二氧化碳麻醉對(duì)羅非魚(yú)生理及品質(zhì)的影響

袁圓玥，岑劍偉，李來(lái)好，楊賢慶，黃 卉，魏 涯，郝淑賢，趙永強(qiáng)，王悅齊，林 織

1. 上海海洋大學(xué)，上海 201306

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3. 大連工業(yè)大學(xué)/海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034

4. 廣東順欣海洋漁業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 陽(yáng)江 529800

羅非魚(yú) (Oreochromis niloticus) 富含優(yōu)質(zhì)蛋白和不飽和脂肪酸，肉鮮刺少，價(jià)格低廉，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。2021年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)顯示，2020年羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到165.54 萬(wàn)噸，是我國(guó)主要淡水養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一[1]。魚(yú)類極易受不良環(huán)境因素影響而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，羅非魚(yú)體側(cè)高，背鰭發(fā)達(dá)，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，鰭棘會(huì)豎起以防御，具有一定的攻擊性，易對(duì)操作者和魚(yú)體造成傷害，不利于羅非魚(yú)的流通、運(yùn)輸操作。為了減緩活魚(yú)運(yùn)輸、包裝、檢查采樣、轉(zhuǎn)移搬運(yùn)等流通環(huán)節(jié)引起的應(yīng)激反應(yīng)，減少魚(yú)體損傷，提高操作便捷性及成活率，通常采用麻醉技術(shù)抑制其神經(jīng)系統(tǒng)并減弱對(duì)環(huán)境變化的敏感性，降低魚(yú)的活動(dòng)能力，使其新陳代謝處于低水平，減少應(yīng)激反應(yīng)帶來(lái)的負(fù)面影響。在眾多麻醉劑中，間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽 (MS-222)、丁香酚和二氧化碳 (CO2) 常用于水產(chǎn)品領(lǐng)域，但藥用麻醉處理劑會(huì)在魚(yú)體內(nèi)富集，多國(guó)明確規(guī)定了MS-222、丁香酚等化學(xué)麻醉劑在魚(yú)體內(nèi)的最大殘留量和休藥期，合規(guī)方可銷售和食用[2]。早在1943年，已有學(xué)者提出將CO2作為麻醉劑[3]。丁亞濤[4]研究發(fā)現(xiàn)，CO2可以降低鳊魚(yú)(Parabramis pekinensis)在運(yùn)輸時(shí)的生理生化反應(yīng)，延長(zhǎng)?；顣r(shí)間。Oliveira等[5]研究表明，CO2可減輕細(xì)鱗鯧 (Piaractus mesopotamicus)的生理應(yīng)激。CO2麻醉處理具有成本低、體內(nèi)無(wú)殘留、無(wú)藥物消退期等優(yōu)點(diǎn)，且在通風(fēng)條件下對(duì)于操作人員和環(huán)境均無(wú)傷害，是一種安全、理想的藥用麻醉劑替代品。本文主要探索了CO2麻醉羅非魚(yú)的裝備及技術(shù)條件，研究CO2對(duì)羅非魚(yú)的麻醉效果，及其對(duì)羅非魚(yú)的血清生化、呼吸代謝、氧化應(yīng)激、肌肉質(zhì)構(gòu)特性等指標(biāo)的影響，為CO2麻醉在魚(yú)類長(zhǎng)途運(yùn)輸操作和抗應(yīng)激中的研究及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚(yú)購(gòu)于廣州大江苑農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，體質(zhì)量為(700±100) g，停食暫養(yǎng)于 50 L 水箱中 24 h，暫養(yǎng)期間保持水體清潔及氧氣泵正常工作，保證供氧充足。

