豬胎盤營養(yǎng)轉運相關基因在不同妊娠期的表達

伍治敏，胡光玲，敖 政

(1.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽550025；2.貴州大學動物科學學院，貴陽550025；3.貴州省動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025)

胎盤作為連接母體與胎兒的唯一橋梁，胎盤的形態(tài)和功能與子宮內胎兒的生長發(fā)育密切相關。胎盤功能失調導致的營養(yǎng)供應異常被認為是胎兒發(fā)育不良的重要原因[1]。氨基酸、葡萄糖、脂肪酸是胎兒和胎盤生長的重要營養(yǎng)物質，但從母體輸送到胎兒的大多數(shù)營養(yǎng)物質需有特定的機制來促進轉運[2]。胎盤對營養(yǎng)物質轉運異常與不同妊娠疾病的發(fā)生發(fā)展有關，如胎盤障礙導致氨基酸轉運效率降低而誘發(fā)胎兒宮內發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)[3]。

在模式動物和人類的相關研究中已發(fā)現(xiàn)，胎盤的溶質載體(solute carrier,SLC)是參與氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等營養(yǎng)物質轉運的重要蛋白[4]。Vallet等[2]通過對豬胎盤滋養(yǎng)層細胞的進行轉錄組分析，歸納了239個SLC基因可能參與不同營養(yǎng)物質在母-胎之間的轉運和代謝。胎盤營養(yǎng)轉運相關蛋白在不同妊娠時期可能存在不同表達模式，其表達與胎兒的生長發(fā)育密切相關。在人類和實驗動物中，胎盤氨基酸轉運體基因的異常表達被發(fā)現(xiàn)可能是胎兒體重過低和過高的重要原因[5]，如氨基酸溶質載體家族1中的成員3(SLC1A3)[6]、氨基酸溶質載體家族7中的成員2(SLC7A2)[7]。Cameron等[8]發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾技術下調胎盤中SLC2A3表達會減少綿羊胎兒體重、頭圍、股骨長和脛骨長。在小鼠和大鼠的研究中同樣發(fā)現(xiàn)SLC2A3的表達下調與胎兒體重降低有關[9-10]。在小鼠中，脂肪酸轉運蛋白4(FATP4)基因敲除會導致胚外內胚層中FATP4基因表達缺失而減少對胚胎的營養(yǎng)供應，從而造成早期胚胎致死[11]。此外，胎盤能夠適應性調整其形態(tài)發(fā)育和營養(yǎng)轉運相關基因表達來控制母-胎的營養(yǎng)供應，以達到滿足胎兒生長發(fā)育的最佳營養(yǎng)水平[12-14]。胎兒生長是營養(yǎng)和內分泌環(huán)境調節(jié)遺傳潛能的結果[15]，因此在整個妊娠期，胎盤營養(yǎng)轉運相關蛋白在不同生理條件下可能通過不同的表達模式來調控胎兒的生長發(fā)育。

在母豬妊娠過程中，胎兒在不同的發(fā)育階段具有明顯的營養(yǎng)需求差異，這可能與胎盤營養(yǎng)轉運相關蛋白的時空表達和胎盤形態(tài)發(fā)育密切相關。母豬妊娠第40天是胎盤的絨毛膜和尿囊融合階段，妊娠第65天左右胎盤的形態(tài)發(fā)育完整[16]，而妊娠第95天胎盤褶皺開始擴展，從而增加了母-胎交換效率以滿足胎兒的快速生長[17]。因此，本研究通過分析妊娠第40、65、95天豬胎盤的氨基酸、葡萄糖、脂肪酸轉運體的表達模式來探究它們對母-胎營養(yǎng)供應的潛在影響，對研究胎盤和胎兒的調控關系具有重要科學意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及其飼養(yǎng)管理 15頭遺傳背景和產仔數(shù)接近、胎次在2～4胎的杜洛克經產健康母豬由貴州富之源農業(yè)發(fā)展有限公司提供，使用定位欄飼養(yǎng)在同一個妊娠舍，所有母豬的飼料、飲水、豬舍溫濕度均保持一致。

