絲瓜新品種（系）對枯萎病抗性的鑒定與評價

康玉妹 薛珠政 李永平 馬慧斐 黃 昊

（福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所//福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心 福建福州 350013）

絲瓜（Lufa cylindrica）是夏季主要瓜類蔬菜作物之一，在各蔬菜產(chǎn)區(qū)均有種植。 長期以來，枯萎病一直是絲瓜生產(chǎn)上的主要病害之一[1]。 該病害是由尖孢鐮刀菌絲瓜?；颓秩舅?，屬土傳病害[2-16]。 枯萎病菌可以在作物種子上越冬，主要以菌絲、菌核、厚垣孢子在土壤、 病殘體上及未經(jīng)高溫腐熟的肥料中越冬[17-19]。 該菌在土壤中能存活5 年或更長時間，腐生性強。 前人研究表明， 用農(nóng)藥化學(xué)防治該病效果欠佳， 目前最有效、 經(jīng)濟的措施是選育和種植抗病品種[20-26]。 為了解本所選育的絲瓜品種（系）對枯萎病的抗性水平，采用室內(nèi)人工接種方法鑒定，初步評價絲瓜新品種（系）對枯萎病的抗性水平，以期為絲瓜枯萎病的抗性遺傳改良、 選育抗病新品種和砧木新品種提供抗性材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試絲瓜自交系及品種3 個新品種及11 個自交系都是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所自行選育，自2005 年起陸續(xù)從國內(nèi)外收集絲瓜種質(zhì)資源經(jīng)過自交純化按照育種目標(biāo)篩選。 供試絲瓜品種（系）來源及系統(tǒng)序號見表1。

表1 供試絲瓜新品種（系）

1.1.2 供鑒定的病原菌菌株采自廣州市鐘落譚鎮(zhèn)絲瓜產(chǎn)區(qū)的絲瓜枯萎病樣， 經(jīng)過廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所單孢分離，獲得絲瓜枯萎病菌菌株，通過室內(nèi)人工接種測定上述菌株的致病性， 保存致病力中等的菌株待用。 挑取少量帶菌絲的培養(yǎng)基至PDA 上，活化培養(yǎng)，保存待用（編號為SPK-3）。

1.2 抗病性鑒定方法

1.2.1 育苗準(zhǔn)備接種用絲瓜苗：每個品種（系）選完全成熟、籽粒飽滿的種子200 粒，清洗后用溫水浸泡8～10 h，之后將清洗干凈的種子用濕布包裹，催芽于28～30℃、光照300 μmol/（m2·s）的恒溫生化培養(yǎng)箱中，在每天早晚清洗種子各1 次，當(dāng)80%種子露白，及時播于育苗盤（規(guī)格為5 cm×10 cm），于2021 年7 月26 日播種，干濕適中的育苗土覆蓋1 cm，2 葉1 心苗齡進行人工接種。 土壤均經(jīng)消毒處理后用于育苗。

1.2.2 枯萎病菌培養(yǎng)從菌種保存箱中取出病原菌SPK-3 菌株活化培養(yǎng)，于PDA 試管斜面上接種，待菌絲長出后，用接種針取出一小塊接種于盛有PDA 培養(yǎng)基的三角瓶中，然后振蕩培養(yǎng)3 d，25℃、180 r/min。用雙層紗布過濾培養(yǎng)液，去除菌絲，以2 500～3 000 r/min離心10 min 后，濾液去上清液，然后滅菌水洗出沉淀的孢子，制成母液。 用紐鮑爾（Neubauer）血球計數(shù)板在顯微鏡下觀察80 個格，對每個小格的孢子進行觀察計數(shù)， 以其平均數(shù)乘以4 000 000， 得到孢子的數(shù)量（每毫升懸浮液中孢子量）。 將母液用雙蒸無菌水稀釋，每毫升含1×106個孢子懸浮液，待用。

1.2.3 接種方法采用苗期抗性鑒定技術(shù)進行人工接種抗性鑒定絲瓜枯萎病， 接種方法為傷浸根法。帶土拔起2 葉1 心幼苗，用接種剪刀，輕輕傷根，然后在孢子懸浮液中浸入根系20 min，于營養(yǎng)盆中移植。每個品種（系）每個重復(fù)30 株苗，以雙蒸無菌水作對照，3 次重復(fù)。

1.3 病情調(diào)查與評價

接種后，瓜苗病害發(fā)生情況隔天觀察記錄1 次，瓜苗充分發(fā)病，停止調(diào)查。 統(tǒng)計病情指數(shù)（DI）。 調(diào)查結(jié)果用DMRT 法， 根據(jù)病情指數(shù)進行差異顯著性分析，評價品種抗性水平。 絲瓜病株病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級，無病癥；1 級，生長正常，胚軸或子葉出現(xiàn)輕微病癥；3 級，影響生長，胚軸或子葉出現(xiàn)明顯壞死斑，或1 片子葉黃化；5 級，2 片子葉黃化， 或1 片子葉枯死；7 級，植株部分萎蔫或停止生長，2 片子葉生長僵化；9 級，整株萎蔫，倒伏或枯死。