糖原、乳酸、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、總抗氧化能力測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司，魚(yú)皮質(zhì)醇ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SF203000A冷水機(jī) (蘇州肯道節(jié)能設(shè)備公司)、溫度傳感器 (上海DFRobot公司)、pH電極傳感器(上海 DFRobot公司)、Multi3630 IDS 便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀 (德國(guó)WTW公司)、Synergy全功能酶標(biāo)儀 (美國(guó) BioTek 公司)；CT3 質(zhì)構(gòu)儀 (美國(guó)Brookfield公司)、BS-800M全自動(dòng)生化分析儀 (深圳邁瑞生物醫(yī)療公司)；麻醉裝置由麻醉桶、微孔曝氣管、耐壓導(dǎo)氣管、二氧化碳減壓閥、液化二氧化碳鋼瓶組成 (圖1)。復(fù)蘇裝置由復(fù)蘇池、氣泵、氣石等器件組成。

圖1 二氧化碳麻醉裝置示意圖Fig. 1 Schematic of CO2 anesthesia device

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)步驟

微孔曝氣管呈螺旋狀均勻鋪設(shè)于直徑為38 cm、高度54 cm的麻醉桶底部，以氣壓0.4 Mpa向其中持續(xù)充入CO2，CO2經(jīng)耐壓導(dǎo)氣管到微孔曝氣管進(jìn)入水體，得到pH為4.7～5.0、溶解氧未檢出的CO2飽和溶液，并以0.1 Mpa氣流持續(xù)通入CO2以維持飽和狀態(tài)，獲得麻醉液。將羅非魚(yú)轉(zhuǎn)移至麻醉液中進(jìn)行麻醉實(shí)驗(yàn)，觀察不同水溫對(duì)魚(yú)體的麻醉效果差異。麻醉完畢后，迅速將羅非魚(yú)轉(zhuǎn)移至復(fù)蘇池進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇池溶解氧質(zhì)量濃度為 8.30～9.30 mg·L?1，水溫為20～25 ℃，并持續(xù)打氧，評(píng)價(jià)復(fù)蘇效果。抽取不同階段的樣品，檢測(cè)麻醉-復(fù)蘇羅非魚(yú)的血清生化指標(biāo)、代謝產(chǎn)物指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、肌肉質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)。

1.3.2 不同水溫對(duì) CO2麻醉羅非魚(yú)效果的影響

參照羅晶晶等[6]和高仁法等[7]的方法并稍作修改，本試驗(yàn)將麻醉程度分為4個(gè)階段 (A1—A4)，復(fù)蘇程度分為4個(gè)階段 (R1—R4)。用抄網(wǎng)將停食暫養(yǎng)的魚(yú)轉(zhuǎn)移到麻醉液中浸泡，當(dāng)魚(yú)出現(xiàn)中度麻醉(A3 期) 至深度麻醉 (A4 期) 反應(yīng)現(xiàn)象，表明羅非魚(yú)進(jìn)入麻醉狀態(tài)。麻醉時(shí)間從魚(yú)體被放入CO2麻醉液開(kāi)始計(jì)時(shí)至從麻醉液中撈出結(jié)束，復(fù)蘇時(shí)間為麻醉的羅非魚(yú)放入清水開(kāi)始到R4期 (表1)。

表1 羅非魚(yú)在不同麻醉階段和復(fù)蘇階段的行為特征Table 1 Behavioral characteristics of tilapia at different anesthesia and resuscitation stages

準(zhǔn)備5個(gè)水箱，在魚(yú)、水質(zhì)量比為1∶2的條件下，使用循環(huán)水冷機(jī)調(diào)整水溫梯度為5、10、15、20、25 ℃，制備好麻醉液。隨機(jī)選取羅非魚(yú)進(jìn)行麻醉實(shí)驗(yàn)，每個(gè)溫度5 尾，平行5次，記錄麻醉時(shí)間，麻醉完畢后將羅非魚(yú)打撈至復(fù)蘇池中進(jìn)行復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)，記錄復(fù)蘇時(shí)間和復(fù)蘇率，并記錄24和48 h的成活率。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)取樣

