基于高通量測序的鯖魚加工副產(chǎn)物固態(tài)厭氧發(fā)酵過程分析

王 瑤，李紅玉，齊祥明,，毛相朝，董 浩，郭曉華

1. 中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003

2. 山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276826

鯖魚 (Pneumatophorus japonicus) 又稱鮐魚，因富含蛋白質(zhì)、鈣、鐵等以及Omega-3不飽和脂肪酸[1]且價格低廉而廣受歡迎。自20世紀(jì)90年代起，鯖魚已成為中國近海捕撈的主要經(jīng)濟(jì)魚種之一，2020年捕撈量約3.9×105t，位居中國海洋魚類捕撈量第四[2]。鯖魚可被加工成魚糜、魚餅等產(chǎn)品，加工過程中產(chǎn)生的魚排、內(nèi)臟等副產(chǎn)物約占40%[3]，如果不加以利用會造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[4]。鯖魚屬于青皮紅肉魚類，組織中含有大量游離組氨酸，在微生物中組氨酸脫羧酶的作用下易產(chǎn)生組胺，組胺攝入過多會引起頭暈、惡心等中毒癥狀[5]，因此鯖魚加工副產(chǎn)物的利用受到了極大限制。

研究發(fā)現(xiàn)特定的乳桿菌能抑制組胺生成[6-7]、降低組胺含量[5-6,8]，然而有關(guān)工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境下 (尤其是不滅菌狀態(tài)下) 采用乳桿菌進(jìn)行鯖魚加工副產(chǎn)物發(fā)酵的具體過程卻少見報道。同時，乳桿菌可降解大分子蛋白質(zhì)，形成多肽，提高食品營養(yǎng)價值，使食品產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味[9]，并有一定的抑菌效果，抑制食品腐敗變質(zhì)[10]。盡管在魚茶[6]、臭鱖魚[11]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中不滅菌發(fā)酵工藝已被廣泛采用，并實(shí)踐證明足夠安全，但目前新開發(fā)工藝中仍很少采用該工藝，這為新型固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)帶來了較大的成本壓力。為此，本實(shí)驗選取3株代表性乳桿菌株，以豆粕為基料，在不滅菌情況下對鯖魚加工副產(chǎn)物進(jìn)行固態(tài)厭氧發(fā)酵，嘗試生產(chǎn)飼料用新型活性蛋白源。實(shí)驗系統(tǒng)監(jiān)測了發(fā)酵過程中組胺、酸溶蛋白、pH 和揮發(fā)性鹽基氮 (Total volatile basic nitrogen, TVB-N) 等理化指標(biāo)的變化，對發(fā)酵效果較優(yōu)的一組通過高通量測序進(jìn)行了微生物群落分析，以探索發(fā)酵過程的生物安全性及一些風(fēng)味的形成機(jī)理；對比分析了發(fā)酵前后原料及產(chǎn)品的脂肪酸、游離氨基酸組成和抗原蛋白降解情況，為易產(chǎn)組胺魚類加工副產(chǎn)物的綠色綜合利用與乳桿菌發(fā)酵提供工業(yè)可行的技術(shù)方案和相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯖魚加工副產(chǎn)物由山東美佳集團(tuán)有限公司提供，為去頭鯖魚生產(chǎn)魚片時棄除的魚排，主要包括魚主骨、魚尾及其上殘留的少量魚肉。發(fā)酵所用乳桿菌 [嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus) HSCCLA011，L1；植物乳桿菌 (L. plantarum) HSCCLP121，L2；貝氏乳桿菌 (L. beijerinck) HSCCLB005，L3]由鄭州百益寶生物技術(shù)有限公司提供；豆粕為市售豆粕；硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、鹽酸等試劑均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 樣品處理

將鯖魚加工副產(chǎn)物采用絞肉機(jī)絞碎后與豆粕以質(zhì)量比1∶1混合均勻后作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)備用。

1.2.2 菌液活化

將保存在 ?20 ℃ 的凍干菌粉，加入 100 mL 的無菌溫水中，放入37 ℃的培養(yǎng)箱中活化3 h，結(jié)合前期實(shí)驗探索，確定以 1×106CFU·g?1的接種比例接入發(fā)酵基質(zhì)。

