羅非魚無乳鏈球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除菌株的構建及其特性分析

馬艷平，郝 樂，馮國清，梁志凌，馬江耀，柯 浩，劉振興

廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農業(yè)農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640

無乳鏈球菌 (Streptococcus agalactiae) 屬于 B 族鏈球菌 (GBS)，宿主范圍廣泛，能感染人類、哺乳動物、爬行動物和魚類等，對全球公共衛(wèi)生和人體健康造成了嚴重的安全隱患[1-2]。中國是羅非魚(Oreochromissp.) 養(yǎng)殖大國，也是鏈球菌病高流行地區(qū)，其發(fā)病率和死亡率居高不下，居羅非魚傳染病之首，因抗生素濫用或過量添加，造成耐藥率也越來越高[3-5]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在放線桿菌門和厚壁菌門等革蘭氏陽性細菌中存在一種新型分泌系統(tǒng)，即VII型分泌系統(tǒng) (Type 7 secretion system, T7SS)[6-8]。VII型分泌系統(tǒng)由多種組分構成，分泌早期分泌性抗原靶 6 (Early secretory antigenic target 6, ESAT6)和培養(yǎng)濾液蛋白 10 (Culture filtrate protein 10,CFP10)兩種免疫原性胞外蛋白。VII型分泌系統(tǒng)具有改變細胞信號轉導、促進細菌從巨噬細胞吞噬體逃逸、抑制吞噬體溶酶體融合、影響細胞凋亡及裂解細胞等生物學功能，與致病性密切相關[9-10]。分枝桿菌VII型分泌系統(tǒng)與菌株毒力密切相關，正是由于ESAT6蛋白的缺失，才使得牛型結核菌毒力缺失，成為卡介苗。目前為止，眾多研究聚焦結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis) VII型分泌系統(tǒng)，ESAT-6基因的缺失會導致結核分枝桿菌喪失分泌其他ESX-1分泌蛋白的能力，甚至喪失結核分枝桿菌致病性[9]。金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)缺失ESAT6和CFP-10編碼基因，造成金黃色葡萄球菌毒力下降，影響了該菌的持續(xù)感染[11]。

無乳鏈球菌研究顯示，ESAT6蛋白以同源二聚體形式發(fā)揮作用[12-13]。VII型分泌系統(tǒng)單個基因各自編碼具有特定功能的蛋白質，決定著ESAT6/CFP10及其毒力蛋白分泌轉運，并與細菌的毒力和致病機制存在重要聯(lián)系[8,14-17]，因此對VII型分泌系統(tǒng)的研究有助于了解無乳鏈球菌毒力蛋白分泌機制，有助于闡明無乳鏈球菌的生存、增殖和擴散的分子基礎，更可為尋找抗無乳鏈球菌基因蛋白藥物的作用靶點提供關鍵性線索，進而為從根本上控制無乳鏈球菌病提供可能性。前期研究對無乳鏈球菌的基因組檢索發(fā)現(xiàn)了與VII型/ESAT-6分泌系統(tǒng)同源性較高的基因簇，由11個基因組成的基因簇構成 (esaABCDEF、essABC、esxAB)[18-20]。分子生物學顯示essA、essB、essC基因編碼膜蛋白，但是其功能研究還未見文獻報道。

筆者課題組前期擴增到了羅非魚無乳鏈球菌essA、essB、essC全長基因，生物信息學分析顯示essA、essB基因編碼膜蛋白，essC基因編碼蛋白含有典型的FtsL-Spo III E結構，前期研究重組表達了essA、essB、essC蛋白，免疫羅非魚后，對無乳鏈球菌的相對免疫保護率分別為82.57%、85.29%、91.60%，是良好的免疫原性蛋白[21]。在此基礎上，本研究以羅非魚源無乳鏈球菌致病株GDZX1為研究對象，利用熱敏性自殺載體pSET4S構建基因缺失突變株ΔessA、ΔessB、ΔessC，并對其生物學特性進行分析, 以揭示無乳鏈球菌essA、essB、essC對ESAT6蛋白mRNA表達水平、對菌株致病性的影響，以期為無乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)編碼基因功能研究提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試驗用魚