以暫養(yǎng)狀態(tài)下的羅非魚(yú)為對(duì)照組，以15 ℃麻醉的羅非魚(yú)為麻醉組，以15 ℃麻醉并復(fù)蘇的羅非魚(yú)為復(fù)蘇組，以15 ℃麻醉后復(fù)蘇存活24 h的羅非魚(yú)為復(fù)蘇24 h組，對(duì)比4組羅非魚(yú)生理指標(biāo)的變化。

對(duì)照組、麻醉組、復(fù)蘇組、復(fù)蘇24 h組中各取3尾魚(yú)，置于冰盤(pán)上，斷尾取血，全血不加抗凝劑，常溫靜置待血液凝固后4 ℃冷藏過(guò)夜，當(dāng)血清自然析出，以 4 ℃、3 000 r·min?1離心 10 min，取上層血清，保存?zhèn)溆?。采血后迅速取肝臟和魚(yú)背部肌肉，用生理鹽水充分漂洗吸干水分后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

血清生化指標(biāo)的測(cè)定：谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、堿性磷酸酶 (ALP)、血糖 (Glu)使用血液生化自動(dòng)分析儀，皮質(zhì)醇 (COR) 含量使用南京建成生物工程有限公司的皮質(zhì)醇ELISA試劑盒，對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定。

代謝產(chǎn)物指標(biāo)的測(cè)定：糖原 (GLY)、乳酸 (LD)含量的測(cè)定使用南京建成生物工程有限公司的糖原測(cè)定試劑盒和乳酸試劑盒，對(duì)肌肉和肝臟樣品進(jìn)行測(cè)定。

氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定：丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSHPx)、總抗氧化能力 (T-AOC) 使用南京建成生物工程有限公司的測(cè)定試劑盒，對(duì)肝臟樣品進(jìn)行測(cè)定。

肌肉質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)測(cè)定：將魚(yú)背部肌肉修整為 8 cm×3 cm×1 cm 的魚(yú)片，使用 Brookfield LFRA-100型質(zhì)構(gòu)儀及P/44平底圓柱形探頭測(cè)定硬度、膠著性、咀嚼性、彈性，在質(zhì)地多面剖析 (TPA) 模式下循環(huán)壓縮 2 次，測(cè)試速度為 1 mm·s?1，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載為5.0 g，下壓距離5 mm。每組取魚(yú)片6 片，每片取8 點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 Microsoft Excel 2010 和 JMP Pro14軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，單因素方差分析采用LSD法，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE)”表示，差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。使用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水溫對(duì) CO2 麻醉羅非魚(yú)效果的影響

不同水溫條件下CO2對(duì)羅非魚(yú)的麻醉效果見(jiàn)表2。在15 ℃下CO2飽和溶液中，羅非魚(yú)的麻醉時(shí)間約為 101 s，5 、10 、20 ℃ 需約 150 s才能進(jìn)入麻醉狀態(tài)，25 ℃則需約326 s。不同麻醉溫度條件處理后，羅非魚(yú)均可100%復(fù)蘇成活，羅非魚(yú)在15 ℃下CO2飽和溶液處理組的復(fù)蘇時(shí)間約為134 s，其他處理組羅非魚(yú)的復(fù)蘇時(shí)間介于251～396 s。CO2作為麻醉劑對(duì)羅非魚(yú)無(wú)致死作用，5組溫度條件麻醉的羅非魚(yú)48 h仍可存活。有研究認(rèn)為，理想的麻醉效果應(yīng)是麻醉和恢復(fù)均較為迅速[8]。本實(shí)驗(yàn)選擇15 ℃作為最佳麻醉處理溫度，在15 ℃水溫條件下CO2飽和溶液中相比其他處理組的麻醉用時(shí)和復(fù)蘇用時(shí)均最短。本實(shí)驗(yàn)采用的曝氣材料為納米微孔管，通氣時(shí)微孔曝氣管均勻擴(kuò)張，以0.4 Mpa向其中持續(xù)充氣，麻醉液pH值接近5，溶解氧濃度為 0 mg·L?1，表明麻醉液達(dá)到飽和狀態(tài)，CO2在水中呈現(xiàn)煙霧飄散狀態(tài)，與水的接觸面增大，上浮速度慢，CO2溶解效果均勻，提高了CO2的利用率。

