lncRNA SNHG1調控PI3K/AKT/NF-κB信號通路對小鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響*

楊 濤，李小玲，陽承艷，李洋潔，王麗娜，陳潤奇

（廣西桂林市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，桂林 541002）

急性心肌梗死（AMI）是危害人類健康及生命的心血管疾病之一[1]。溶栓治療或經皮冠狀動脈介入治療（PCI）是治療AMI的有效方法[2]。然而，遭受一定時間缺血的組織細胞恢復血流（再灌注）后，組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆損傷，這一過程稱為心肌缺血/再灌注損傷（MIRI）[3]。MIRI 嚴重影響缺血性心臟疾病患者的預后，且其機制復雜多樣，主要包括鈣超載、炎癥、氧化應激和線粒體功能障礙[4-7]。因此，明確MIRI發(fā)病機制、探索新的治療靶點對AMI的治療及預后具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類真核生物中長度大于200 nt的非編碼RNA分子，它們本身不編碼蛋白，而是以RNA 的形式在多種層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）調控基因的表達水平[8]。近年來研究發(fā)現，lncRNA 在腫瘤、神經疾病、心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學功能[9]。小核RNA宿主基因1（SNHG1）是由11 號染色體上作為18s 核糖體RNA 重要組成部分的UHG 基因轉錄而來的lncRNA。研究顯示，敲除lncRNA SNHG1可抑制過氧化氫（H2O2）誘導的心肌細胞凋亡[10]。抑制SNHG1 可促進心肌細胞增殖和血管生成，降低心肌梗死后心肌細胞凋亡，改善心功能[11]。但lncRNA SNHG1 在MIRI 中的作用及機制尚不清楚。本研究旨在探討下調lncRNA SNHG1表達對MIRI小鼠心肌細胞凋亡的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級10～12 周齡C57BL/6J 小鼠18 只，體重20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK（京）2019-0010。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，濕度40%～70%。本實驗動物處置符合動物倫理學要求。

1.2 實驗分組 將18只小鼠隨機分為3組，分別為假手術（Sham）組、MIRI組、SNHG1小干擾RNA（si-SNHG1）組，每組6 只。si-SNHG1 組小鼠通過左前胸壁小切口暴露心臟，將100μL 攜帶si-SNHG1 的腺病毒（滴度為1.0×109pfu/只，由廣州瑞博生物公司提供）從左室心尖部向主動脈根部注射，主動脈和肺動脈交叉鉗夾20 s。排出空氣和血液后，關閉胸腔。注射腺病毒5 d后建立MIRI模型。

1.3 MIRI小鼠模型的建立 用2.5%戊巴比妥麻醉小鼠，仰臥固定于小動物手術臺上，連接心電圖，行氣管插管后連接HX-300S 動物呼吸機，潮氣量250 mL/min，呼吸頻率120 次/min。沿胸骨左緣第3、4 肋間開胸，打開心包，于左心耳下方2 mm 處穿絲線結扎左冠狀動脈前降支。觀察小鼠心電圖變化，以ST 段抬高作為判斷結扎成功的標準。結扎45 min 后松開結扎線，恢復心肌血流供應，再灌注2 h。Sham組僅開胸不結扎。

1.4 心功能檢測 再灌注2 h后，應用MyLab 30CV超聲系統(tǒng)及10 MHz 線性超聲換能器，對各組小鼠進行心臟超聲檢查。麻醉后將小鼠置于加熱墊上并取左側臥位，用刮毛刀刮除胸部毛發(fā)，測量射血分數（EF）、左室短軸縮短率（FS）和心率。由兩位實驗室技術員雙盲法操作，取兩者均數。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測心肌組織SNHG1表達 Trizon法提取總RNA，測定RNA 純度和濃度，逆轉錄為cDNA，行PCR 擴增。PCR 反應體系：2×ULtraRT one step Buffer 12.5 μL，RNA 1 μg，上、下游引物各1 μL，ULtraRT one step EnzymeMix 0.5 μL，加入無RNA 酶的雙蒸水至25 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。引物序列如下：SNHG1上游：5’-CCTAAAGCCACGCTTCTTG-3’，下游：5’-TGCAGGCTGGAGATCCTACT-3’；GAPDH上游：5’-ACCCAGAAGACTGTGGAGG-3’，下游：5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3’。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算SNHG1mRNA相對表達量。