1.2.3 發(fā)酵過程

上述發(fā)酵基質(zhì)分別接入乳桿菌L1、L2、L3，以500 g每袋厭氧封口，并放置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵周期為30 d。滅菌組先經(jīng)過121 ℃、30 min滅菌處理后接入乳桿菌L2。發(fā)酵過程中分別于第1、第3、第5、第7、第14、第21、第30天取樣檢測組胺、pH和TVB-N；在第1、第7、第14、第21、第30天取樣檢測酸溶蛋白。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)品分析

選發(fā)酵效果較優(yōu)的試驗組，在發(fā)酵前和第30天取樣作為原料和產(chǎn)品，檢測其中的游離氨基酸、不飽和脂肪酸、抗原蛋白，并進(jìn)行對比分析。在第1、第7、第21、第30天檢測大豆球蛋白(Glycinin) 和 P-伴大豆球蛋白 (P-conglycinin) 等常見大豆抗原蛋白。在發(fā)酵第1 (為獲得盡可能多樣化的微生物群落)、第30和第270天 (考察產(chǎn)品不滅菌保藏的可行性) 取樣進(jìn)行高通量測序。

1.3 分析檢測方法

1.3.1 酸溶蛋白檢測

參考GB/T 22492—2008《大豆肽粉》以及肖志明等[12]的酸溶蛋白檢測方法。

1.3.2 TVB-N 的檢測

參考 GB 5009. 228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》和沈穎瑩等[11]的TVB-N檢測方法。

1.3.3 組胺的檢測

參考 GB 5009. 208—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測定》中的分光光度法。

1.3.4 抗原蛋白檢測

參考李旺軍等[13]的抗原蛋白檢測方法。

1.3.5 pH 檢測

取 1 g樣品加入 9 mL 水浸提 1 h，用 pH 計檢測。

1.3.6 游離氨基酸組成分析

參考 GB 5 009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》的測定方法。

1.3.7 脂肪酸的氧化程度

脂肪酸檢測參考王建和林秋萍[14]的方法。取樣品10 g，凍干，于錐形瓶中加入氯仿-甲醇溶液(V∶V=4∶1)共100 mL密封，于55 ℃水浴浸提4～5 h，再抽濾獲得有機(jī)浸提液，旋蒸后獲得魚油，最后用無水亞硫酸鈉去除魚油中的水分備用。

1.3.8 DNA 提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 擴(kuò)增及高通量測序分析

DNA的提取參考王興春等[15]的十六烷基三甲基溴化銨提取方法；PCR擴(kuò)增方法以及引物對應(yīng)區(qū)域參考文獻(xiàn) [16-17]的方法；高通量測序分析參考文獻(xiàn) [18-19]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010、Origin 2016 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)均為3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不滅菌鯖魚加工副產(chǎn)物固態(tài)發(fā)酵過程理化指標(biāo)分析

有研究顯示有些乳桿菌具有抑制組胺生成的能力[6-7]。因此，本研究選用3株乳桿菌進(jìn)行鯖魚加工副產(chǎn)物的發(fā)酵。為結(jié)合工業(yè)實(shí)際操作需求，發(fā)酵過程采取原料不滅菌工藝，發(fā)酵過程中的接種量、溫度、原料配比等已在前期實(shí)驗進(jìn)行了充分探索。3株乳桿菌和未接種對照組的組胺、酸溶蛋白、TVB-N和pH等理化指標(biāo)變化見圖1。其中組胺為鯖魚副產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)品理化安全性評價的關(guān)鍵指標(biāo)，TVB-N為理化安全性評價的通用指標(biāo)。

圖1 不同乳桿菌菌株發(fā)酵對鯖魚加工副產(chǎn)物理化指標(biāo)的影響注：L0、L1、L2和L3分別為無任何處理的對照組、接種嗜酸乳桿菌、接種植物乳桿菌和接種貝氏乳桿菌的實(shí)驗組；不同字母之間表示存在顯著性差異 (P<0.05)，圖2同此。Fig. 1 Effects of different lactic acid bacteria fermentation on physicochemical indexe of processed by-products of mackerelNote:L0, L1, L2 and L3 are the control group without any treatment, groups inoculated with L. acidophilus, L. plantarum and L. beijerinck, respectively. Different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Fig. 2.