野生型無乳鏈球菌強毒力菌株GDZX1 (Wild type，Serotype Ia)，由廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所水產(chǎn)病害研究室分離并保存。溫敏型自殺質粒pSET4S和pSET5S由日本國立動物衛(wèi)生研究所Daisuke Takamatsu博士惠贈。試驗用羅非魚購自廣東省羅非魚良種場，體質量約為10 g，實驗前在室內玻璃缸暫養(yǎng)2周，隨機抽檢5尾，做病原分離試驗，確保試驗用魚不攜帶無乳鏈球菌病原。隨機分為13組 (12個攻毒組和1個對照組)。保持溶解氧>5.0 mg·L?1，每天換水，保持水質良好。試驗前每天飽飼2次。

1.2 引物設計與合成

運用 Oligo 7.0 和 Primer 6.0 軟件設計引物，試驗用引物序列見表1，由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 試驗用引物Table 1 Primers in this study

1.3 基因敲除用重組載體的構建

1.3.1essA基因敲除重組載體的構建

以提取的無乳鏈球菌GDZX1基因組DNA為模板，essAup-FBamHI/essAup-R引物對擴增essA基因上游同源臂，essAdown-F/essAdown-REcoRI引物對擴增essA基因下游同源臂，反應程序為98 ℃預變性 5 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以pSET5S質粒為模板，Cat(essA)-F/Cat-R引物對擴增氯霉素表達框(Cat)，反應程序為：98 ℃ 預變性 5 min；98 ℃10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將擴增的片段切膠純化，等體積 (8 μL) 混合，進行第 1輪融合PCR擴增，反應程序為：98 ℃預變性5 min；98℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，16 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。然后以第1輪融合后的PCR產(chǎn)物為模板，以essAup-FBamHI/essAdown-REcoRI為正、反向引物，進行第2輪融合PCR擴增，反應程序為98 ℃ 預變性 5 min；98 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃90 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min，PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

符合預期的片段切膠純化，BamHI和EcoRI雙酶切，與同樣雙酶切后的線性化載體pSET4s連接，連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，然后將培養(yǎng)物涂布在含有氯霉素 (25 μg·mL?1) 和壯觀霉素 (50 μg·mL?1) 的 LB 固體平板上，37 ℃ 倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，利用essAup-FBamHI/essAdown-REcoRI引物對進行PCR鑒定，反應程序為 98 ℃ 預變性 5 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃90 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min，PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，鑒定后的陽性質粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.3.2essB基因敲除重組載體的構建

以提取的無乳鏈球菌GDZX1基因組DNA為模板，essBup-FBamHI/essBup-R引物對擴增essB基因上游同源臂，essBdown-F/essBdown-REcoRI引物對擴增essB基因下游同源臂，反應程序為：98 ℃預變性 5 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。按 1.3.1Cat擴增程序，Cat(essB)-F/Cat-R擴增Cat表達框。按1.3.1融合PCR程序，進行第1輪融合PCR擴增，以essBup-FBamHI/essBdown-REcoRI為正、反向引物，進行第2輪融合PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。并按1.3.1重組載體構建步驟，構建并鑒定重組質粒。

1.3.3essC基因敲除重組載體的構建

以提取的無乳鏈球菌GDZX1基因組DNA為模板，essCup-FSalI/essCup-R引物對擴增essC基因上游同源臂，essCdown-F/essCdown-REcoRI引物對擴增essC基因下游同源臂，反應程序為98 ℃預變性 5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。按 1.3.1Cat擴增程序，Cat(essC)-F/Cat-R擴增Cat表達框。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將擴增的片段切膠純化，等體積 (8 μL) 混合，進行第1輪融合PCR擴增。反應程序為98 ℃預變性 5 min；98 ℃ 15 s，48 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，16個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。然后以第1輪融合PCR產(chǎn)物為模板，以essCup-FSalI/essCdown-REcoRI為正、反向引物，進行第2輪融合PCR擴增，反應程序為 98 ℃ 預變性 5 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min，PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。并按1.3.1重組載體構建步驟，構建并鑒定重組質粒。