1.6 心肌病理學觀察 心功能檢測后將小鼠深度麻醉處死，迅速取出心臟，切下部分心肌組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，行蘇木精—伊紅（HE）染色。光學顯微鏡下觀察心肌組織病變情況并拍照。

1.7 2,3,5-三苯基四唑氯化（TTC）染色檢測心肌梗死面積 取新鮮心肌組織，去除心房和大血管，冰PBS 清洗，濾紙吸干水分，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min 后，自心尖起每隔2 mm 垂直于心臟長軸將心臟切成薄片。置于1%TTC溶液（Sigma-Aldrich，美國）中，37 ℃水浴20 min。完成染色后，將心肌薄片置于顯微鏡下（放大10 倍）觀察，拍照。利用Image J 軟件測量左心室面積（LV）、缺血面積（AAR，TTC 染為磚紅色）和梗死面積（IS，TTC 染色呈灰白色）。梗死面積（%）=IS/AAR×100%。

1.8 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡 將心肌組織切片放在60 ℃烤箱中烘烤30 min，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蛋白激酶K 孵化30 min；PBS 沖洗后，加入TdT和Lucifase標記的dUTP，37 ℃下反應1 h；用二氨基聯苯胺（DAB）作為底物反應10 min，然后用蘇木精進行核染色，在熒光顯微鏡下拍照、計數。凋亡細胞核為棕黃色，正常細胞核呈藍色。

1.9 Western blotting 法檢測Cleaved caspase-3 和PI3K/AKT/NF-κB蛋白表達 心肌組織中加入蛋白裂解液（含PMSF），于冰上裂解，BCA法測定蛋白濃度；SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜上；加入一抗PI3K（1∶200）、磷酸化（p-）PI3K-p85（1∶300）、AKT（1∶300）、p-AKTser473（1∶300）（Affinity Biosciences，美國）和Cleaved caspase-3（1∶200）、NFκB（1∶300）、p-NF-κB-p65（1∶300）、GAPDH（1∶1 000）（Cell Signaling Technology，美國）4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，每次10 min；加入HRP 山羊抗兔IgG二抗（1:10 000，Cell Signaling Technology，美國）37 ℃下孵育1 h，TBST 漂洗3 次，每次10 min。采用ECL 化學發(fā)光法顯示蛋白條帶，Image-Pro Plus 6.0進行灰度分析。

1.10 統(tǒng)計學方法 所有數據均采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠心肌組織中l(wèi)ncRNASNHG1表達水平比較 與Sham 組比較，MIRI 組lncRNASNHG1相對表達量升高（P＜0.05）；與MIRI 組比較，si-SNHG1組lncRNASNHG1相對表達量降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織中l(wèi)ncRNA SNHG1表達水平比較

2.2 lncRNA SNHG1 表達下調對MIRI 小鼠心功能的影響 3 組小鼠心率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sham組比較，MIRI組小鼠心室擴大，心壁變薄，下調SNHG1 可改善MIRI 誘導的小鼠心室壁結構異常變化；MIRI 組小鼠EF%和FS%較Sham 組下降（P＜0.05）；與MIRI 組比較，si-SNHG1組FS%和EF%升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠心功能指標比較

2.3 lncRNA SNHG1 表達下調對MIRI 小鼠心肌梗死面積的影響 MIRI 組小鼠心肌梗死面積大于Sham 組（P＜0.01）；與MIRI 組比較，si-SNHG1 組小鼠心肌梗死面積減?。≒＜0.01），見圖3。

圖3 各組心肌梗死面積比較

2.4 lncRNA SNHG1 基因下調對MIRI 小鼠心肌病理損傷的影響 Sham組心肌細胞橫紋和閏盤清晰，心肌纖維結構清晰，排列完整緊密，染色均勻，細胞核完好，無細胞壞死現象；MIRI組組織結構不連續(xù)，細胞排列紊亂，細胞核溶解和皺縮明顯，心肌纖維撕裂，細胞核深染；si-SNHG1組心肌細胞排列較為完整，壞死細胞減少，見圖4。