1.1.2 主要試劑及儀器 總RNA提取試劑盒、β巰基乙醇、StarStain Red Plus核酸染料、瓊脂糖、50×TAE緩沖液、2×TaqPCR StarMix均購自貴州西寶生物有限公司；反轉錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)、DL500 DNA Marker均購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；SYBR Select Master Mix購自賽默飛世爾科技有限公司；熒光定量96孔板購自莫納生物科技有限公司。PCR擴增儀(C1000 TouchTM)、凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ)及電泳儀(DYY-2C型)均購自Bio-Rad公司；超微量紫外分光光度計(NanoDrop One)、實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems QuantStudio 3)均購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及樣品采集 15頭杜洛克母豬平均分為3組，母豬發(fā)情后使用相同公豬的精液通過人工授精配種。在妊娠第40(D40)、65(D65)和95(D95)天通過麻醉(噻拉嗪，2 mg/kg體重)分別取出每組母豬的子宮，快速打開子宮分離出每個胎兒的胎盤組織，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計及合成 根據(jù)GenBank中氨基酸溶質載體基因(溶質載體家族7中的成員1(SLC7A1)、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A10、溶質載體家族38中的成員10(SLC38A10)、溶質載體家族36中的成員1(SLC36A1)、溶質載體家族1中的成員3(SLC1A3)、SLC1A5)、葡萄糖溶質載體基因(葡萄糖轉運蛋白1(SLC2A1)、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A10、SLC2A12和SLC2A13)、脂肪酸溶質載體基因(脂肪酸轉運蛋白1(FATP1)、FATP2、FATP3、FATP4、脂肪酸結合蛋白3(FABP3)、FABP5、FABP7和脂肪酸轉位酶(CD36))等的序列，應用Primer Premier 6.0軟件設計引物，引物信息見表1。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

續(xù)表

1.2.3 總RNA提取與PCR擴增 根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取D40、D65、D95胎盤的總RNA并反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，對所選取的氨基酸、葡萄糖、脂肪酸轉運體相關基因進行普通PCR擴增。PCR反應體系20 μL：2×TaqPCR Star Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性 2 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 實時熒光定量PCR 以β-actin為內參基因，對3個妊娠時期胎盤中氨基酸、葡萄糖、脂肪酸轉運體相關基因mRNA表達水平進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應體系10 μL：SYBR Select Master Mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.4 μL。PCR反應程序：50 ℃ UDG酶激活2 min，95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣品做4個重復。采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異采用t檢驗進行比較，結果用平均值±標準誤表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 營養(yǎng)轉運基因PCR擴增結果

由圖1可知，氨基酸溶質載體基因SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A10、SLC1A3、SLC1A5、SLC38A10、SLC36A1擴增所得產物大小分別為280、223、165、137、140、296、296、168和245 bp，葡萄糖溶質載體基因SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A10、SLC2A12和SLC2A13擴增所得產物大小分別為178、261、134、148、243和167 bp，脂肪酸溶質載體基因FATP2、FATP3、FATP4、FATP1、FABP3、FABP5、FABP7和CD36擴增所得產物大小分別為185、127、198、180、105、182、300和116 bp，擴增所得產物目的片段均與預期相符，且條帶清晰、明亮、無二聚體出現(xiàn)。

M，DL500 DNA Marker；1～23，分別代表SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A10、SLC1A3、SLC1A5、SLC38A10、SLC36A1、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A10、SLC2A12、SLC2A13、FATP2、FATP3、FATP4、FATP1、FABP3、FABP5、FABP7和CD36M,DL500 DNA Marker;1-23,Represent SLC7A1,SLC7A2,SLC7A3,SLC7A4,SLC7A10,SLC1A3,SLC1A5,SLC38A10,SLC36A1,SLC2A1,SLC2A2,SLC2A3,SLC2A10,SLC2A12,SLC2A13,FATP2,FATP3,FATP4,FATP1,FABP3,FABP5,FABP7 and CD36,respectively圖1 豬胎盤營養(yǎng)轉運相關基因PCR檢測結果Fig.1 PCR detection results of nutrition transport-related genes in porcine placenta