1.4 基因缺失突變株的構建

參照Takamatsu等[22]的方法，制備GDZX1株電轉化感受態(tài)細胞。分別取 5 μL pSET4S-ΔessA、pSET4S-ΔessB、pSET4S-ΔessC陽性質粒分別加入到100 μL GDZX1電轉化感受態(tài)細胞中，輕微混勻后將混合物加入0.2 cm電轉杯內，冰浴10 min，在 2.25 kV·cm?1，200 Ω、25 μF 電轉參數(shù)下電擊，迅速加入 1 mL SOC 培養(yǎng)基，30 ℃，160 rpm 振蕩搖動 3～4 h；隨后將 300 μL 菌液涂布于 THB Spc+Cm+平板，在30 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h。挑取小菌落至 Cm+THB 培養(yǎng)基上，30 ℃ 培養(yǎng) 6～7 h，轉 37 ℃培養(yǎng)24 h。轉移菌落分別至Cm+抗性和Spc+抗性的THB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。其中在Cm+抗性培養(yǎng)基能生長、但在Spc+抗性培養(yǎng)基不能生長的為疑似陽性菌落，繼續(xù)穩(wěn)定傳代，PCR鑒定并測序，菌株保種至?80 ℃冰箱。

1.5 基因缺失突變株 ΔessA、ΔessB、ΔessC 特性分析

1.5.1 生長曲線分析

劃線接種 ?80 ℃凍存的無乳鏈球菌野生株(WT)、ΔessA、ΔessB、ΔessC株至THB固體培養(yǎng)基，30 ℃ 培養(yǎng) 24 h。挑取單菌落至 5 mL THB 液體培養(yǎng)基，30 ℃ 振搖 24 h。測定各菌株光密度 (OD600)，調整各菌株OD600均為1.80，然后以體積比1∶100 接種至 100 mL THB 液體培養(yǎng)基，30 ℃ 振搖，每隔 2 h取樣 2 mL，測定 OD600，SPSS 軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.5.2 基因缺失對 ESAT6 蛋白表達量的研究

1)ESAT6基因qPCR檢測方法的建立：利用Primer 6.0軟件，設計 ESAT6 qPCR 檢測引物，引物序列見表1。依實驗室前期構建的ESAT6-pMD18T載體為模板，測定質粒濃度，10倍梯度稀釋 7 個梯度。分別以原液、10?1、10?2、10?3、10?4、10?5、10?6稀釋質粒為模板，利用 Vazyme AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒，配制20 μL qPCR 反應體系，其中 2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上游引物 (10 μmol·L?1)1 μL，下游引物 (10 μmol·L?1) 1 μL，模板 2 μL，ddH2O 6 μL。按 95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃10 s，72 ℃ 20 s，40 個循環(huán)進行 qPCR 反應；95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s進行熔解曲線采集。

2) ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除對 ESAT6蛋白mRNA表達水平影響分析：劃線接種無乳鏈球菌WT株、ΔessA株、ΔessB株、ΔessC株至THB固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落至5 mL THB培養(yǎng)基，30 ℃振搖24 h，調整OD600=1.80后，按 1∶100 接種至 100 mL THB 液體培養(yǎng)基，30 ℃振搖，分別于 4 、8 、12 和 24 h 取樣 5 mL，利用OMEGA RNA提取試劑盒，提取細菌RNA，并反轉錄成cDNA，稀釋10倍，以無乳鏈球菌16Sr-RNA 基因為內參基因[23]，按 95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s采集熒光，40 個循環(huán)進行qPCR 反應；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s進行熔解曲線的采集。以WT株為對照，2?ΔΔCT方法計算敲除株ESAT6 mRNA相對表達量，并利用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.5.3 毒力試驗

