K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌eltAB基因缺失對(duì)其生物學(xué)特性影響的研究

段強(qiáng)德，龐勝美，朱國(guó)強(qiáng)

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病和重要人獸共患病防控技術(shù)國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia co-li，ETEC）是引起人和畜禽腹瀉最重要的細(xì)菌性病原之一。黏附素（菌毛黏附素和非菌毛黏附素）和腸毒素（熱敏腸毒素和熱穩(wěn)定腸毒素）是其表達(dá)的兩類主要毒力因子[1-3]。ETEC 在黏附素的介導(dǎo)下，與宿主細(xì)胞特異性受體的結(jié)合是其引起感染的第一步也是最為關(guān)鍵的一步。熱敏腸毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）屬于典型的A1B5 毒素家族，全毒素由一個(gè)具有催化活性的A 亞基非共價(jià)結(jié)合五聚體B 亞基組成。LT 與霍亂弧菌分泌的霍亂毒素（Cholera toxin，CT）在結(jié)構(gòu)、免疫原性、生物學(xué)活性以及作用機(jī)理上均高度相似[4-5]。其中LTA 亞基具有ADP-核糖基化活性，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用；LTB 亞基具有膜結(jié)合功能，能與宿主細(xì)胞表面的GM1 神經(jīng)節(jié)苷脂受體特異性結(jié)合。LT 毒素誘導(dǎo)腹瀉的機(jī)理已經(jīng)研究的比較清楚。首先，LTB 亞基與宿主細(xì)胞上的GM1 受體結(jié)合。然后，具有ADP-核糖基化活性的LTA 亞基激活腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase，AC），引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（Cyclic AMP，cAMP）上升，最終使Cl-分泌增加、Na+吸收減少而引起電解質(zhì)和水平衡紊亂導(dǎo)致機(jī)體水樣腹瀉。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，LT 除了傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性作用外，在體內(nèi)、體外均能促進(jìn)細(xì)菌與宿主細(xì)胞的早期黏附[6-7]，但是具體機(jī)制還不清楚。腸道上皮是抵抗病原微生物侵入腸道的第一道屏障，緊密連接是細(xì)胞間最重要的連接方式，可阻礙毒性大分子的通過(guò)。其中，緊密連接蛋白是腸道粘膜屏障的重要組成部分。緊密連接蛋白主要包括ZO-1、Occludin 和Clau-dins 蛋白等，對(duì)維持腸道黏膜上皮屏障的完整性具有重要作用，也是評(píng)價(jià)腸道粘膜屏障功能是否發(fā)生障礙的重要指標(biāo)。已有研究表明，霍亂弧菌分泌的CT 毒素能夠引起宿主細(xì)胞內(nèi)cAMP 的上升，破壞細(xì)胞的屏障結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)霍亂弧菌對(duì)兔子腸上皮細(xì)胞的黏附和定植[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，ETEC 感染腸道上皮細(xì)胞后能夠刺激炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[10]，但是LT 是否會(huì)刺激腸道上皮細(xì)胞炎性因子的分泌，以及破壞腸道屏障進(jìn)而促進(jìn)黏附尚不明確。為研究LT 對(duì)K88ac+ETEC 致病性的影響，本研究通過(guò)構(gòu)建豬源K88ac+ETEC 菌株eltAB基因缺失株和回補(bǔ)株，并比較缺失株和K88ac+ETEC 野生株與仔豬小腸上皮細(xì)胞的黏附能力、誘導(dǎo)IPEC-J2 細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子和表達(dá)細(xì)胞緊密連接蛋白的能力，為進(jìn)一步闡明LT促進(jìn)K88ac+ETEC 黏附的分子機(jī)制提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒及細(xì)胞株大腸桿菌C83902 野生株（K88ac+、LT+、STa+、STb+）、表達(dá)質(zhì)粒pBR322 和仔豬腸道上皮細(xì)胞IPEC-J2 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；λ-Red同源重組質(zhì)粒pKD3、pKD46 和pCP20 由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑胰蛋白酶（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）、氯化鈉（NaCl）均購(gòu)自O(shè)xoid 公司；氨芐青霉素（Ampicillin）和氯霉素（Chloramphenicol）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；L-阿拉伯糖購(gòu)自BBI 公司；T4 DNA 連接酶和Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶購(gòu)自Thermo Scientific 公司；限制性內(nèi)切酶EcoRV-HF（High fidelity enzyme）購(gòu)自NEB 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Trans 2K plusⅡDNA Marker 購(gòu)自TransGen 公司；parameterTMcAMP 試劑盒購(gòu)自R&D systems 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基和0.25%胰酶均購(gòu)自Gibco公司；TRIzol Reagent 購(gòu)自Qiagen 公司；SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司。

