HPLC法測定穿白痢康丸中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量

李毅竦，崔艷莉，楊武寧，孫舒放，覃雪斌，何 瓊

(廣西獸藥監(jiān)察所，南寧530001)

穿白痢康丸是《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版收載的新制劑，穿心蓮是主藥但質量標準無含量測定[1]。穿心蓮藥材中主要有效成分為穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯，以葉子含量多，葉子中又以嫩葉多，中老葉有逐漸減少趨勢[2];商品穿心蓮藥材在采收、曬干、包裝、運輸和貯存過程中葉片被大量丟失損耗，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯是欠穩(wěn)定的化合物，藥材久置后含量會降低，制劑生產受熱的工藝中損失也較多[3]。為了能夠測定穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的含量，保證制劑質量，實驗采用高效液相色譜法對穿白痢康丸中穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯含量測定方法進行了研究。

1 材料

1.1 儀器 島津LC20型系列高效液相色譜儀(SPD-20A紫外檢測器，LCSOLUTION色譜工作站，SIL-20A自動進樣器、柱溫箱);AG 245型電子天平;KQ-250 DB超聲波儀。

1.2 供試藥品與試劑 10批次穿白痢康丸(廣西三家藥廠提供)，陰性對照樣品(缺穿心蓮的穿白痢康丸)按《中華人民共和國獸藥典》2010年版收載的穿白痢康丸標準的處方(去穿心蓮)和制法自制;供含量測定用穿心蓮內酯對照品(批號110797-201108，含量98.7%)和脫水穿心蓮內酯對照品(批號110854-201007，含量99.7%)由中國食品藥品檢定研究院提供;層析用中性氧化鋁、流動相中甲醇為色譜純、水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:lnertsil?ODS-SP(250 mm ×4.6 mm ，5 μm)Column;流動相:甲醇 -水(52:48);檢測波長為240 nm;流速1.0 mL/min;柱溫30℃;進樣量:10 μL。

2.2 供試品溶液的制備 取本品研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞稱定重量，冷浸30 min，超聲處理(功率250 W頻率40 KHZ)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置中性氧化鋁柱(200-300目，5 g，內徑為1.5 cm)上，用甲醇15 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.3 對照品與陰性溶液的制備 取穿心蓮內酯對照品約15 mg，脫水穿心蓮內酯對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度作為貯備液。精密吸取貯備液5 mL置25 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含穿心蓮內酯30 μg，脫水穿心蓮內酯20 μg的對照品溶液。取自制陰性對照樣品，按2.2“供試品溶液的制備”方法制成陰性對照溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 分別取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1-圖3)，從供試品色譜圖可以看出，在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按脫水穿心蓮內酯峰計大于2000，在與對照品色譜相應的位置上，有相同保留時間(穿心蓮內酯6.9 min;脫水穿心蓮內酯16.9 min)的色譜峰，穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯與相鄰共存物之間的分離度分別為3.1和17.5(藥典要求應大于1.5)，陰性對照在穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯相同保留時間處無干擾峰。

圖1 穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯對照品混合液HPLC色譜圖

圖2 穿白痢康丸樣品HPLC色譜圖

圖3 穿白痢康丸陰性對照樣品HPLC色譜圖

2.5 線性范圍考察 分別精密稱取穿心蓮內酯對照品15 mg，脫水穿心蓮內酯對照品10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液1，5，10，15，20 mL，置 25 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，以上述色譜條件測定峰面積。以對照品濃度作為橫坐標(X)，峰面積作為縱坐標(Y)，得線性回歸方程:穿心蓮內酯 Y=37105X-19283，r=0．9996;脫水穿心蓮內酯Y=31264X-16722，r=0.9999。結果表明，穿心蓮內酯在0.06～1.2 μg、脫水穿心蓮內酯在0.04～0.80 μg范圍內具有良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 分別精密吸取同一份對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯RSD分別為0.46%和0.28%，表示儀器精密度良好，可以滿足含量測定的要求。

2.7 穩(wěn)定性與重復性試驗 取同一批供試品(批號130101)，按上述色譜條件分別在 0、1、2、4、8、24 h進樣10μL，記錄色譜圖，測定峰面積，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯 RSD分別為0.83%和0.95%，表明供試品溶液在24 h內測定值基本穩(wěn)定。另平行稱取供試品6份，按照樣品含量測定項下的方法測定，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的含量RSD分別為0.88%和0.56%，表明重復性良好。