2.2 氨基酸轉運相關基因在不同妊娠期豬胎盤中的表達

由圖2可知，氨基酸轉運體相關基因在不同妊娠期胎盤中均有表達。D65胎盤中的SLC7A10、SLC38A10和SLC7A4基因相對表達水平顯著高于D40胎盤(P<0.05)，而SLC7A2基因顯著低于D40胎盤；D65胎盤的SLC1A3和SLC7A4基因相對表達水平均顯著低于D95胎盤(P<0.05)。SLC36A1、SLC1A5、SLC7A1、SLC7A3基因相對表達量在3個妊娠期均差異不顯著(P>0.05)。

2.3 葡萄糖轉運相關基因在不同妊娠期豬胎盤中的表達模式

由圖3可知，在葡萄糖轉運體所有基因中，D65和D95胎盤的SLC2A3和SLC2A13基因相對表達量顯著高于D40胎盤(P<0.05)，D95胎盤中SLC2A1、SLC2A2和SLC2A12基因相對表達量顯著低于D40和D65胎盤(P<0.05)。SLC2A10基因相對表達量在3個妊娠期均差異不顯著(P>0.05)。

相同基因不同時期，肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同The same genes at different times,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖2 不同妊娠期豬胎盤氨基酸轉運相關基因的相對表達量Fig.2 The relative expression of amino acid transport-related genes in porcine placenta at different gestation periods

圖3 不同妊娠期豬胎盤葡萄糖轉運相關基因的相對表達量Fig.3 The relative expression of glucose transport-related genes in porcine placenta at different gestation periods

2.4 脂肪酸轉運相關基因在不同妊娠期豬胎盤中的表達模式

由圖4可知，在脂肪酸轉運體相關基因中，D65胎盤的FATP2、FATP4、FABP3、FABP5、FABP7和CD36基因相對表達量顯著高于D40胎盤(P<0.05)，而FATP1、FATP4和CD36基因相對表達量顯著低于D95胎盤，F(xiàn)ABP3基因相對表達量顯著高于D95胎盤(P<0.05)。FATP3基因相對表達量在3個妊娠期均差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同妊娠期豬胎盤脂肪酸轉運相關基因的相對表達量Fig.4 The relative expression of fatty acid transport-related genes in porcine placenta at different gestation periods

3 討 論

在妊娠中后期，豬胎兒的營養(yǎng)需求增加以應對肌肉生長[18]、器官發(fā)育[19]以及神經系統(tǒng)發(fā)育[20]等，因此胎盤氨基酸、葡萄糖、脂肪酸轉運基因的表達顯著上調可能是由于需要轉運更多營養(yǎng)物質以滿足胎兒的快速生長[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，SLC38A10、SLC7A4、SLC1A3、SLC2A3、FATP1、FATP2、FATP4、FABP5、FABP7、CD36等氨基酸、葡萄糖、脂肪酸轉運體基因的表達水平隨著妊娠進程呈上調趨勢，表明妊娠后期胎豬在快速生長且對營養(yǎng)物質的需求在逐漸增加。