取?80 ℃凍存的無乳鏈球菌WT株、ΔessA、ΔessB、ΔessC菌株，劃線接種THB固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，接種THB液體培養(yǎng)基，30 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后，適度稀釋，取 100 μL 涂布在THB平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)。4株菌株均稀釋至 5×108、5×107、5×106CFU·mL?13 個劑量，0.1 mL·尾?1腹腔注射健康羅非魚各20尾，對照組設置20尾，注射等量PBS溶液。試驗魚放置于 40 cm×30 cm×40 cm 的水族箱，連續(xù)充氣，水溫維持在27～30 ℃，每天觀察死亡情況并記錄，死亡羅非魚剖解，重新劃線接種分離病原菌。利用GraphPad Prism軟件繪制生存率曲線，并進行顯著性分析。

2 結果

2.1 敲除載體的構建

以野生型菌株GDZX1基因組DNA為模板，采用表1引物序列，獲得essA基因上游435 bp同源臂序列，下游502 bp同源臂序列；獲得essB基因上游508 bp同源臂序列，下游508 bp同源臂序列；獲得essC基因上游632 bp同源臂序列，下游571 bp同源臂序列。以pSET5S質粒為模板，采用表1引物序列，獲得氯霉素表達框1 056 bp片段。essAup片段、cat(essA)、essAdown片段，經(jīng)融合PCR，獲得 1 993 bp 的融合片段 (圖1-a)；essBup片段、cat(essB)、essBdown片段，經(jīng)融合PCR，獲得 2 072 bp 的融合片段 (圖1-b)；essCup片段、cat(essC)、essCdown片段，經(jīng)融合 PCR，獲得 2 259 bp的融合片段 (圖1-c)。

圖1 essA、essB、essC同源臂融合PCR結果Fig. 1 Overlap extension PCR results of essA, essB, essC homologous arms

以此為基礎，將目的片段與酶切后的pSET4S質粒連接，轉化E.coliDH5α 菌株，37 ℃ 培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌株，進行PCR鑒定，并測序驗證，獲得基因敲除載體，分別命名為pSET4S-ΔessA質粒、pSET4S-ΔessB質粒、pSET4S-ΔessC質粒。

2.2 敲除菌株 ΔessA、ΔessB、ΔessC 的篩選與鑒定

將2.1獲得的pSET4S-ΔessA質粒、pSET4SΔessB質粒、pSET4S-ΔessC質粒電轉化入野生型無乳鏈球菌電轉化感受態(tài)中，30 ℃培養(yǎng)48 h，使質粒與野生型菌株發(fā)生同源重組，挑取對氯霉素具有抗性的單克隆菌株至cm+THB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng) 6 h，轉至37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，以此傳代培養(yǎng)，對第9代菌株篩選到的對氯霉素具抗性的菌株，提取細菌基因組DNA，分別利用essA驗證引物、essB驗證引物、essC驗證引物進行PCR鑒定，結果見圖2。利用essA驗證引物，WT株擴增到479 bp的目的片段，而疑似essA敲除株擴增到 1 311 bp的目的片段，符合預期，對所獲目的片段進行測序驗證，essA基因插入了cat基因序列，證明敲除成功，敲除株命名無乳鏈球菌ΔessA(圖2-a)；利用essB驗證引物，WT株擴增到740 bp的目的片段，而疑似essB敲除株擴增到1 702 bp的目的片段，符合預期，對所獲目的片段進行測序驗證，essB基因插入了cat基因序列，證明敲除成功，敲除株命名為無乳鏈球菌ΔessB(圖2-b)；利用essC驗證引物，WT株擴增到1 263 bp的目的片段，而疑似essC敲除株擴增到2 077 bp的目的片段，符合預期，對所獲目的片段進行測序驗證，essC基因插入了cat基因序列，證明敲除成功，敲除株命名為無乳鏈球菌ΔessC(圖2-c)。