病情指數(shù)計算公式：DI（%）=Σ（病株數(shù)×該級代表值）/總株數(shù)×最高級代表值×l00。

絲瓜群體抗性水平評價標(biāo)準(zhǔn)如下。 高抗（HR）：0＜DI≤l5；抗（R）：15＜DI≤35；中抗（M）：35＜DI≤55；感（S）：55＜DI≤75；高感（HS）：75＜DI。

1.4 統(tǒng)計分析方法

應(yīng)用DPS 統(tǒng)計軟件處理原始數(shù)據(jù)， 差異顯著性分析采用Duncan 氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲瓜枯萎病的顯微鏡觀察情況

先直接觀察菌落形態(tài)，將菌株篩選分離后，接種于PDA 平板上，28℃培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)其菌絲具有條紋，菌叢呈淡紫色絮狀，整個菌落中央淡紫色，平板背面帶有深紫色的色素。 用倒置顯微鏡400 倍觀察，可見其菌絲及分生孢子，分生孢子梗呈瓶頸狀；小型分生孢子較多，呈橢圓至卵圓形，小型分生孢子具有1 個分隔；大型分生孢子有2～3 個分隔，形似鐮刀（圖1）。

圖1 絲瓜尖孢鐮刀菌在倒置顯微鏡下觀察情況

2.2 絲瓜枯萎病發(fā)病癥狀及分級標(biāo)準(zhǔn)

接種枯萎病菌的絲瓜苗， 其植株發(fā)病癥狀表現(xiàn)為由下至上子葉、真葉黃化，葉脈逐漸變黃，隨后葉片變黃、萎蔫，莖基部褐色到褐色開裂，濕度大時長淡紫色菌絲霉?fàn)钗铮仓昕菟?，病株根尖及維管束變色不明顯。 參考羅方芳等[1]的絲瓜枯萎病病情分級方法，根據(jù)癥狀特征建立分級標(biāo)準(zhǔn)（表2）。 絲瓜群體抗性水平評價標(biāo)準(zhǔn)見表3，分為HR、R、M、S、HS。

表2 絲瓜枯萎病病情分級標(biāo)準(zhǔn)

表3 絲瓜群體抗性水平評價標(biāo)準(zhǔn)

2.3 枯萎病病原菌致病性鑒定中絲瓜苗病害發(fā)生情況

于絲瓜幼苗上接種分離到的尖孢鐮刀菌孢子懸液，結(jié)果表明，該菌株對絲瓜具有強致病性。 絲瓜植株接種孢子懸液3 d 后開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，7 d 后發(fā)病趨于嚴(yán)重。 發(fā)病時絲瓜由葉緣開始，逐漸向中脈擴展，病葉萎蔫，隨后1～2 d 恢復(fù)，然后萎蔫病葉不再恢復(fù)，呈現(xiàn)萎蔫；自下而上發(fā)展，最下部葉片及其葉鞘處黃色，隨后其他葉片相繼發(fā)黃、萎蔫，植株倒伏，直至全株枯死，莖基部褐色至黑褐色開裂，濕度大時長淡紫色菌絲霉?fàn)钗铩?病株根莖剖開，即可見褐色或淡紫色斑點狀壞死病變， 越近莖基部顏色越深， 病變一直延伸到根莖部。 接種孢子懸液的處理植株移栽10 d 后，死亡率高達70%，其中有90%絲瓜發(fā)病。 發(fā)病植株與健康植株相比較顯著矮小，生長逐漸停止；接種該菌株的絲瓜植株移栽10 d 后，其地上部鮮重、地下部鮮重、 株高和莖圍與對照處理均達到差異顯著水平。 從發(fā)病部位重新分離病原菌，接種于尖孢鐮刀菌加了蛋白胨的選擇性培養(yǎng)基再次進行顯微觀察， 鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.melonis），根據(jù)科赫法則，證實該病原菌是被接入的尖孢鐮刀菌菌株。

2.4 絲瓜自交系抗性鑒定

絲瓜自交系人工接種試驗結(jié)果見表4。 參試的11 個絲瓜自交系接種枯萎病菌SPK-3 菌株10 d 后病情基本穩(wěn)定。 其中SP15008 與SP11027、SP11011自交系間病情指數(shù)差異顯著；SP11027、SP11011 自交系間病情指數(shù)差異不顯著， 但這2 個自交系與SP08012、SP09001、SP08006 3 個自交系間病情指數(shù)差異顯著；SP08012、SP09001、SP08006 3 個自交系間病情指數(shù)差異不顯著， 但均與SP16015 自交系差異極顯著；SP05008、SP11012、SP15006、SP15007 品系間病情指數(shù)差異不顯著。