表2 不同溫度下二氧化碳麻醉羅非魚(yú)的效果Table 2 CO2 anesthesia effect on tilapia at different temperatures

2.2 CO2 麻醉對(duì)羅非魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

當(dāng)魚(yú)類遭受環(huán)境因子的脅迫時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺軸 (HPA軸) 興奮性提高，腎上腺分泌壓力激素[9-10]。在眾多壓力激素中，皮質(zhì)醇與脅迫因子的關(guān)系最為密切。多項(xiàng)研究表明，皮質(zhì)醇是應(yīng)激反應(yīng)的靈敏指標(biāo)。齊紅莉等[11]對(duì)美洲鰣 (Alosa sapi-dissima) 施加脅迫后發(fā)現(xiàn)，其皮質(zhì)醇含量迅速增加了約48 倍。由圖2可知，經(jīng)飽和CO2脅迫后的羅非魚(yú)皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度為 (89.97±3.78) ng·mL?1，與對(duì)照組相比顯著升高，復(fù)蘇組和復(fù)蘇24 h組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，但較麻醉組羅非魚(yú)的皮質(zhì)醇顯著降低。CO2環(huán)境脅迫激活了羅非魚(yú)HPA軸，促使皮質(zhì)醇大量分泌，從而應(yīng)對(duì)壓力，羅非魚(yú)皮質(zhì)醇在脅迫解除后恢復(fù)到對(duì)照組水平。HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要部分，具有一套負(fù)反饋機(jī)制，大量的皮質(zhì)醇又可以通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，抑制HPA軸繼續(xù)產(chǎn)生壓力激素[12]。麻醉組血糖濃度為 (9.92±0.05) mmol·L?1，顯著高于其余實(shí)驗(yàn)組，出現(xiàn)典型的應(yīng)激性高血糖癥，高血糖可以給魚(yú)體提供足夠的能量以抵抗低氧環(huán)境。范興[13]研究了CO2麻醉對(duì)羅非魚(yú)和卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus)離水?；畹挠绊懀Y(jié)果表明，麻醉組樣本血清皮質(zhì)醇、血糖高于非麻醉組。血糖呈先升后降趨勢(shì)與皮質(zhì)醇一致， 皮質(zhì)醇屬于一種糖皮質(zhì)激素，可以增加肝糖原的合成，抑制組織對(duì)葡萄糖的利用，從而導(dǎo)致血糖上升[14]。

圖2 二氧化碳麻醉對(duì)血清皮質(zhì)醇和血糖濃度的影響Fig. 2 CO2 anesthesia effect on concentration of serum cortisol and blood glucose

對(duì)照組、麻醉組、復(fù)蘇組、復(fù)蘇24 h組羅非魚(yú)血清AST、ALT、ALP活性均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，變化顯著 (圖3)。AST和ALT是魚(yú)體新陳代謝過(guò)程中必不可少的“催化劑”。AST主要存在于心肌組織，其次是肝組織，ALT主要存在于肝臟組織細(xì)胞中。魚(yú)體健康的狀態(tài)下，AST和ALT在血清中的含量很低，當(dāng)這兩種酶活性變化時(shí)，表示肝臟組織和心肌組織受損。與其余實(shí)驗(yàn)組相比，麻醉組羅非魚(yú)兩種酶活性顯著升高，可能是由于飽和CO2水體對(duì)羅非魚(yú)造成的脅迫致使魚(yú)體肝臟組織和心肌組織損傷嚴(yán)重，細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致AST和ALT被大量釋放入血，引起血清中酶活性顯著升高[15]。復(fù)蘇組羅非魚(yú)兩種酶活性較麻醉組均顯著降低，但較對(duì)照組均顯著升高，這可能是因?yàn)閺?fù)蘇組水中氧氣充足，環(huán)境脅迫得到緩解，但肝功能和心肌功能未完全恢復(fù)。復(fù)蘇24 h組AST、ALT活性低于麻醉組，但顯著高于對(duì)照，說(shuō)明魚(yú)體自然恢復(fù)24 h后，肝功能和心肌功能有一定程度緩解。

