云南松花粉中總黃酮和總酚含量的株間差異研究*

付玉嬪,陳少瑜,李思廣,羅婷 ，周云，李志華，李少文

(1.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3.富民縣林業(yè)和草原局，云南 富民 650400；4.馬關(guān)縣金城國有林林場(chǎng)，云南 馬關(guān)663700)

云南松(Pinusyunnanesis)屬松科(Pinaceae)松屬(PinusL.)常綠針葉喬木,生長快,材質(zhì)好,耐干旱瘠薄,天然更新能力強(qiáng),是西南地區(qū)荒山造林先鋒樹種和主要的用材樹種，廣泛分布在云南，少量也見于四川、西藏、貴州和廣西[1-2]。松花粉為松屬植物的雄性生殖細(xì)胞(雄配子體)，是最早被人類食用的非蜂源純凈花粉。松花粉作為藥材、食材的歷史悠久，早在漢代的《神農(nóng)本草》中即有記載，之后唐代的《新修本草》和明代的《本草綱目》等醫(yī)書中也多有記錄。然而，因植物花粉產(chǎn)量較小、收集不易、對(duì)其有效成分提取成本高等原因，僅有馬尾松(P.massoniana)、油松(P.tabulaeformis)和云南松等幾個(gè)分布面積較廣的松屬樹種的花粉利用較多，各產(chǎn)區(qū)也紛紛開展了相關(guān)研究[3-7]。云南松作為云南省分布面積較為廣泛的重要樹種資源，其林分生物量變化[8]、林下草本植物多樣性分布格局[9]、林分分布格局[10]等研究較多，而對(duì)其花粉的研究則主要集中在營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)分析[11-13]、功效及安全性實(shí)驗(yàn)測(cè)定[14]、開發(fā)利用技術(shù)研究[15-16]等。云南松花粉含有幾乎人體所需要的全部營養(yǎng)物質(zhì)[14]，其中黃酮類物質(zhì)和酚類物質(zhì)被廣泛認(rèn)為是花粉中的重要生物活性成分，具有抗氧化和清除自由基功能。因此，云南松花粉除作為遺傳改良的基本物質(zhì)外，還可作為保健功能食品且具有較大的開發(fā)利用價(jià)值。

目前，云南松花粉原料均采自云南松天然林分，因云南松樹體高大其花粉不容易采集，采用的是殺雞取卵式的采粉方式——將開花樹枝砍下甚至整個(gè)植株砍倒采收，對(duì)森林破壞嚴(yán)重，因此當(dāng)?shù)亓謽I(yè)部門紛紛出臺(tái)相關(guān)政策、法規(guī)禁止花粉采收以保護(hù)森林。為更好地利用這一天然資源，有必要進(jìn)行花粉產(chǎn)量和質(zhì)量較高的優(yōu)良種質(zhì)資源的選育，以營建優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)花粉原料林，使松花粉產(chǎn)業(yè)可以持續(xù)健康發(fā)展。關(guān)于云南松的花粉形態(tài)[17]、花粉儲(chǔ)藏及萌發(fā)條件[18]、花粉活性成分[14,19]等的研究已有報(bào)道，但云南松花粉優(yōu)樹選擇方面尚無報(bào)道。本文通過對(duì)不同云南松單株花粉中重要的功能性物質(zhì)——總黃酮及總酚——進(jìn)行測(cè)定，以了解單株之間花粉功能性物質(zhì)的差異性，為云南松花粉單株選擇提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 花粉收集

2021年3月份收集樹齡30～31 a、處于盛花期的17個(gè)云南松單株的成熟花粉。其中，8個(gè)單株采自楚雄市子午鎮(zhèn)，其余9個(gè)單株采自宜良縣小哨林區(qū)(表1)。每個(gè)單株收集10個(gè)成熟即將散粉的雄球花，用牛皮紙袋盛放置于室內(nèi)通風(fēng)干燥處陰干，注意避免花粉污染，然后過250目篩，收集純凈花粉留待檢測(cè)。

表1 17個(gè)云南松采樣單株的地理分布信息

1.2 生長量和產(chǎn)粉性狀指標(biāo)數(shù)據(jù)收集

測(cè)量17個(gè)單株的樹高(精確到0.1 m)、胸徑(精確到0.1 cm)、冠幅(精確到0.1 m)等生長量指標(biāo)和雄球花鮮重(精確到0.1 g)、雄球花產(chǎn)粉量(精確到0.01 g)、雄球花粗和長(皆精確到0.01 cm)、小孢子葉粗和長(皆精確到0.01cm)等產(chǎn)粉性狀指標(biāo)。每個(gè)單株平行取樣3份重復(fù)測(cè)定總酚含量和總黃酮含量。