圖2 敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC DNA水平PCR鑒定結果Fig. 2 PCR identification results of ΔessA, ΔessB, ΔessC knockout strains at DNA level

在此基礎上，對第9代菌株篩選到的對氯霉素具抗性的菌株，提取菌體RNA，并反轉錄成cDNA，利用RT-PCR技術在RNA水平上驗證基因缺失突變株ΔessA、ΔessB、ΔessC。利用essAF/essA-R引物對對ΔessA敲除菌株進行mRNA水平驗證，利用essB-F/essB-R引物對對ΔessB敲除菌株進行mRNA水平驗證，利用essC-F/essC-R引物對對ΔessC敲除菌株進行mRNA水平驗證，結果均未擴增到目的條帶，證明缺失菌株構建成功 (圖3)。

圖3 敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC RNA水平PCR鑒定結果Fig. 3 PCR identification of ΔessA, ΔessB and ΔessC knockout strains at RNA level

2.3 生長曲線分析

通過測定不同時間菌液OD600，比較ΔessA、ΔessB、ΔessC與WT株的生長速度差異，結果見圖4。與WT株生長速率相比，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株前期生長速率明顯減慢，WT株在第8 小時OD600達到1.282，在第18 小時OD600達到1.878；而ΔessA、ΔessB在第8小時OD600僅為0.2，在第18小時OD600才達到1.4，生長速率明顯減慢，經(jīng)統(tǒng)計學分析，與WT株相比，0～18 h OD600具有顯著性差異 (P<0.01)；而ΔessC株與WT株相比，OD600無顯著性差異。

圖4 敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC 生長曲線測定結果Fig. 4 Growth curve of ΔessA, ΔessB and ΔessC knockout strains

2.4 敲除株對底物蛋白 ESAT6 表達量的影響結果

2.4.1ESAT6 基因 qPCR 檢測方法的建立

以構建的ESAT6-pMD18T質粒為模板，經(jīng)10 倍梯度稀釋，分別以原液、10?1、10?2、10?3、10?4、10?5、10?67 個劑量質粒為模板，配制 q-PCR反應體系，經(jīng)三步法qPCR擴增，得到ESAT6基因qPCR擴增曲線，擴增效率為95.1%，符合要求 (圖5)；熔解曲線分析得出在75 ℃左右出現(xiàn)單峰，證明擴增產(chǎn)物單一；擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結果得到88 bp的特異性條帶。

圖5 ESAT6 qPCR檢測方法的建立注：a. 擴增效率分析結果；b. 熔解曲線分析結果； c. 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測結果。Fig. 5 qPCR detection method of ESAT6 geneNote:a. Amplification efficiency analysis result; b. Melt curve analysis result; c. Amplification product detection result based on agarose gel.

2.4.2 敲除株對 ESAT6 蛋白 mRNA 表達水平的影響結果

以無乳鏈球菌16S rRNA基因為內參基因，在第 4 、第8 、第12和第 24小時，比較 ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株與WT株ESAT6 mRNA表達水平差異，結果見圖6。第4 、第8 、第12 小時時，相較于WT株，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6 mRNA 表達水平均顯著降低 (P<0.01)，但在第24小時，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6表達量與WT株無顯著性差異。說明essA、essB、essC基因缺失在生長早期影響了ESAT6表達，導致ESAT6 mRNA表達水平顯著性降低。

圖6 敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC 與野生株對底物蛋白ESAT6表達量的影響結果注：**. 差異顯著 (P<0.01)。Fig. 6 Effect of substrate protein ESAT6 expression by knockout strains ΔessA, ΔessB, ΔessC and WT strainNote:**. Significant difference (P<0.01).