3株乳桿菌抑制組胺生成的能力見圖1-a。對照組的組胺含量一直呈上升趨勢，第7天即超過0.800 g·kg?1，第 30 天時高達(dá)到 1.09 g·kg?1，且上升趨勢未受到抑制。根據(jù)GB/T 19164—2003，此時產(chǎn)品的該指標(biāo)只與三級魚粉相當(dāng)，未來甚至?xí)?。?組乳桿菌發(fā)酵樣品中，組胺生成均被不同程度抑制。第14天后L2、L3組的組胺含量出現(xiàn)下降，第21天后L1組出現(xiàn)下降，說明樣品中的組胺發(fā)生了降解。其中降解效果最好的是L2組，第30天時組胺已降至 0.629 g·kg?1，接近 GB/T 19164—2003規(guī)定的一等品指標(biāo)。顯著性分析結(jié)果顯示，在第30天植物乳桿菌組的組胺與對照組及其他乳桿菌組差異顯著 (P<0.05)。

Feng等[20]和Zhang等[6]報道了鹽腌鲅魚和草魚魚茶產(chǎn)品中植物乳桿菌致使組胺或總生物胺降解的現(xiàn)象，Dominggoslopes等[21]研究指出副干酪乳桿菌 (L. paracasei) 具有降解組胺的能力。這些研究表明近年來一些乳桿菌尤其是植物乳桿菌，其降解組胺的能力逐漸被發(fā)現(xiàn)。但有關(guān)嗜酸乳桿菌和貝氏乳桿菌降解組胺的能力則未見報道，盡管從本實(shí)驗結(jié)果看其降解能力不及植物乳桿菌。

酸溶蛋白是評價發(fā)酵飼料中小肽含量的重要指標(biāo)[22]。本研究將豆粕作為降低發(fā)酵原料水分的重要輔料，擬通過發(fā)酵將原料中動、植物蛋白降解為小肽成分。發(fā)酵過程中酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化見圖1-b。結(jié)果顯示，在整個發(fā)酵過程中，L1、L3組的酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照組相比增幅較?。欢鳯2組與對照組及其他乳桿菌組比較均有顯著差異(P<0.05)，發(fā)酵第14天時酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到17.5%，第30天達(dá)18.9%。從酸溶蛋白的增長趨勢看，發(fā)酵14 d后增長緩慢，而從組胺抑制或降解效果看，發(fā)酵時間有必要延長至30 d。近年也有利用乳酸菌發(fā)酵豆粕嘗試獲得較高的酸溶蛋白含量的報道，但效果不理想，如謝全喜等[23]報道獲得的酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為10.5%。本實(shí)驗獲得了較高的酸溶蛋白，可能是因為魚蛋白更易被降解或菌種選擇得當(dāng)。

對照組從第14天開始TVB-N指標(biāo)急劇上升，第 21 天時超過了 2.50 g·kg?1(圖1-c)，且氣味表現(xiàn)出嚴(yán)重的氨味和明顯的不愉快氣息，顯示對照組腐化變質(zhì)嚴(yán)重。第30天，對照組的TVB-N與乳桿菌發(fā)酵組的差異極顯著 (P<0.01)。乳桿菌發(fā)酵樣品中的 TVB-N 均得到了有效控制 (僅約 0.50 g·kg?1)，遠(yuǎn)低于GB/T 19164—2003中的特級品要求 (≤1.10 g·kg?1)，且3組均無氨臭味，而是醬香氣息中略帶清新愉悅的酸味。上述結(jié)果說明乳桿菌能在一定程度上減輕氨基酸受到的破壞，減少氨和胺類物質(zhì)的產(chǎn)生，并產(chǎn)生較好的風(fēng)味。有研究指出接種乳酸菌發(fā)酵有利于形成具有清新感覺的氣味活性化合物[24]，這與本實(shí)驗結(jié)果相似。然而其中的醬香氣息并非乳酸菌特有的風(fēng)味，也未見類似現(xiàn)象的報道；其形成原因有待探索。本實(shí)驗同時檢測了發(fā)酵過程中的pH變化 (圖1-d)。3個發(fā)酵組的pH較對照組降低程度更高，其中以L2組降幅最大。

綜上分析，各發(fā)酵組產(chǎn)品的理化安全指標(biāo)能滿足相關(guān)要求。以上結(jié)果表明，植物乳桿菌在降低產(chǎn)品組胺含量、降解蛋白質(zhì)成小肽以及降低pH方面，均優(yōu)于另外兩種乳桿菌，為此后文對其作重點(diǎn)分析。