1.3 缺失株和回補(bǔ)株的構(gòu)建根據(jù)Datsenko 等采用的λ-Red 同源重組技術(shù)構(gòu)建eltAB基因缺失株（C83902 ΔeltAB）[11]。首先以pKD3 質(zhì)粒為模板，利用引物ΔeltAB-F/ΔeltAB-R（表1）擴(kuò)增，將攜帶ΔeltAB基因同源臂和氯霉素抗性Cat基因的PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至攜帶有質(zhì)粒pKD46 的C83902 感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp+和Cm+雙抗性平板上篩選陽(yáng)性克隆，即獲得一次重組菌株C83902ΔeltAB::Cat。進(jìn)一步利用編碼Flp 重組酶的溫敏質(zhì)粒pCP20在42 ℃恒溫?fù)u床中連續(xù)傳3代消除Cat抗性基因，以獲得C83902ΔeltAB株。利用pBR-LT-F/pBR-LT-R引物通過(guò)PCR和測(cè)序鑒定。

以提取的C83902 野生株基因組DNA 為模板，pBR-LT-F/pBR-LT-R 為引物（表1），PCR 擴(kuò)增全長(zhǎng)eltAB基因，經(jīng)DNA 測(cè)序鑒定正確后克隆至表達(dá)載體pBR322 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBR322-LT。將重組質(zhì)粒pBR322-LT 電轉(zhuǎn)化至C83902ΔeltAB株感受態(tài)細(xì)胞，以獲得回補(bǔ)株C83902ΔeltAB/pLT，并經(jīng)PCR 鑒定。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 3 株菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將C83902 株和C83902 ΔeltAB株分別接種LB 液體培養(yǎng)基，C83902ΔeltAB/pLT 株接種含Amp+的LB 液體培養(yǎng)基，置于37 ℃，220 r/min 振蕩培養(yǎng)，每1 h 取樣測(cè)定菌液的OD600nm值，記錄并重復(fù)上述試驗(yàn)3 次，根據(jù)OD600nm值繪制3 株菌的生長(zhǎng)曲線。

1.5 3 株菌刺激細(xì)胞內(nèi)cAMP 濃度的測(cè)定首先將C83902 株、 C83902ΔeltAB株 和C83902ΔeltAB/pLT株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后按照細(xì)菌數(shù)和IPECJ2 細(xì)胞數(shù)10：1 的比例共孵育（37 ℃，1.5 h），細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次后，用1×細(xì)胞裂解液裂解。4 ℃600 r/min 離心10 min 后取上清，采用parame-ter-TMcAMP 試劑盒測(cè)定3 株菌誘導(dǎo)IPEC-J2 細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度。

1.6 3 株菌與IPEC-J2 細(xì)胞的黏附試驗(yàn)將仔豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2 接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待長(zhǎng)滿單層細(xì)胞時(shí)（約3.0×105個(gè)/孔），參照文獻(xiàn)[12]方法分別進(jìn)行3 株菌與IPEC-J2 細(xì)胞的黏附試驗(yàn)。

1.7 RT-qPCR 檢測(cè)炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平將C83902 株、C83902ΔeltAB株 和C83902ΔeltAB/pLT 株的細(xì)菌數(shù)與IPEC-J2 的細(xì)胞數(shù)按照10：1 的比例共孵育1.5 h 后，采用TRIzol 提取IPEC-J2 細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再分別以TNF-α-F/R 和IL-8-F/R為引物，采用RT-qPCR 的方法檢測(cè)炎性細(xì)胞因子TNF-α 和IL-8 轉(zhuǎn)錄水平的變化。實(shí)驗(yàn)設(shè)GADPH基因?yàn)閮?nèi)參。

1.8 RT-qPCR 檢測(cè)緊密連接蛋白的轉(zhuǎn)錄水平IPEC-J2 細(xì)胞處理、RNA 提取和cDNA 合成操作同上。再分別以Claudin-1-F/R、Occludin-F/R 和ZO-1-F/R 為引物（表1），利用SYBR?Premix ExTaqTM（Per-fect Real Time）試劑盒檢測(cè)閉合蛋白、密封蛋白-1 和閉鎖連接蛋白-1 編碼基因（Occludin、Claudin-1、ZO-1）的轉(zhuǎn)錄水平，分析eltAB缺失對(duì)腸道屏障完整性的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)GADPH基因?yàn)閮?nèi)參。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)均表示為±s。利用GraphPad Prism 5.0 軟件中Student'st-tests 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P>0.05 代表無(wú)顯著性差異；P<0.05 代表差異顯著；P<0.01 代表差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 缺失株及回補(bǔ)株的PCR 鑒定結(jié)果分別以C83902 株、C83902ΔeltAB株 和C83902ΔeltAB/pLT 株基因組DNA 為模板，利用鑒定引物pBR-LT-F/pBRLT-R（表1）擴(kuò)增eltAB基因。結(jié)果顯示，C83902 株和C83902ΔeltAB/pLT 株擴(kuò)增片段均為1 148 bp，C83902 ΔeltAB株擴(kuò)增片段為200 bp，大小均與預(yù)期一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，C83902ΔeltAB株中eltAB基因已經(jīng)缺失，在同源區(qū)域只留下了1 個(gè)FLP 重組酶識(shí)別（FRT）位點(diǎn)。上述結(jié)果表明分別正確構(gòu)建了eltAB基因缺失株和其回補(bǔ)株。

