超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中19種β-受體激動(dòng)劑殘留

李 丹，孫 雷，畢言鋒，蘇富琴，徐秉恩，王鶴佳，徐士新

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

β-受體激動(dòng)劑(β-agonists)是一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類物質(zhì)，在飼料中添加該類藥物給動(dòng)物飼喂后具有營(yíng)養(yǎng)再分配作用，可以明顯提高動(dòng)物的瘦肉率，但是人們食用了這些藥物殘留的畜禽產(chǎn)品后會(huì)出現(xiàn)面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應(yīng)癥狀，嚴(yán)重的可能危及生命。因此國(guó)際上很多國(guó)家先后立法禁止在畜禽生產(chǎn)上使用該類藥物，我國(guó)政府也明令禁止其使用。近年來(lái)，隨著班布特羅、齊帕特羅等其它種類的β-受體激動(dòng)劑在養(yǎng)殖等環(huán)節(jié)非法添加使用的出現(xiàn)，2010年農(nóng)業(yè)部1519號(hào)公告再次禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用氯丙那林、齊帕特羅等新型的β-受體激動(dòng)劑，但農(nóng)業(yè)部現(xiàn)行的1025號(hào)公告-18-2008僅能對(duì)動(dòng)物肌肉組織中9種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行檢測(cè)，給違禁使用新型β-受體激動(dòng)劑的查處造成不便。本研究針對(duì)我國(guó)居民消費(fèi)量比較大的豬、牛和羊肌肉組織樣品，研發(fā)一種能快速準(zhǔn)確檢測(cè)其中19種β-受體激動(dòng)劑殘留的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，為行政主管部門對(duì)市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)和可能出現(xiàn)的其他種類新型的β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐，滿足多種β-受體激動(dòng)劑同時(shí)檢測(cè)的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acquity UPLC-Quattro premier XETM質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters公司);DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司);Delta 320 pH計(jì)(Mettler Toledo公司);Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)(賀利氏公司);Organomation Associates氮吹儀(Jnc公司);SIR4漩渦混合器(IKA公司)。

1.2 試劑和材料 吡布特羅、西馬特羅、特步他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西布特羅、克倫塞羅、克倫丙羅、羥甲基克倫特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、福莫特羅、溴布特羅、克倫潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅，西馬特羅-D7，沙丁胺醇-D3，萊克多巴胺-D3，克倫特羅-D9，班布特羅-D9，克倫潘特-D5，克倫丙羅-D7純度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈、異丙醇、甲酸為色譜純(Fisher公司);NaCl、Na2SO4和MgSO4均為分析純;所用水為超純水。

1.3 對(duì)照溶液配制 精密稱定適量的吡布特羅、西馬特羅、特步他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西布特羅、克倫塞羅、克倫丙羅、羥甲基克倫特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、福莫特羅、溴布特羅、克倫潘特、班布特羅、馬布特羅和馬噴特羅對(duì)照品，用甲醇配制成1 mg/mL的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

精密稱定適量的西馬特羅-D7，沙丁胺醇-D3，萊克多巴胺 -D3，克倫特羅 -D9，班布特羅 -D9，克倫潘特-D5和克倫丙羅-D7，用甲醇配制成1 mg/mL的各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL的各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液。

1.4 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取勻質(zhì)的豬、牛和羊肌肉組織(5±0.05)g，置于50 mL離心管內(nèi)，加入8 mL乙腈和2 mL異丙醇，渦旋1 min。加入1.2 g氯化鈉，渦旋1 min，再加入4 g Na2SO4和0.5 g MgSO4，渦旋后水平振蕩 5 min，靜置 5 min，8000 r/min離心8 min。離心后取5.0 mL上清液于玻璃離心管內(nèi)，50℃下氮?dú)獯蹈?，然后?0%甲醇水溶液0.5 mL充分溶解后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

1.5 儀器分析條件 色譜柱為BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動(dòng)相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫:0～2 min，維持4%A;2～12 min，4%A線性變化至60%A;12～13 min，維持 4%A;流速為0.3 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

電噴霧離子源(ESI+);毛細(xì)管電壓為3.2 kV;源溫為110℃;脫溶劑溫度為350℃;脫溶劑氣速為650 L/Hr;錐孔反吹氣速為50 L/Hr。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子情況見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 準(zhǔn)確量取適量的西馬特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅、班布特羅、克倫潘特、克倫丙羅7種混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，制得濃度為 2、5、10、20、50 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng/mL)，依次上機(jī)測(cè)定，以各藥物定量離子質(zhì)量色譜峰面積與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)?？梢钥闯?種β-受體激動(dòng)劑在2～50 ng/mL的系列標(biāo)液濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。

其他12種β-受體激動(dòng)劑取其混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，分別添加到空白肌肉組織經(jīng)前處理后的基質(zhì)中，制得濃度為 2、5、10、20、50 ng/mL 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次上機(jī)測(cè)定。以各藥物定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)?？梢钥闯?2種β-受體激動(dòng)劑在2～50 ng/mL的系列濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。

表1 19種β-受體激動(dòng)劑及內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)離子對(duì)、對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量

表2 19種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法靈敏度 采用空白添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N＞3為方法檢測(cè)限，S/N＞10為方法定量限，得出吡布特羅、西馬特羅、特步他林、等19種藥物在豬、牛和羊肌肉組織中的定量限為0.5 μg/kg，檢測(cè)限為0.25 μg/kg。

1 μg/kg空白豬肌肉添加試液中19種β-受體激動(dòng)劑特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 1 μg/kg空白豬肌肉添加試液中19種β-受體激動(dòng)劑特征離子質(zhì)量色譜圖

2.3 方法精密度與準(zhǔn)確度 在空白豬肌肉中添加0.5、1、5 μg/kg三個(gè)不同濃度的19種 β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見(jiàn)表3?？梢钥闯觯?9種β-受體激動(dòng)劑在空白豬肌肉組織中的平均添加回收率為73.7% ～114.1%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。

表3 空白豬肌肉中19種β-受體激動(dòng)劑添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3 討論

β-受體激動(dòng)劑在養(yǎng)殖業(yè)上屬于禁用藥物，對(duì)于此類藥物，只要在動(dòng)物性食品中檢出即為非法添加，已報(bào)道的文獻(xiàn)[1-7]資料中，此類藥物的分析方法都包括酶解、液液萃取、固相萃取凈化等繁瑣的前處理過(guò)程，藥物絕對(duì)回收損失較大，且耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，本方法采用乙腈和異丙醇(4∶1，V/V)為提取溶劑進(jìn)行提取，對(duì)于苯胺型、苯酚型及間苯二酚型的藥物均有好的提取效果。此外，方法中加入NaCl、Na2SO4和MgSO4，具有很好的鹽析沉淀蛋白、去雜、吸收水分等作用，起到了很好的樣品凈化效果。本方法縮短了樣品前處理時(shí)間，能更好地滿足快速確證檢測(cè)的需求。

4 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)我國(guó)居民經(jīng)常消費(fèi)的豬、牛和羊肌肉組織樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化改進(jìn)，建立了快速檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中19種β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)的UPLC-MS/MS方法，其靈敏度、精確度均能滿足獸藥殘留分析方法的要求，同時(shí)也為我國(guó)市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)和可能出現(xiàn)的其他種類新型的β-受體激動(dòng)劑實(shí)施監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。

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