表4 絲瓜自交系對枯萎病抗性鑒定結(jié)果

根據(jù)絲瓜枯萎病抗性水平評價標(biāo)準(zhǔn)，參試的11個絲瓜自交系中，SP15008 對絲瓜枯萎病表現(xiàn)為高抗，SP11027、SP11011 對絲瓜枯萎病表現(xiàn)為抗病，SP08012、SP09001、SP08006 對絲瓜枯萎病表現(xiàn)為中抗病，SP16015 對絲瓜枯萎病表現(xiàn)為感??；SP05008、SP11012、 SP15006、 SP15007 對絲瓜枯萎病表現(xiàn)為高感。

2.5 絲瓜新品種抗性鑒定

絲瓜新品種人工接種試驗結(jié)果見圖2。 參試的絲瓜新品種福研2 號、福研3 號、福研6 號接種枯萎病菌SPK-3 菌株10 d 后病情基本穩(wěn)定。 3 個新品種病情指數(shù)分別為47.7%、40.2%、57.5%， 差異不顯著，35＜DI≤55，都中抗枯萎病。

圖2 絲瓜新品種抗性鑒定

3 結(jié)論與討論

通過室內(nèi)人工接種，鑒定評價了11 個絲瓜自交系及3 個雜交種的枯萎病抗性水平， 結(jié)果表明，SP08012、SP09001 和SP08006 這3 個自交系對枯萎病 表 現(xiàn) 為 中 抗，SP05008、SP11012、15006、15007 和SP15008 這5 個自交系對枯萎病表現(xiàn)為高感。 福研2 號、福研3 號、福研6 號這3 個新品種對枯萎病表現(xiàn)為中抗。 說明目前選育的絲瓜新品種（品系）大多數(shù)對枯萎病表現(xiàn)為抗或中抗， 可為絲瓜抗病育種提供新材料。

植株葉片變黃萎蔫是絲瓜枯萎病的主要病狀，其病原為尖孢鐮刀菌。 目前羅方芳等[1]進行了廣東絲瓜主要品種對枯萎病抗性的鑒定與評價，絲瓜枯萎病抗性鑒定方法深入研究尚未見系統(tǒng)的報道。 絲瓜抗病育種的基礎(chǔ)性工作之一是絲瓜抗枯萎病鑒定，而抗病育種的重要組成部分是室內(nèi)人工接種。 育種工作者在建立了室內(nèi)人工接種高效鑒定絲瓜抗枯萎病的方法后，及時掌握育種材料的抗感性，可以快速高效鑒定材料，其數(shù)量不受環(huán)境條件限制，可大批量篩選抗源，合理選配骨干親本組合，并篩選抗病優(yōu)良品種，在生產(chǎn)上應(yīng)用推廣。 因此本研究利用致病力較強的SPK-3 菌株，進行了絲瓜抗枯萎病鑒定評價方法的分析。 參照枯萎病茄果類抗性鑒定方法的研究，接種方法、接種濃度和接種苗齡3 個因素主要影響接種效果。 本研究設(shè)置了18 種處理，符合3×3×2 因子設(shè)計方法，深入分析這3 個影響因素及其相互的互作效應(yīng)，確定其重要性依次為接種方法＞接種濃度＞接種時期。 4 葉1 心期與2 葉1 心期接種無顯著性差異。 考慮到更早的時期進行鑒定則瓜苗較弱， 接種后不容易緩苗， 而在較早的時期進行鑒定可以節(jié)省時間和空間，接種適合在瓜苗2 葉1 心期時進行。 影響抗病鑒定的關(guān)鍵因子是接種方法，用1×106CFU/mL 左右的枯萎病孢子懸浮液可獲得較好的鑒定效果，說明傷浸根法對接種濃度的高低不敏感， 即采用傷浸根法接種效果最好。 進行傷灌根接種時采用1×107CFU/mL或更高濃度才能達到較好的接種效果， 而僅僅直接將菌液灌入土壤中接種效果較差， 所以要求較高的病原菌孢子濃度用于傷灌根接種。 由于浸根法和傷灌根法均存在植株根系傷口，因此如果采用灌根法，為了省工省力，則必須應(yīng)用1×107CFU/mL 或更大的接種濃度以保證足夠的病原菌數(shù)量， 同時人為制造根系傷口， 以加速病原菌侵入。 根系受傷能夠加速絲瓜枯萎病病原鐮刀菌的侵染和癥狀表現(xiàn)。 絲瓜枯萎病抗性鑒定接種的推薦方法： 綜合考慮各因素，采用傷浸根法接種， 接種時期為苗齡2 葉1 心期，在1×106CFU/mL 的孢子懸浮液中浸泡。 由于絲瓜種植具有多年不間斷種植和區(qū)域性特點， 目前推廣種植的絲瓜品種以抗和中抗枯萎病品種為主， 在長期與寄主作物互作過程中，絲瓜品種的抗病性降低，枯萎病菌發(fā)生致病性變異。 試驗結(jié)果表明，選育的絲瓜品種（系）中多數(shù)具有抗枯萎病基因，但還有待于下一步分析這些抗病基因的種類及抗性機制等。 為此，需對資源的抗性水平與抗性機制進行研究， 為絲瓜生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展，廣泛收集絲瓜種質(zhì)資源，有針對性地培育出一系列具有不同抗性基因的絲瓜品種。