2.2 與滅菌發(fā)酵過程的對比

為進(jìn)一步分析不滅菌發(fā)酵過程與滅菌發(fā)酵過程的差異，本研究對比考察了滅菌不接種乳桿菌(S0)、滅菌接種乳桿菌 (S1)、不滅菌接種乳桿菌(S2) 的酸溶蛋白、組胺、TVB-N和pH等指標(biāo)的變化。結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，滅菌后的兩組酸溶蛋白增量非常有限；不滅菌組的酸溶蛋白在整個發(fā)酵過程中保持強(qiáng)勁的增加趨勢，與不滅菌的兩組相比有顯著差異 (P<0.05) (圖2)。推測未滅菌原料中可能同樣含有降解蛋白的酶類或微生物，這可能是本實(shí)驗采用乳桿菌獲得的酸溶蛋白量比謝全喜等[23]更高的另一原因。綜合圖2-a和圖1-b中滅菌接種組和不滅菌接種組結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)源酶或微生物與接種植物乳桿菌對蛋白的降解作用可能存在協(xié)同效應(yīng)。上述發(fā)現(xiàn)尚未見報道。

圖2 滅菌與不滅菌發(fā)酵對鯖魚加工副產(chǎn)物理化指標(biāo)的影響注：S0、S1、S2 分別為滅菌不接種乳桿菌、滅菌接種乳桿菌、不滅菌接種乳桿菌；組胺相對含量由每一組組胺實(shí)際含量除以第 0 天未發(fā)酵的組胺實(shí)際含量計算得出。Fig. 2 Effects of sterilization and non-sterilization fermentation on physicochemical indexes of processed by-products of mackerel Note:S0, S1 and S2 represent sterilization without inoculation of lactic acid bacteria, and non-sterilization with inoculation of lactic acid bacteria, respectively. The relative histamine content is calculated by the actual histamine content of each group by the actual histamine content of the sterilization group on 0th day.

圖2-b和圖2-c顯示，不滅菌組的組胺和TVB-N值均高于滅菌組，推測這與滅菌組的蛋白未被充分降解有一定關(guān)系，因為組胺的產(chǎn)生要以組織中的游離組氨酸為底物[20]，而TVB-N是以游離氨基酸為基礎(chǔ)產(chǎn)生的。鯖魚副產(chǎn)物中最令人關(guān)注的理化安全指標(biāo)——組胺在第30天時已經(jīng)從相對高位降至低于滅菌不接種組，進(jìn)一步驗證了植物乳桿菌具有一定的組胺降解能力。

本實(shí)驗結(jié)果顯示出了不滅菌發(fā)酵產(chǎn)品理化指標(biāo)的安全性，因此滅菌組在安全指標(biāo)上的優(yōu)勢不大。從生產(chǎn)實(shí)踐角度看，滅菌操作在增加成本的同時降低了產(chǎn)品關(guān)鍵指標(biāo) (酸溶蛋白)，顯然是無法接受的。

2.3 基于高通量測序的發(fā)酵過程微生物群落分析

在不滅菌發(fā)酵過程中，微生物安全性一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)[6,20]。有研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌具有抑制產(chǎn)組胺微生物生長的能力[25-26]，本實(shí)驗所用的植物乳桿菌是否也有這種能力值得深究。因此，基于高通量測序?qū)χ参锶闂U菌發(fā)酵組進(jìn)行了不滅菌發(fā)酵過程的微生物群落分析，Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果見表1。

表1 植物乳桿菌發(fā)酵鯖魚加工副產(chǎn)物的Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of processed by-products of mackerel fermented by L. plantarum

