為403 nm;流速為0.8 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;柱溫25℃。在上述色譜條件下，供試溶液中HSYA色譜峰達(dá)到基線分離，峰形對稱度高，且陰性無干擾，見圖1-圖3。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察:精密量取HSYA標(biāo)準(zhǔn)貯備 液，制 備 成 0.02825、0.05650、0.11300、0.226000、0.452000和0.904000 mg/mL的濃度梯度對照品溶液。按照2.2項下色譜條件，取上述對照品溶液進(jìn)行HPLC分析，以對照品溶液濃度y相對應(yīng)的峰面積x進(jìn)行線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.4798x-2.156，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9997，結(jié)果表明，HSYA峰面積與濃度在0.14～4.52 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.3.2 重復(fù)性試驗:取同一批次宮衣凈酊樣品，按照供試品溶液制備方法同時制備6份，測定HSYA含量。結(jié)果，HSYA含量為分別為0.463、0.469、0.460、0.458、0.456、0.473、0.468 mg/mL，RSD為1.36%，表明該方法可行，重復(fù)性好。

2.2.3.3 精密度試驗:取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照2.2項下色譜條件，測定其峰面積，計算RSD。結(jié)果HSYA的峰面積分別為213.5120、213.7471、214.1611、214.9575、217.4039、210.5957，RSD為1.03%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.4 穩(wěn)定性試驗:取新制備的供試品溶液，于0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣1 次，記錄 HSYA 峰面積。結(jié)果，HSYA峰面積分別為的RSD為1.08%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.5 加樣回收率試驗:精密量取同一批次已知含量的宮衣凈酊溶液6份，每份5 mL，置10 mL量瓶中，分別加入與樣品所含HSYA量相當(dāng)對照品，加稀乙醇溶液至刻度，搖勻。按2.1項下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表1，平均回收率為96.89%，RSD為173%，表明本試驗具有良好的回收率。

回收率=(實(shí)測值-供試品中HSYA含量)/對照品HSYA加入量×100%。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3 浸膏得率測定 按照《中華人民共和國獸藥典》二〇一〇年版二部附錄浸出物測定法，精密量取各樣品溶液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃ 干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定其重量，以干燥浸膏得率計算供試樣品中浸出物的含量。按下列公式計算浸膏得率，浸膏得率(%)=浸膏質(zhì)量/20 mL藥液相當(dāng)于藥材質(zhì)量×100%。

2.4 正交試驗結(jié)果 選用 L9(34)正交表，以HSYA含量為標(biāo)示性成分和浸膏得率為評價指標(biāo)，對乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、溶媒用量(B)、滲漉速度(C)和浸漬時間(D)四個因素進(jìn)行正交試驗，每個因素設(shè)3個水平考察處方提取工藝，因素水平見表2。按照2.2.1項下方法制備正交提取樣品，分別測定HSYA含量和浸膏得率，結(jié)果見表3和表4。HSYA含量為衡量滲漉提取工藝的主要指標(biāo)，設(shè)定權(quán)重系數(shù)為0.7。浸膏得率在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要意義，將浸膏得率作為次要指標(biāo)，設(shè)定權(quán)重系數(shù)為0.3[6]。綜合評分=70×(HSYA含量/HSYA含量max)+30×(浸膏得率/浸膏得率max)

表2 試驗因素水平設(shè)計

從表3中R值的大小顯示，各因素作用的主次為:乙醇體積分?jǐn)?shù)、滲漉速度、浸漬時間和溶媒用量。方差分析結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對滲漉提取影響較大，差異顯著(P＜0.05)。以A2B3C2D2組合為優(yōu)選工藝，即加入12倍量70%乙醇，浸漬24 h，以2 mL/(min·kg)進(jìn)行滲漉提取。由方差分析結(jié)果知，溶媒用量對滲漉提取效果的影響不顯著(P＞0.05)，考慮生產(chǎn)成本，確立優(yōu)選提取工藝為A2B2C2D2，即加入10倍量70%乙醇，浸漬24 h，以2 mL/(min·kg)進(jìn)行滲漉提取。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 正交試驗綜合評分方差分析結(jié)果

2.5 工藝驗證試驗 考察上述優(yōu)選提取工藝的可靠性，按照上述優(yōu)選滲漉提取工藝條件，進(jìn)行了3次驗證試驗，HSYA含量分別為 0.472、0.499和0.463 mg/mL，RSD為 1.77%;浸膏得率分別為16.87%、17.26%和16.61%，RSD為1.93%。結(jié)果表明，優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

藥典中測定紅花HSYA含量采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)為流動相，該色譜條件下色譜峰易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象[7]。宮衣凈酊為中藥復(fù)方制劑，成分較為復(fù)雜，對HSYA含量測定干擾大。參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，本試驗以甲醇-磷酸溶液為溶劑系統(tǒng)，經(jīng)過多次色譜條件優(yōu)化試驗研究，當(dāng)以甲醇-0.5%磷酸溶液(25∶75)為流動相時，HSYA色譜峰達(dá)到基線分離，峰形對稱度高，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗符合要求，適用于宮衣凈酊中HSYA的定量分析。該方法的建立為進(jìn)行宮衣凈酊制備工藝優(yōu)化和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了定量分析方法。

HSYA屬查耳酮類化合物，遇熱不穩(wěn)定[11]，而滲漉提取屬動態(tài)浸出方法，溶劑利用率高，有效成分浸出完全，適于熱不穩(wěn)定成分提取分離[2]，故本研究在保持產(chǎn)品原有酊劑劑型的基礎(chǔ)上，采用了滲漉提取工藝。綜合考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒用量、滲漉速度和浸漬時間四個因素對提取效果的影響，本研究優(yōu)選獲得了宮衣凈酊的滲漉提取條件，即加入10倍量70%乙醇，浸漬24 h，以2 mL/(min·kg)進(jìn)行滲漉提取。工藝驗證試驗結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定、可行、節(jié)約成本、有效成分浸出率高。

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