圖3 二氧化碳麻醉對(duì)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活性的影響Fig. 3 CO2 anesthesia effect on activities of serum aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and alkaline phosphatase

ALP廣泛存在于各組織器官中，主要由肝臟合成分泌，也可以指示肝損傷。ALP是一種在堿性環(huán)境下能夠去磷酸化的水解酶，參與機(jī)體生理代謝，加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體磷代謝，為ADP磷酸化為ATP提供更多的無(wú)機(jī)磷，也是非特異性免疫系統(tǒng)重要的水解酶[16]。麻醉組羅非魚(yú)ALP活性顯著高于對(duì)照組、復(fù)蘇組和復(fù)蘇24 h組，提示麻醉處理對(duì)羅非魚(yú)造成肝損傷，也間接反映魚(yú)體免疫系統(tǒng)增強(qiáng)。但復(fù)蘇組、復(fù)蘇24 h組ALP較對(duì)照組顯著降低，有可能是ALP通過(guò)保持低活性來(lái)降低機(jī)體組織細(xì)胞的生理活動(dòng)。

2.3 CO2 麻醉對(duì)羅非魚(yú)代謝物質(zhì)含量的影響

實(shí)驗(yàn)組羅非魚(yú)糖原含量較對(duì)照組顯著下降(圖4)。糖原主要存在于肝臟和骨骼肌中，是魚(yú)體儲(chǔ)備的重要能源物質(zhì)，抵抗脅迫時(shí)加速分解為機(jī)體供能。麻醉組、復(fù)蘇組肝糖原顯著低于初始狀態(tài)，說(shuō)明在無(wú)氧或低氧條件下，魚(yú)體需要大量能量以抵抗脅迫因子對(duì)自身的傷害，此時(shí)將加速糖原的分解代謝[17]。麻醉組、復(fù)蘇組肌糖原含量較對(duì)照組顯著下降，說(shuō)明肌肉的無(wú)氧酵解過(guò)程被啟動(dòng)以提供能量，并伴隨乳酸和ATP生成[18]。復(fù)蘇24 h組肌糖原較麻醉組、復(fù)蘇組顯著增加，而復(fù)蘇24 h組肝糖原較麻醉組、復(fù)蘇組顯著降低，說(shuō)明復(fù)蘇24 h羅非魚(yú)主要是通過(guò)肝糖原的降解為機(jī)體供能。有研究表明，饑餓脅迫狀態(tài)下魚(yú)優(yōu)先動(dòng)用肝臟內(nèi)的儲(chǔ)能物質(zhì)作為能源，通過(guò)肝糖原分解和糖異生作用維持血糖平衡[19]。

圖4 二氧化碳麻醉對(duì)代謝物質(zhì)含量的影響Fig. 4 CO2 anesthesia effect on content of metabolites