表1顯示，所有樣品覆蓋率均為1，即操作分類單元 (Operational taxonomic units, OTUs) 的測序覆蓋率均為100%，表明檢測過程捕獲了主要的OTUs，檢測結(jié)果可信。各多樣性指數(shù)顯示，不接種對照組的ACE、Chao1、香農(nóng)指數(shù)30 d后均上升，且ACE和Chao1指數(shù)遠(yuǎn)高于發(fā)酵組，即對照組微生物物種總數(shù)增加，初步說明鯖魚加工副產(chǎn)物不經(jīng)滅菌易滋生各種雜菌，從而加速腐敗進(jìn)程。而對照組的香農(nóng)指數(shù)一直低于發(fā)酵組，說明對照組和處理組相比個體分布更不均勻，這可能因為未接種的原料中有某些優(yōu)勢的腐敗菌生長。而發(fā)酵組數(shù)據(jù)顯示，第30天時，ACE、Chao1指標(biāo)出現(xiàn)下降，香農(nóng)指數(shù)表現(xiàn)出比對照組更高的上升趨勢，說明此時產(chǎn)品中的微生物物種數(shù)受到抑制而降低，但已有物種的分布均勻度還較高。

本實(shí)驗進(jìn)一步將樣品貯存至第270天，以考察發(fā)酵產(chǎn)品的長期保藏性能。結(jié)果顯示，ACE、Chao1、香農(nóng)指數(shù)均大幅下降，即該產(chǎn)品在長期保存過程中樣品物種總數(shù)和種類分布均勻度均有所降低，微生物生長受到進(jìn)一步抑制。且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品在長期保存過程中乳桿菌的生長優(yōu)勢更明顯。

本實(shí)驗進(jìn)一步選取了門和屬水平上豐度最高的10個細(xì)菌群落做樣品微生物豐富度柱狀圖 (圖3-a和圖3-b)。在門水平上，初始發(fā)酵第1天鑒定出含量較高的菌種有藍(lán)藻菌門、變形菌門、厚壁菌門，與未接種的對照組一致。根據(jù)Zang等[27]，含量最高的藍(lán)藻菌門應(yīng)是來自生魚肉的主要菌種，門內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明確的危害菌類；厚壁菌門中的多數(shù)菌種為有益菌[28]，本實(shí)驗所用乳桿菌即屬于該門；而變形菌門內(nèi)的危害菌較多，如沙門氏菌、假單胞菌等均屬于該門[29]。

圖3 不同發(fā)酵階段的細(xì)菌群落相對豐度注：保藏 270 d 指發(fā)酵后保存在常溫下 270 d；圖 4 同此。Fig. 3 Relative abundance of bacterial communities at different fermentation stagesNote:Storage of 270 d means storing at room temperature for 270 d after fermentation; the same case in Fig. 4.

30 d后，對照組中藍(lán)藻菌門豐度基本不變，厚壁菌門有一定增加；發(fā)酵組中含乳桿菌的厚壁菌門豐度大幅上升，成為優(yōu)勢菌，而變形菌門豐度大幅減少 (圖3-a)。對發(fā)酵產(chǎn)品長期保藏后 (270 d)，厚壁菌門豐度上升至94.9%，占絕對優(yōu)勢，而變形菌門豐度進(jìn)一步降低。這說明經(jīng)乳桿菌發(fā)酵的產(chǎn)品能抑制變形菌門中危害菌的生長，因此在發(fā)酵和保藏過程中可有效防止該門危害菌的侵染。

對比圖3-a和圖3-b，可以認(rèn)定厚壁菌門的豐度全部來自于乳桿菌屬，而未分屬的葉綠體菌屬(UnidentifiedChloroplast) 極有可能是藍(lán)藻門豐度的貢獻(xiàn)者。發(fā)酵產(chǎn)品保存第270天時乳桿菌屬豐度為92.0%，與厚壁菌門基本一致。

值得注意的是，變形菌門下并沒有豐度很高的絕對優(yōu)勢菌，只統(tǒng)計到假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬 (Psychrobacter)。有研究表明假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬均為產(chǎn)生組胺的主要菌種[30]。本研究的豐度數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵組假單胞菌屬30 d為0.645%，保存270 d后降低到0.394%；嗜冷桿菌屬 30 d 為 0.075 2%，保存 270 d 后消失。說明發(fā)酵產(chǎn)品中組胺含量的降低除來自于自身的降解能力外，還可能來自于乳桿菌對其中產(chǎn)組胺菌的抑制。對照圖3-b中發(fā)酵30 d的結(jié)果可知，發(fā)酵第30天時雖然乳桿菌已占優(yōu)勢，但其他菌種也有豐度增加的現(xiàn)象，這與表1中香農(nóng)指數(shù)的增加一致。而經(jīng)歷長期貯存后，乳桿菌對嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬等潛在危害菌的抑制作用會得到進(jìn)一步加強(qiáng)。