2.5 毒力試驗

ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株與WT株分別稀釋至 5×108、5×107、5×106CFU·mL?13 個劑量，分別對羅非魚進行毒力試驗，比較敲除株與WT株毒力差異 (圖7)。各組以 5×108CFU·mL?1劑量0.1 mL·尾?1注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計死亡率分別為90%、90%、70%，而WT株累計死亡率為 100%；各組以 5×107CFU·mL?1劑量 0.1 mL·尾?1注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計死亡率分別為60%、90%、60%，而WT 株累計死亡率為 100%；各組以 5×106CFU·mL?1劑量 0.1 mL·尾?1注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計死亡率分別為50%、50%、30%，而WT株累計死亡率為100%，經(jīng)成活率曲線分析，5×106CFU·mL?1劑量攻毒時，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計死亡率均與WT株存在明顯差異(P<0.01)。死亡羅非魚剖解，可見魚體肝臟充血、腹水、眼球突出等無乳鏈球菌感染典型癥狀 (圖8)，且從腦、肝、脾、腎組織取樣，劃線接種血瓊脂平板，得到呈β溶血、針尖大小的灰白色小菌落，經(jīng)革蘭氏染色和PCR鑒定，為無乳鏈球菌。PBS組在攻毒試驗期內未發(fā)現(xiàn)死亡。隨后又對回接到各個菌株，以 5×108CFU·mL?1劑量，重復攻毒，結果顯示，WT、ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計死亡率分別為100%、90%、80%、70%，證明回歸試驗成功。

圖7 敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC 與野生株毒力試驗結果Fig. 7 Virulence test of ΔessA, ΔessB, ΔessC knockout strains and WT strain

圖8 攻毒死亡魚解剖及其菌株鑒定結果注：a. 攻毒死亡魚解剖癥狀；b. 攻毒分離菌株革蘭氏染色結果；c. 攻毒分離菌株 PCR 鑒定結果。Fig. 8 Anatomical symptom result and identification of strains of infected dead tilapiaNote:a. Anatomical symptom result of infected dead tilapia; b. Gram staining result of isolated strain after infection;c. PCR identification of isolated strain after infection.

3 討論

VII型分泌系統(tǒng)由多個膜蛋白、胞質蛋白及外分泌蛋白組成，其分泌蛋白的穩(wěn)定釋放依賴于VII型分泌系統(tǒng)不同蛋白的共同作用[18,24]。對于VII型分泌系統(tǒng)的研究，結核分枝桿菌研究最為清楚地顯示出膜蛋白Rv3871識別分泌蛋白ESAT-6/CFP-10復合物，與CFP-10的C端結合，并與Rv3870在細胞內膜上相互作用形成有活性的ATP酶，形成一個具有中央空洞的六環(huán)結構，分泌蛋白通過六環(huán)分泌通道分泌出胞外。跨膜蛋白可能形成了轉位通道，促進分泌蛋白的分泌[25]。