羅非魚(yú)乳酸含量先上升后下降 (圖4)。乳酸是葡萄糖發(fā)生無(wú)氧酵解的產(chǎn)物，當(dāng)組織處于應(yīng)激反應(yīng)或無(wú)氧環(huán)境時(shí)，線粒體三羧酸循環(huán)中的丙酮酸不能有氧氧化而還原為乳酸。在麻醉過(guò)程中，羅非魚(yú)在缺氧狀態(tài)的麻醉液中反應(yīng)激烈，糖酵解產(chǎn)生的乳酸是無(wú)氧呼吸的最終產(chǎn)物，因此，麻醉狀態(tài)的羅非魚(yú)乳酸含量顯著高于初始水平。本實(shí)驗(yàn)觀察到，復(fù)蘇組羅非魚(yú)在復(fù)蘇過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)快速游動(dòng)甚至撞壁的現(xiàn)象，可能是魚(yú)體感受到環(huán)境從無(wú)氧到有氧的快速變化，肌肉運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，產(chǎn)生乳酸，結(jié)果顯示復(fù)蘇組乳酸含量顯著高于復(fù)蘇24 h組。復(fù)蘇24 h期間，氧氣充足，魚(yú)體恢復(fù)正常，運(yùn)動(dòng)較少，乳酸參與細(xì)胞和生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)，含量降低。復(fù)蘇組羅非魚(yú)肝乳酸含量較麻醉組顯著上升，而復(fù)蘇組羅非魚(yú)肌乳酸含量較麻醉組顯著下降，可能是由于復(fù)蘇需要大量能量，肝臟通過(guò)血液攝取肌肉中的乳酸，在乳酸脫氫酶的作用下進(jìn)一步分解為H2O和CO2，為魚(yú)體提供能量[20]。金一春等[21]在研究CO2麻醉對(duì)白斑狗魚(yú) (Esox lucius) 的影響中發(fā)現(xiàn)，相較麻醉前，復(fù)蘇后白斑狗魚(yú)肝糖原顯著降低，肝乳酸顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4 CO2 麻醉對(duì)羅非魚(yú)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

4組羅非魚(yú)肝臟中MDA水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì) (圖5)。正常生理?xiàng)l件下，由抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)組成的抗氧化體系具有一定的修復(fù)能力，不斷消除自由基，使自由基的產(chǎn)生及消除處于動(dòng)態(tài)平衡，而低氧脅迫會(huì)使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過(guò)量自由基[22-23]。MDA是過(guò)量的自由基與生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物[24]。麻醉組、復(fù)蘇組MDA含量均顯著高于對(duì)照組，表明麻醉過(guò)程極度缺氧使羅非魚(yú)產(chǎn)生了大量氧自由基，且復(fù)蘇組羅非魚(yú)體內(nèi)仍有大量氧自由基。而復(fù)蘇24 h組MDA含量較復(fù)蘇組、麻醉組顯著下降，說(shuō)明復(fù)蘇24 h過(guò)程中魚(yú)體的脂質(zhì)過(guò)氧化程度得到一定緩解。為了抵抗自由基傷害，機(jī)體需合成各類抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)以減輕魚(yú)體的氧化損傷，稱之為氧化應(yīng)激，這是機(jī)體自我保護(hù)的一種機(jī)制[25]。

圖5 二氧化碳麻醉對(duì)肝臟丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、總抗氧化能力的影響Fig. 5 CO2 anesthesia effect on levels of MDA, SOD,GSH-Px and T-AOC in liver

4組羅非魚(yú)肝臟中SOD、GSH-Px、T-AOC均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì) (圖5)。SOD和GSHPx等抗氧化酶是生物體抗氧化的第一道防線，SOD可以有效清除氧自由基，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，GSH-Px可以分解氫過(guò)氧化物，也可以分解MDA[26]。麻醉組羅非魚(yú)SOD、GSH-Px活性較對(duì)照組顯著下降，可能是由于魚(yú)體不適應(yīng)環(huán)境從有氧到無(wú)氧的快速變化，抗氧化酶的活性下降，整體代謝水平低，另外，魚(yú)體通過(guò)消耗自身SOD、GSHPx以抵抗氧化應(yīng)激。將羅非魚(yú)重新放入高溶氧量的復(fù)蘇環(huán)境中，魚(yú)體抗氧化酶作用被激活，復(fù)蘇組、復(fù)蘇24 h組SOD活性較麻醉組顯著上升。復(fù)蘇組、復(fù)蘇24 h組GSH-Px活性較麻醉組也顯著上升，可能是由于SOD不足以完全清除過(guò)量的自由基，需要大量GSH-Px的協(xié)同作用。