Feng等[20]和Zhang等[6]在植物乳桿菌發(fā)酵魚類產(chǎn)品實(shí)驗中通過高通量測序分析了細(xì)菌群落，但所報道的其他菌類受抑制程度遠(yuǎn)低于本實(shí)驗結(jié)果，這可能是由于菌種不同，也可能與原料成分不同(如鹽或大米的加入) 有關(guān)。

迄今發(fā)現(xiàn)有關(guān)乳桿菌對真菌群落影響的報道較少，僅Liu等[31]對青貯飼料進(jìn)行過類似的探索；在不滅菌發(fā)酵背景下這類分析非常必要。本研究分析了發(fā)酵過程中真菌群落的動態(tài)變化。在門水平上，擔(dān)子菌門、子囊菌門為鑒定的最主要菌門(圖4-a)。乳桿菌發(fā)酵組中，早期擔(dān)子菌一度獲得了生長優(yōu)勢，但長期貯存過程中出現(xiàn)變化，估計這與多數(shù)真菌的好氧需求有關(guān)。早期有一定氧含量時，乳桿菌可能會協(xié)同部分真菌生長，而在長期貯存過程中大量真菌進(jìn)入休眠狀態(tài)，群落豐富度反而有所提升。值得注意的是，著名的真菌危害菌——黃曲霉菌 (Aspergillus flavus) 即屬于子囊菌門下的曲霉菌屬[32]。從乳桿菌發(fā)酵30 d的結(jié)果來看，該門豐度降低，說明其中物種同樣受到了抑制；而長期貯存后 (270 d)，子囊菌門豐度出現(xiàn)大幅增加，值得進(jìn)一步關(guān)注。

圖4 不同發(fā)酵階段真菌群落的相對豐度Fig. 4 Relative abundance of fungal communities at different fermentation stages

從屬水平上看，長期貯存的發(fā)酵產(chǎn)品中不明確物種的菌種比例進(jìn)一步增加 (圖4-b)。對照組中屬名明確、豐度在前兩名的分別是耐干霉菌屬 (Xeromyces) 和曲霉菌屬 (Aspergillus)，均屬于子囊菌門[33-34]。對照組中這兩個屬在30 d后相對豐度輕微增加 (曲霉菌屬從3.14%提升到3.17%；耐干霉菌屬從3.52%提升到5.07%)，但發(fā)酵組中這兩屬并未占優(yōu)勢，尤其是可能含有潛在危害菌的曲霉菌屬，第1天豐度為21.5%，第30天時一度消失，第270天豐度再次輕微增至1.67%，整體呈大幅下降趨勢。說明該發(fā)酵過程能抑制存在潛在危害的曲霉菌屬。

另外，在屬水平上，發(fā)酵組出現(xiàn)一些酵母屬豐度大幅波動的現(xiàn)象。發(fā)酵第30天時，真菌中的絕對優(yōu)勢菌為擔(dān)子菌門的絲孢酵母屬 (Trichosporon)[35]，占比高達(dá)76.9%；貯存第270天時，屬于子囊菌門的另一種酵母屬Trichomonascus則成為絕對優(yōu)勢真菌。上述兩種酵母屬為酒曲、豆豉等產(chǎn)品中常見的菌種，還有生香功能[36-37]。這一發(fā)現(xiàn)解釋了前述發(fā)酵產(chǎn)品出現(xiàn)醬香的原因，之前未見類似報道。推測這一現(xiàn)象與酵母菌屬的兼性厭氧性有關(guān)。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)品游離氨基酸、脂肪酸及抗原蛋白分析

2.4.1 游離氨基酸組成

鯖魚及其加工副產(chǎn)物產(chǎn)組胺的首要原因是魚肉中存在大量游離組氨酸[38]，從而被組胺產(chǎn)生菌利用生成組胺，因此本實(shí)驗對產(chǎn)品中的游離氨基酸進(jìn)行分析 (表2)。結(jié)果顯示，長時間放置游離氨基酸總量均出現(xiàn)了一定程度的升高，多數(shù)氨基酸比例基本保持不變。然而對照組組氨酸含量有明顯變化(由 2.18 降至 1.88 mg·g?1)，而發(fā)酵組中組氨酸含量則略有升高。推測對照組組氨酸可能被組胺產(chǎn)生菌降解成了組胺，而發(fā)酵組組氨酸在生成與被降解或利用之間形成了平衡。結(jié)合圖1-a發(fā)酵組的組胺變化，與菌相分析中產(chǎn)組胺的假單胞菌和嗜冷桿菌等雖已得到一定的抑制但尚未被完全消除的推測相互印證。結(jié)合其他研究[6-7,25]，再次印證了本實(shí)驗所選的乳桿菌具有抑制組胺產(chǎn)生菌的效果。