圖1 C83902ΔeltAB缺失株的PCR鑒定Fig.1 Identification of C83902ΔeltAB deletion mutant by PCR

2.2 3 株菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果3 株菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示，C83902 株、C83902ΔeltAB株和C83902ΔeltAB/pLT 株在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)速度基本一致（圖2），表明eltAB基因的缺失并不影響C83902菌株的生長(zhǎng)速度。

圖2 3株菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果Fig.2 The bacterial growth curves of three different strains

2.3 IPEC-J2 細(xì)胞內(nèi)cAMP 濃度的測(cè)定結(jié)果IPECJ2 細(xì)胞內(nèi)cAMP 濃度測(cè)定結(jié)果顯示，C83902 株和C83902ΔeltAB/pLT 株 感 染IPEC-J2 細(xì) 胞 后，細(xì) 胞內(nèi)cAMP 水平均極顯著升高（P<0.01），濃度分別為7.94 pmol/mL 和8.41 pmol/mL，而C83902ΔeltAB株感染后分泌的cAMP 濃度僅為0.84 pmol/mL，與僅加DMEM 的IPEC-J2 細(xì)胞內(nèi)濃度相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但比C83902 株和C83902ΔeltAB/pLT 株感染組極顯著下降（P<0.01）（圖3）。以上結(jié)果表明，C83902ΔeltAB株不能刺激IPEC-J2 細(xì)胞內(nèi)合成cAMP，再次證實(shí)了缺失株構(gòu)建正確。

圖3 3株菌感染IPEC-J2細(xì)胞后cAMP濃度的測(cè)定結(jié)果Fig.3 The intracellular cAMP concentration of IPEC-J2 following infection with three strains

2.4 3 株菌與IPEC-J2 細(xì)胞的黏附試驗(yàn)結(jié)果為了檢測(cè)eltAB基因缺失對(duì)C83902 菌株黏附能力的影響，本研究比較了C83902 株和C83902ΔeltAB株對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2 的黏附能力。結(jié)果顯示，與C83902 株 相 比，C83902ΔeltAB株 對(duì)IPEC-J2 細(xì) 胞 的黏附能力極顯著降低（P<0.01）。C83902ΔeltAB株的黏附能力僅為C83902 株的20%，而C83902ΔeltAB/pLT 株的黏附能力與野生株相當(dāng)（圖4）。表明LT 能顯著促進(jìn)C83902 株對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞的黏附。

圖4 3株菌與IPEC-J2細(xì)胞黏附的測(cè)定結(jié)果Fig.4 The result of three strains adherence to IPEC-J2 cells

2.5 IPEC-J2 細(xì)胞炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-8 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)RT-qPCR 檢測(cè)不同菌株感染IPEC-J2 細(xì)胞后主要炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，與C83902 株相比，C83902ΔeltAB株感染IPEC-J2 細(xì)胞后，細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-8 基因的轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低（P<0.01），而C83902ΔeltAB/pLT 株感染細(xì)胞中TNF-α 和IL-8 基因的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化（圖5）。表明LT 能夠顯著誘導(dǎo)IPEC-J2 細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子。

圖5 RT-qPCR檢測(cè)炎性細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果Fig.5 Results of RT-qPCR to detect mRNA transcription level of inflammatory cytokines

2.6 IPEC-J2 細(xì)胞緊密連接蛋白mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)RT-qPCR 檢測(cè)不同菌株感染IPECJ2 細(xì)胞后主要緊密連接蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，C83902 株、C83902ΔeltAB株和C83902ΔeltAB/pLT 株感染IPEC-J2 細(xì)胞后，細(xì)胞中緊密連接蛋白基因Claudin-1、Occludin和ZO-1的轉(zhuǎn)錄水平上均無(wú)顯著變化（P>0.05）（圖6）。表明LT 轉(zhuǎn)錄不能破壞IPECJ2 細(xì)胞的屏障結(jié)構(gòu)。

圖6 RT-qPCR檢測(cè)緊密連接蛋白編碼基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果Fig.6 Detection of mRNA transcription level of tight junction protein coding gene by RT-qPCR