無乳鏈球菌感染是危害羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)最為嚴重的細菌性傳染病，前期筆者課題組從患病羅非魚中分離鑒定到一株高毒力菌株GDZX1[26]，對其毒力特征和致病機制的研究亟待開展。前期研究對無乳鏈球菌的基因組檢索發(fā)現(xiàn)了與VII型/ESAT-6分泌系統(tǒng)同源性較高的基因簇[11-12]，由11個基因組成的基因簇構成 (esaABCDEF、essABC、esxAB)。essA、essB蛋白均為跨膜蛋白，可能對VII型分泌系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮起著重要作用。essC蛋白含有典型FstK/SpoEIII結構域 (FSD)，分泌蛋白的分泌需要essC調控的ATP水解作用提供能量[14]。本研究利用同源重組技術，構建了羅非魚無乳鏈球菌essA、essB、essC缺失突變株，通過DNA水平和RNA水平鑒定，均證明缺失突變成功。并對敲除菌株的VII型分泌系統(tǒng)可能的編碼基因進行了測序分析，均未造成VII型分泌系統(tǒng)其他基因的缺失或突變。對野生株和各基因敲除株進行了生長特性表型分析，證明essA、essB基因缺失明顯影響了細菌的生長，證明essA和essB蛋白與細菌生長有關。隨后對分泌蛋白ESAT6表達量的研究發(fā)現(xiàn)，essA、essB、essC基因缺失均導致了分泌蛋白ESAT6 mRNA表達水平明顯下降，說明essA、essB、essC蛋白可以影響ESAT6 mRNA表達水平，對于維持無乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)的完整性起著重要作用。眾多研究表明，VII型分泌系統(tǒng)單個基因各自編碼具有特定功能的蛋白質，而這些基因以單個或多個形式相互作用，使得由它們獨立編碼的多個蛋白質協(xié)同作用，組成一個完整的毒力蛋白分泌系統(tǒng)。該分泌系統(tǒng)決定著ESAT6/CFP10及其毒力蛋白的分泌轉運，結核分枝桿菌其組分很有可能形成一個類似于細菌I型-VI型分泌系統(tǒng)的多重跨膜結構，酵母雙雜交試驗揭示，膜蛋白Rv3871識別分泌蛋白ESAT-6/CFP-10復合物，與CFP-10的C端結合，并與Rv3870在細胞內膜上相互作用形成有活性的ATP酶。分子伴侶Rv3868與Rv3870和Rv3871相互作用促進ESAT-6和CFP-10蛋白的分泌。Rv3870/Rv3871復合物形成具有活性的ATP酶，形成一個具有中央空洞的六環(huán)結構，底物分泌蛋白通過六環(huán)分泌通道分泌出胞外。膜蛋白Rv3877含有11個跨膜結構域，可能形成了位于內膜上的轉位通道[23]。本研究挖掘到無乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)重要的組成蛋白essA、essB、essC，其缺失均造成了ESAT6蛋白分泌障礙，對無乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)其他組成蛋白的挖掘，以及組成蛋白的相互協(xié)同關系，仍有待進一步研究。

本研究對ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株和WT株，選擇3個梯度對羅非魚進行攻毒試驗，essA、essB、essC基因缺失導致了無乳鏈球菌毒力明顯下降，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計死亡率均與WT株存在明顯差異 (P<0.01)，影響了菌株毒力，可能與essA、essB、essC基因缺失造成的ESAT6分泌蛋白表達量降低有關。這與金黃色葡萄球菌的報道一致，金黃色葡萄球菌VII型/ESAT6分泌系統(tǒng)分泌蛋白需要essA、essB和essC蛋白的協(xié)同作用[11]，essB蛋白全缺失導致ESS系統(tǒng)不能分泌底物蛋白[27]，部分缺失導致ESS系統(tǒng)分泌底物蛋白表達量明顯降低[28-29]，證明essB是金黃色葡萄球菌ESS分泌系統(tǒng)的核心組件，繼而通過十二烷基麥芽糖苷萃取技術提取了金黃色葡萄球菌essB蛋白，研究發(fā)現(xiàn)essB蛋白與esaA、essA、essD和esxA蛋白形成聚合體，同時essC蛋白可為ATP水解作用提供能量，才能使金黃色葡萄球菌ESS分泌功能正常發(fā)揮[15,30]，而esxA/ESAT6蛋白是金黃色葡萄球菌ESS分泌系統(tǒng)的分泌蛋白，與金黃色葡萄球菌毒力與膿腫形成密切相關[27]。蟾蜍分枝桿菌 (Mycobacterium xenopi) 研究也發(fā)現(xiàn)相似的膜蛋白，組成ESX-5 T7SS分泌系統(tǒng)，與毒力密切相關[31]。

本研究證明無乳鏈球菌essA、essB、essC蛋白對ESAT6分泌蛋白的分泌至關重要，維持無乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)的完整性，可能是無乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)的關鍵膜蛋白，其缺失不僅影響了ESAT6蛋白的表達，而且直接影響了菌株毒力，是潛在的無乳鏈球菌毒力因子。但是這些膜蛋白是如何控制分泌蛋白分泌的，是否存在蛋白之間的相互作用，膜蛋白僅控制分泌蛋白分泌還是可以自身參與入侵宿主過程，這些問題有待進一步探索研究。