1.3 總酚含量和總黃酮含量測(cè)定

1.3.1 樣品溶液制備

稱取約 0.1 g 新鮮花粉在 105 ℃下殺青 3 min；于 60 ℃烘干至恒重；粉碎，過 40～60 目篩，得到烘干樣本；取所有烘干樣本加入 1.5 mL 的 60%乙醇，于60 ℃振蕩提取2 h；25 ℃、12 000 rpm離心 10 min；取上清液，用 60%乙醇定容至 1.5 mL，待測(cè)。

1.3.2 測(cè)定方法

應(yīng)用蘇州格銳思生物科技有限公司(Suzhou Grace Biotechnolgy Co.，Ltd)的試劑盒，采用酶標(biāo)法測(cè)定?？偡訙y(cè)定試劑盒采用福林酚法測(cè)定總酚含量，總黃酮測(cè)定試劑盒采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法測(cè)定黃酮總含量。

測(cè)定所用儀器和物品為：美國MD190酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)TLG-16(湖南湘儀)、可調(diào)式移液器、粉碎儀、烘箱、篩子、60%乙醇、蒸餾水。

1.3.3 總黃酮含量測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 向標(biāo)準(zhǔn)品(蘆丁) EP 管里面加入 1 mL 的 60%乙醇提取液，制備成標(biāo)準(zhǔn)品母液(1 mg/mL)。 把母液用 60%乙醇稀釋成5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(0、 0.2、 0.4、0.6、0.8、1 mg/mL)。依據(jù)測(cè)定管的加樣體系操作，根據(jù)測(cè)定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.6 27 7x-0.004 9，其中：R2=0.999 9；x是標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)，y是ΔA；測(cè)定 510 nm 處吸光值為A，ΔA=A 測(cè)定-A 空白。樣品測(cè)定按試劑盒說明進(jìn)行。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

(2)總黃酮含量計(jì)算 總黃酮含量(mg/g 干重)=[(ΔA+0.004 9)/1.627 7×V1]/(V1/V×W) ×D=0.6×(ΔA+0.0049)/W×V×D

式中：V為提取液體積(1.5 mL)，V1為反應(yīng)中樣品體積(0.05 mL)，W為樣品質(zhì)量(g)，D為稀釋倍數(shù)(未稀釋即為1)。

1.3.4 總酚(TP)含量測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 向標(biāo)準(zhǔn)品(沒食子酸) EP 管里面加入1 mL蒸餾水，超聲完全溶解，制成標(biāo)準(zhǔn)品母液(1 mg/mL)。把母液用蒸餾水稀釋成5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL。依據(jù)測(cè)定管的加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.349 4x-0.000 6，R2=0.999 9，x是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(μg)，y是ΔA。測(cè)定760 nm吸光值 A，ΔA=A測(cè)定-A空白。樣品測(cè)定按試劑盒說明進(jìn)行。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

總酚(TP)含量(mg/g 干重)=(ΔA+0.000 6)÷0.349 4×10 -3 ÷(V1÷V×W)×D=0.286 2×(ΔA+0.000 6) ×V÷W×D

式中：V為加入提取液體積,V1為反應(yīng)中樣品體積(0.01 mL),D為稀釋倍數(shù)(未稀釋即為1),W為樣品質(zhì)量(g)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excell和SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量

總黃酮即黃酮類化合物，是植物重要的一類次生代謝產(chǎn)物，具有有較強(qiáng)的抗氧化活性，可捕捉活性氧自由基，降低氧化傷害，在果實(shí)中影響其色澤和風(fēng)味。云南松破壁花粉中其含量較高，最高可達(dá)6.35 mg/g[14]。云南松17個(gè)單株其花粉中的總黃酮含量在2.685～3.864 mg/g之間，單株間存在極顯著的差異(P<0.01)(表2)，極差為1.179 mg/g，最大值較最小值高出43.9%；楚雄和宜良2個(gè)種源間花粉中的總黃酮含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 17個(gè)單株花粉總酚含量及總黃酮含量方差分析

2.2 總酚含量

總酚也是一類具有抗氧化和清除自由基功能的活性物質(zhì)。云南松花粉中的總酚含量在單株間呈極顯著的差異(P<0.01)(表2)，17個(gè)單株其花粉中的總酚含量在4.24～7.71 mg/g間，極差為3.47 mg/g，最大值比最小值高出了81.8%；楚雄和宜良2個(gè)種源間花粉中的總酚含量差異不顯著(P>0.05)。

2.3 總黃酮含量與總酚含量的關(guān)系

對(duì)17個(gè)單株的總黃酮和總酚含量(圖3)進(jìn)行相關(guān)性分析，二者在α=0.01 水平上呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.626。