圖4 各組心肌組織HE染色圖（×400）

2.5 LncRNA SNHG1對MIRI小鼠心肌細胞凋亡的影響 與Sham 組比較，MIRI 組心肌細胞凋亡率升高（P＜0.01）；與MIRI 組比較，si-SNHG1 組心肌細胞凋亡率降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 各組心肌細胞凋亡率比較（×200，比例尺=25 μm）

2.6 LncRNA SNHG1對小鼠心肌組織Cleaved caspase-3 蛋白表達的影響 與Sham 組比較，MIRI 組Cleaved caspase-3 蛋白表達上調（P＜0.001）；與MIRI組比較，si-SNHG1組Cleaved caspase-3蛋白表達下調（P＜0.001），見圖6。

圖6 LncRNA SNHG1對小鼠心肌組織凋亡相關基因表達的影響

2.7 各組PI3K/AKT/NF-κB 信號通路蛋白表達比較 3 組間心肌組織PI3K 和AKT 蛋白表達水平無明顯差異（P＞0.05）。與Sham 組比較，MIRI 組p-PI3K和p-AKT表達水平降低，NF-κB蛋白表達升高（P＜0.05）；與MIRI 組比較，si-SNHG1 組p-PI3K 和p-AKT表達水平升高，而NF-κB蛋白表達降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 各組PI3K/AKT/NF-κB信號通路蛋白表達比較

3 討論

本研究結果顯示，MIRI 組SNHG1 表達水平升高，心肌組織損傷程度和梗死面積增加，si-SNHG1組小鼠心肌SNHG1 表達降低，心肌損傷程度和梗死面積明顯減小。TUNEL 染色結果顯示，si-SNHG1 逆轉了MIRI 對心肌細胞凋亡的促進作用，并明顯下調心肌組織中凋亡蛋白Cleaved caspase-3表達。提示SNHG1表達水平與MIRI引起的心肌細胞凋亡和心臟功能損傷相關。

在MIRI 過程中涉及到多種信號通路，其中PI3K/AKT 通路在減輕MIRI 中發(fā)揮重要作用，該通路持續(xù)激活可抑制缺血性損傷誘導的細胞凋亡[12]。PI3K是一種具有絲/蘇氨酸激酶活性的細胞內磷脂酰肌醇激酶，由二聚體、調節(jié)亞基（p85）和催化亞基（p110）組成。生理狀態(tài)下，AKT 以失活狀態(tài)存在，當受到外界刺激時，激活的PI3K 可引起AKT 的Ser47和Thr308殘基發(fā)生磷酸化，AKT激活。此外，炎癥反應亦是MIRI 的重要病理生理過程，心肌細胞凋亡和炎癥反應與NF-κB 通路的激活密切相關[13]。NF-κB 是AKT 的重要下游元素，PI3K/AKT通路主要通過抑制下游轉錄因子NF-κB 來調控細胞凋亡進程。Luan 等[12]報道，PI3K/AKT 激活可抑制NF-κB表達，減輕MIRI誘導的心肌損傷，抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應。此外，lncRNA 對心肌細胞的凋亡調控也發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現，抑制lncRNA Gpr19可通過miR-324-5p/Mtf1軸抑制心肌細胞凋亡和氧化應激，從而減輕AMI后的再灌注損傷[14]。抑制lncRNA SNHG1 亦能減弱H2O2對心肌細胞活性和凋亡的影響[10]。本研究結果顯示，siRNA 干擾SNHG1 表達可顯著上調心肌組織中PI3K/AKT 磷酸化水平，并抑制NF-κB 蛋白表達。提示干擾lncRNA SNHG1 表達可能通過激活PI3K/AKT 信號通路，抑制NF-κB 表達，減少心肌細胞凋亡，縮小心梗面積，改善心功能。

綜上，干擾lncRNA SNHG1 表達可以通過激活PI3K/AKT 并抑制NF-κB 信號轉導，抑制心肌細胞凋亡顯著減輕MIRI誘導的心肌損傷。SNHG1可能是MIRI治療的潛在靶點。