T-AOC是一個(gè)體系內(nèi)的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總體水平。對(duì)照組、麻醉組、復(fù)蘇組T-AOC的變化趨勢(shì)與SOD、GSH-Px的變化趨勢(shì)基本一致。麻醉組T-AOC較對(duì)照組顯著降低，這可能是因?yàn)镃O2麻醉羅非魚(yú)時(shí)，魚(yú)體積累了許多自由基，機(jī)體不足以抵抗自由基。復(fù)蘇組、復(fù)蘇24 h組T-AOC與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，進(jìn)一步說(shuō)明復(fù)蘇組羅非魚(yú)抗氧化體系被激活。復(fù)蘇24 h后，魚(yú)體總抗氧化能力回升至對(duì)照組水平，由CO2麻醉對(duì)羅非魚(yú)引起的氧化損傷可在24 h自然復(fù)蘇后得到恢復(fù)。

2.5 CO2麻醉對(duì)羅非魚(yú)肌肉質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)的影響

對(duì)照組、麻醉組、復(fù)蘇組、復(fù)蘇24 h組羅非魚(yú)背部肌肉的硬度呈先上升后下降的趨勢(shì)，彈性無(wú)顯著性差異 (圖6)。麻醉組羅非魚(yú)片的硬度顯著高于其余實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.05)。重度低氧脅迫時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)作用，蛋白分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高，肌原纖維蛋白的降解被抑制，影響魚(yú)肉嫩度[27]。且麻醉實(shí)驗(yàn)過(guò)程中肌肉收縮加劇，糖原和ATP大量消耗，乳酸積累，線粒體活動(dòng)增強(qiáng)，使得硬度顯著上升[28]。膠著性、咀嚼性與硬度相關(guān)，變化趨勢(shì)基本一致。王彥波等[29]的研究表明，氮?dú)庵滤里@著增加了鯽 (Carassius auratus) 的硬度、膠著性、咀嚼性，對(duì)彈性無(wú)顯著影響。

圖6 二氧化碳麻醉對(duì)質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的影響Fig. 6 CO2 anesthesia effect on texture index

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)在15 ℃ CO2飽和水溶液中約2 min入麻，復(fù)蘇用時(shí)約為3 min。在CO2麻醉過(guò)程中，羅非魚(yú)嚴(yán)重缺氧，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的肝臟組織損傷和心肌組織損傷，消耗大量能量物質(zhì)。本文通過(guò)對(duì)血清生化指標(biāo)、代謝物質(zhì)含量指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)、魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出CO2麻醉對(duì)羅非魚(yú)的生理生化及魚(yú)肉品質(zhì)的影響。麻醉復(fù)蘇24 h后，魚(yú)體生理生化指標(biāo)基本恢復(fù)至對(duì)照組水平，說(shuō)明飽和CO2麻醉對(duì)羅非魚(yú)造成的損傷是可逆的。因此，CO2可應(yīng)用于快速麻醉羅非魚(yú)。目前產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用主要采用曝氣石將CO2導(dǎo)入水體得到CO2溶液，該方法操作簡(jiǎn)便、成本低，但產(chǎn)生的氣體顆粒較大，不利于魚(yú)體吸收，且CO2用量大[30-32]。本研究利用微孔曝氣管使水體通入CO2時(shí)形成納米級(jí)氣泡，增大氣體與水溶液的接觸面積，加快CO2飽和溶液的制備，且細(xì)微的氣泡顆粒更容易被魚(yú)體吸收，節(jié)約CO2用量，減少CO2排放量，更加節(jié)能環(huán)保，且縮短了麻醉羅非魚(yú)的時(shí)間。微孔曝氣管的成本相對(duì)較高，供氣需配備CO2氣瓶，占用空間較大，麻醉裝置尚需改進(jìn)。本研究結(jié)果可為羅非魚(yú)的運(yùn)輸前準(zhǔn)備提供技術(shù)參考，但羅非魚(yú)的CO2麻醉-復(fù)蘇調(diào)控機(jī)制與CO2在魚(yú)體內(nèi)的代謝途徑有待進(jìn)一步研究。