圖3 不同單株花粉中的總黃酮含量及總酚含量

對(duì)二者進(jìn)行回歸曲線擬合(圖4)，可以看出二者間呈線性關(guān)系，因此建立二者的一元線性回歸方程為y=1.847+0.239x，其中：R=0.626、P<0.01；y為總黃酮含量，x為總酚含量。兩者呈直線線性關(guān)系，經(jīng)檢驗(yàn)，其回歸系數(shù)差異顯著(P<0.01)，表明二者顯著正相關(guān)，和相關(guān)分析的結(jié)果一致；從圖5可以看出回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差在零值附近呈正態(tài)分布，圖6顯示二者之間呈線性分布。由此可以推斷，回歸方程滿足線性以及方差齊次的檢驗(yàn)，能較好地描述二者間的關(guān)系。因此，云南松花粉中總黃酮含量具有隨總酚含量增加而增加的特征。

圖4 總酚含量與總黃酮含量回歸曲線擬合

圖5 總黃酮含量回歸曲線標(biāo)準(zhǔn)化殘差的正態(tài)曲線

圖6 總黃酮含量回歸曲線標(biāo)準(zhǔn)化殘差的標(biāo)準(zhǔn)P-P

2.4 總黃酮和總酚與生長指標(biāo)和產(chǎn)粉指標(biāo)的關(guān)系

表3列出了17個(gè)云南松單株的生長指標(biāo)值和雄球花各個(gè)花部特征的平均值。分析云南松成熟花粉中總黃酮含量、總酚含量與產(chǎn)粉指標(biāo)和生長指標(biāo)的關(guān)系(表4)，發(fā)現(xiàn)總黃酮、總酚與雄球花粗呈顯著正相關(guān)(P=0.008、P<0.01)，總酚與小孢子葉長呈顯著正相關(guān)(P=0.006)，與雄球花鮮重在0.05水平呈顯著正相關(guān)，與其他產(chǎn)粉指標(biāo)相關(guān)性不顯著；總黃酮與雄球花花粉量在α=0.05水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與其他產(chǎn)粉指標(biāo)相關(guān)性不顯著?？偡雍颗c云南松的樹高、胸徑、冠幅都呈顯著的正相關(guān)(P=0.002、P=0.008、P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.685、0.657、0.761；總黃酮含量與各生長指標(biāo)的相關(guān)性均不顯著。說明總酚與云南松的生長狀況和雄球花的發(fā)育狀況都有密切的關(guān)系，但總黃酮含量受云南松的生長影響較小，僅與雄球花粗壯程度密切相關(guān)。

表3 17個(gè)云南松單株的生長指標(biāo)和雄球花的花部特征平均值

表4 總黃酮和總酚與生長指標(biāo)和產(chǎn)粉指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

松花粉作為“微型營養(yǎng)庫”，其化學(xué)成分中含有黃酮類、不飽和脂肪酸、微量元素等人體需要的營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、抗疲勞、抗癌抑癌、保肝護(hù)肝、降血糖、增強(qiáng)免疫力等功能性特點(diǎn)，是較好的抗氧化劑食品，但其營養(yǎng)物質(zhì)含量可能受采粉樹種類、年齡、花粉成熟程度、花粉活力、個(gè)體、地理分布等因素影響而有所差異[20]。

云南松17個(gè)單株成熟花粉的總酚含量最高的單株其含量可達(dá)7.71 mg/g，較最低單株高出81.8%，最高的總黃酮含量達(dá)3.864 mg/g，較最差單株高出43.9%；總黃酮含量和總酚含量在單株間差異均極顯著，P值均小于0.01；種源間差異均不顯著。因此，基于總黃酮含量或總酚含量的花粉優(yōu)良種質(zhì)選擇不適合群體選擇，適合進(jìn)行個(gè)體選擇。

云南松成熟花粉中總酚含量與總黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系，表現(xiàn)出總黃酮含量隨總酚含量增加而增加的趨勢(shì)，因此在云南松花粉質(zhì)量評(píng)定時(shí)總酚和總黃酮含量2個(gè)功能性指標(biāo)測(cè)定一個(gè)即可。此外，總酚含量與云南松植株的高、胸徑、冠幅等生長指標(biāo)和雄球花的粗壯程度均有極顯著的相關(guān)性，但總黃酮含量則與云南松生長指標(biāo)相關(guān)性不顯著，僅與雄球花粗壯程度緊密相關(guān)。因此，在開展云南松花粉優(yōu)株選擇時(shí)，除考慮生長指標(biāo)、單株花粉量和花粉品質(zhì)外，雄球花的粗壯程度應(yīng)作為重要考慮的指標(biāo)納入選擇指標(biāo)中。