表2 乳桿菌發(fā)酵鯖魚加工副產(chǎn)物游離氨基酸組成的變化Table 2 Changes of free amino acid composition of processed by-products of mackerel fermented by lactic acid bacteria mg·g?1

2.4.2 脂肪酸組成分析

鯖魚富含脂肪，其中大量存在的不飽和脂肪酸是其重要的功能性營養(yǎng)成分，然而其保藏性能相對較差，易被氧化[39]。因此檢測了發(fā)酵前后產(chǎn)品中的脂肪酸組成，結(jié)果見表3。發(fā)酵后各不飽和脂肪酸比例有小幅升高，說明未被氧化損失。這主要可能是發(fā)酵過程的厭氧環(huán)境使然，也可能是植物乳桿菌具有抗氧化能力的體現(xiàn)[40]，還可能有乳桿菌發(fā)酵過程分解脂肪產(chǎn)生不飽和脂肪酸的作用[41]。

表3 乳桿菌發(fā)酵前后脂肪酸組成變化Table 3 Changes of fatty acid composition before and after lactic acid bacteria fermentation %

豆粕是本實(shí)驗的主要基料，大豆中的抗原蛋白具有抗原性和致敏性[42]。因此采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 測定了發(fā)酵組和未接種對照組中豆粕抗原蛋白的降解情況 (圖5)。結(jié)果顯示，發(fā)酵第21天時抗原蛋白條帶已消失 (分子量為22～76 kD)，說明抗原蛋白如大豆球蛋白和P-伴大豆球蛋白等已被充分降解，而對照組抗原蛋白條帶一直存在。

圖5 乳桿菌發(fā)酵降解抗原蛋白的SDS-PAGE蛋白電泳圖譜Fig. 5 SDS-PAGE electrophoretic pattern of lactobacilli protein degraded by fermentation

3 結(jié)論

本研究針對鯖魚加工副產(chǎn)物的固態(tài)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)飼料用新型活性蛋白源的過程，得出：

1) 發(fā)酵工藝上，植物乳桿菌HSCC-LP121在待選菌株中表現(xiàn)優(yōu)異。綜合考慮蛋白降解效果、組胺降低效果以及TVB-N等指標(biāo)，發(fā)酵時間以30 d為宜，此時組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.629 g·kg?1，酸溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 18.9%，TVB-N 為 0.476 g·kg?1，抗原蛋白條帶消失。在組胺生成抑制方面，本實(shí)驗所選乳桿菌均能抑制鯖魚加工副產(chǎn)物中組胺的生成。

2) 不滅菌發(fā)酵的生物安全性方面，植物乳桿菌在發(fā)酵過程中能有效抑制組胺產(chǎn)生菌嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬等潛在危害細(xì)菌及曲霉菌屬等潛在危害真菌的生長。

3) 相對于滅菌發(fā)酵工藝結(jié)果，不滅菌發(fā)酵工藝的酸溶蛋白含量大幅增加，同時其組胺和TVB-N等理化安全指標(biāo)也符合相關(guān)產(chǎn)品的國標(biāo)要求，充分證明該發(fā)酵過程不滅菌的合理性。其在節(jié)能的同時保全了產(chǎn)品的功能性營養(yǎng)成分和風(fēng)味，且鯖魚副產(chǎn)物中不飽和脂肪酸成分基本保持不變。

長期貯存結(jié)果顯示，發(fā)酵產(chǎn)品沒有滋生雜菌或質(zhì)量劣化，甚至植物乳桿菌的發(fā)酵過程還誘使多種酵母菌屬在發(fā)酵及長期保存中產(chǎn)生了生長優(yōu)勢，為產(chǎn)品附加了醬香風(fēng)味。