3 討 論

細(xì)菌毒素是許多病原菌重要的毒力因子之一，一種病原菌能夠分泌一種或多種細(xì)菌外毒素引起機(jī)體致病。細(xì)菌外毒素能夠促進(jìn)分泌該毒素的病原菌在體外的黏附和體內(nèi)定植，從而增強(qiáng)病原菌的毒力和致病性。K88ac+ETEC 是引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌，屬于非侵襲性大腸桿菌。K88ac菌毛和腸毒素（LT 和ST）是K88ac+ETEC 的兩類主要毒力因子。不同的細(xì)菌毒素促進(jìn)病原菌黏附的能力和機(jī)制存在差異。腸出血性大腸桿菌（Enterohemor-rhagicE. coli，EHEC）分泌的志賀類毒素2e（Shigaliketoxin2，Stx2e）促進(jìn)大腸桿菌O157:H7 與腸上皮細(xì)胞的黏附主要是通過(guò)增加宿主細(xì)胞表面的大腸桿菌外膜蛋白受體核仁蛋白（Nucleolinprotein）的表達(dá)[13]。霍亂弧菌分泌的CT 毒素促進(jìn)霍亂弧菌對(duì)兔子腸上皮細(xì)胞的定植主要是利用其A 亞基的細(xì)胞毒性，破壞細(xì)胞的屏障結(jié)構(gòu)[10]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)不表達(dá)LT 的C83902ΔeltAB株對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2 的黏附能力較表達(dá)LT 的C83902 株顯著下降，而C83902 ΔeltAB/pLT 株的黏附能力則恢復(fù)至野生株的水平。以上結(jié)果表明，LT 毒素在體外能夠促進(jìn)豬源K88ac+ETEC 菌株對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞的黏附。

K88ac+ETEC 在各種黏附素的介導(dǎo)下首先黏附、定植至仔豬小腸上皮細(xì)胞，然后分泌腸毒素引起細(xì)胞內(nèi)cAMP 濃度的增加，進(jìn)一步破壞機(jī)體水、電解質(zhì)平衡而引起水樣腹瀉[14]。 鑒于K88ac 菌毛在K88ac+ETEC 致病過(guò)程中的重要作用，推測(cè)LT 可能通過(guò)增加仔豬小腸細(xì)胞中K88ac 菌毛受體（IMTGP）的表達(dá)而促進(jìn)其黏附。但是研究發(fā)現(xiàn)LT 的表達(dá)并不會(huì)改變仔豬小腸上皮細(xì)胞上IMTGP 受體的表達(dá)[15]。仔豬腸道上皮細(xì)胞緊密連接在一起，共同構(gòu)成腸道的物理屏障，可以有效抵御病原微生物的侵入。LT 的A亞基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，LT 是否可能通過(guò)破壞腸道上皮細(xì)胞的物理屏障結(jié)構(gòu)而促進(jìn)細(xì)菌黏附尚不清楚。K88+ETEC 感染仔豬腸道上皮細(xì)胞可以誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子IL-6 和IL-8 的產(chǎn)生[8]。本研究發(fā)現(xiàn)elt-AB基因缺失后，TNF-α 和IL-8 的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降，表明LT 可以誘導(dǎo)仔豬小腸上皮細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子。機(jī)體過(guò)度的炎性反應(yīng)，可能造成組織損傷，破壞上皮細(xì)胞屏障結(jié)構(gòu)。但本研究利用RT-qPCR 檢測(cè)了C83902 株和C83902ΔeltAB株感染后IPEC-J2 細(xì)胞中主要連接蛋白Claudin-1、Occludin 和ZO-1 在轉(zhuǎn)錄水平的變化，結(jié)果顯示3 種連接蛋白在mRNA 轉(zhuǎn)錄水平上均無(wú)變化，可見(jiàn)LT 促進(jìn)K88ac+ETEC 黏附并不是通過(guò)破壞腸道屏障的完整性而實(shí)現(xiàn)的。cAMP 濃度測(cè)定結(jié)果顯示C83902 株和C83902ΔeltAB/pLT 株誘導(dǎo)IPEC-J2 細(xì)胞分泌的cAMP 水平顯著高于C83902ΔeltAB株。鑒于cAMP 是機(jī)體內(nèi)重要的第二信使分子，作用廣泛，據(jù)此推測(cè)cAMP 濃度的上升可能影響菌株的生長(zhǎng)，但本研究發(fā)現(xiàn)cAMP 的產(chǎn)生并不會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)速度。因此，cAMP 具體是如何促進(jìn)K88ac+ETEC 菌株黏附的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

本研究證明了ETEC 產(chǎn)生的LT 毒素在體外能促進(jìn)K88ac+ETEC 菌株對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞的黏附和炎性細(xì)胞因子的分泌，有利于進(jìn)一步加深對(duì)LT 毒素致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為防控K88ac+ETEC 感染引起的新生仔豬和斷奶仔豬的腹瀉提供了新的策略。