2.8 系統(tǒng)耐用性實驗 對同一批供試品(批號:130101)分別用 Symmetry?C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、watersC18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)、lnertsil?ODS-SP(250 mm × 4.6 mm，5 μm)的色譜柱，流動相甲醇-水(55∶45)、甲醇-水(52∶48)，穿心蓮內酯檢測波長225 nm、脫水穿心蓮內酯檢測波長254 nm，240 nm波長同時測定穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯等不同的因素試驗，用相對平均偏差(計算公式:平均偏差除以平均值)比較上述條件的測定數(shù)值與標準規(guī)定方法測定數(shù)據(jù)，結果相對平均偏差為0.96%，表示受測定條件的小變動影響有限，能通過本系統(tǒng)適用性試驗。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收試驗法，取同一批已知含量的穿白痢康丸(批號:130101)分別加一定量的穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯對照品，按上述色譜條件測定，用公式:回收率%=C-A/B×100%(C:為加入對照品后的測得總量，A:樣品中所含被測成分量，B:加入對照品量)計算回收率，結果見表1。

表1 回收率測定結果(n=9)

2.10 樣品含量測定 取穿白痢康丸(10個批次)按2.2“供試品溶液的制備”的方法操作，分別精密吸取供試品溶液與上述的對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定10批次樣品穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯中峰面積，按外標法計算其含量，結果見表2。

3 討論與結論

蔡松濤等[4]認為在穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯含量測定的前處理，超聲提取優(yōu)于熱回流法，甲醇提取效率最高。通過對比實驗認為，氧化鋁5 g，柱子內徑1.5 cm，凈化10 mL的供試液，用15 mL甲醇洗脫，能達到既能吸附雜質，又能完全洗脫穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯供檢測。超聲提取時間選用30 min能提取完全[5-7]，因此，實驗經過方法優(yōu)選，采用婦科千金片甲醇超聲提取法，以及穿心蓮藥材[8]的過柱凈化方法。

表2 10批次樣品含量測定結果 (mg/g)

HPLC法測定復方制劑中的穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯，文獻多參照《中華人民共和國藥典》二○一○年版的穿心蓮藥材測定穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯含量的流動相(甲醇/水，52/48)和測定波長(穿心蓮內酯 225 nm，脫水穿心蓮內酯254 nm)[8]，掃描有最大吸收[9-10]，通過對比實驗，本試驗最終采用流動相為甲醇 -水(52/48)，用240 nm波長同時測定穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的含量[8]，取得了較好的效果。

本研究仿婦科千金片[8]以二者的總量作為質量標準的限量。供試品的穿心蓮內酯含量為脫水穿心蓮內酯3倍，與文獻報道[11]相符。穿白痢康丸為水丸，在泛丸中不可避免的熱處理，會導致穿心蓮內酯損失和部分轉化為脫水穿心蓮內酯，二者含量變化是動態(tài)的，也是不可控的。因此，以穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯的總量來控制產品質量較單控制其中一種成分更為科學、合理[11]，10批樣品的穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯總量最高為3.9 mg/g，最低為 3.6 mg/g，平均為 3.7 mg/g?？紤]到不同產地、不同采收季節(jié)的穿心蓮藥材中穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的含量差別較大[9]，從穿心蓮藥材的采收到制劑成品生產鏈中穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的含量諸多不穩(wěn)定的因素，參照中藥口服復方制劑質量標準制訂方法，擬定穿白痢康丸的穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯總量限度為10批樣品平均量的80%為標準的控制量，即每1 g含穿心蓮以穿心蓮內酯(C20H30O5)、脫水穿心蓮內酯(C20H28O4)的總量計，不得少于3.0 mg。

[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版二部[S].

[2]鄭虎占.中藥現(xiàn)代研究與應用[S].

[3]黃曉丹.穿心蓮片生產過程中脫水穿心蓮內酯的含量變化[J].中國中藥雜志，2002，27(12):911-912.

[4]蔡松濤，陳向紅，馬 琳，等.影響穿心蓮片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量測定的因素[J].中成藥，2005，27(3):361-362.

[5]李瑋玲.HPLC測定穿王消炎片中脫水穿心蓮內酯的含量[J].廣東藥學，2004，14(6):15-17.

[6]黃全勇，艾金鐘，喻志林，等.穿黃消熱膠囊質量標準研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(9):110-112.

[7]趙宏榮，王立英.HPLC測定復方苦木消炎顆粒中脫水穿心蓮內酯含量[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2010，7(11):36-38.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二○一○年版一部[S].

[9]蘇 丹，祝 晨，劉中秋，等.RP-HPLC法測定不同產地穿心蓮葉中穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯含量的研究[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2002，20(7):36，56.

[10]狄永良.穿黃消炎膠囊的制備及質量標準研究[J].中國藥業(yè)，2010，19(21):36-37.

[11]朱寧江，蔣云根，邵衛(wèi)中，等.高效液相色譜法測定穿黃消炎片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量[J].中南藥學，2007，5(4):337-339.