氨基酸、葡萄糖和脂肪酸作為胎兒生長發(fā)育過程中不可或缺的營養(yǎng)物質，胎盤的營養(yǎng)物質轉運異常會導致胎兒發(fā)育不良甚至死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠第65和95天氨基酸轉運體基因SLC38A10、SLC7A4、SLC1A3的轉錄水平顯著上調。SLC38A10介導谷氨酰胺、谷氨酸鹽和天冬氨酸的雙向轉運，并且在參與神經傳遞的途徑中起作用[21]。有研究報道，SLC7A4、SLC1A3是在豬的胎盤中呈高表達的氨基酸轉運體基因[2]。SLC7A4通過細胞內底物的差異反式刺激促進擴散來運輸陽離子氨基酸，其可能參與精氨酸的遞送，用于合成一氧化氮[22]。一氧化氮能夠促進血管形成而增加妊娠后期胎盤血流[23]。SLC1A3是一種高親和力谷氨酸轉運蛋白，在綿羊研究中發(fā)現(xiàn)其表達下調與IUGR有關[24]。谷氨酸是胎盤組織中最豐富，也是妊娠后期豬胎兒中沉積最多的氨基酸[25]，同時谷氨酸也是精氨酸和谷氨酰胺等氨基酸的重要前體物質。本研究發(fā)現(xiàn)，豬胎盤中SLC7A2基因的表達水平在妊娠后期顯著下調可能與底物水平相關。研究發(fā)現(xiàn)，胎盤中SLC7A2表達量在妊娠第30天達到最高，但是隨著妊娠進程SLC7A2對底物的親和力降低和對反式刺激的依賴性變弱，從而導致在妊娠中后期SLC7A2表達量降低[26-27]。因此，SLC1A3、SLC38A10、SLC7A4可能是妊娠后期重要氨基酸供應的轉運基因。

葡萄糖作為胎兒生長發(fā)育的主要能量來源，葡萄糖轉運不足是導致人類胎兒IUGR的病因[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠95 d胎盤的葡萄糖轉運體基因SLC2A1、SLC2A2和SLC2A12的mRNA轉錄水平顯著下調，這可能與轉運蛋白的特異性底物和競爭性轉運有關。SLC2A2基因在小鼠、牛、馬以及豬胚胎中已有報道[29-32]，其在豬妊娠早期大量表達[33]。在馬妊娠早期胎盤中，SLC2A1和SLC2A3是子宮內膜和胚胎細胞膜中表達量最高的葡萄糖轉運蛋白[30]，與本研究結果一致，說明SLC2A1和SLC2A2可能是妊娠早期的主要葡萄糖轉運蛋白。SLC2A1能夠協(xié)助葡萄糖從母體血液轉運至子宮內膜上皮，然后通過SLC2A3介導從尿囊絨毛運輸?shù)教后w內[34]。有研究報道，SLC2A3基因隨妊娠進程逐漸成為豬胎盤絨毛膜中的主要葡萄糖轉運體，這可能是其他轉運蛋白表達下調的重要原因[34]。SLC2A13是質子/肌醇共轉運體，肌醇在胚胎發(fā)育或功能的某些方面具有重要作用[2]，這可能是豬胎盤中SLC2A13基因的轉錄水平在妊娠第65和95天顯著增加的潛在原因。這些結果表明葡萄糖轉運體基因在不同妊娠期呈現(xiàn)差異表達，這可能與胎兒的葡萄糖需求有關。

必需脂肪酸及其長鏈多不飽和脂肪酸衍生物(如二十二碳六烯酸和花生四烯酸)對胎兒的正常生長發(fā)育尤為重要。母體循環(huán)中脂肪酸能夠通過被動擴散方式被胎兒吸收，但是單純的擴散速度不足以滿足妊娠后期胎兒的脂肪酸需求[35]。因此，胎兒生長所需的大部分脂肪酸必需依賴于胎盤中的脂肪酸轉運體[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，豬胎盤中FATP1、FATP2、FATP4、FABP5、FABP7、CD36等脂肪酸轉運體基因的mRNA表達水平在妊娠中后期顯著上調，而妊娠中期FABP3基因轉運體相對表達量顯著高于妊娠早期和妊娠后期。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3可能促進滋養(yǎng)層細胞對花生四烯酸的攝取而參與早期發(fā)育過程，如胚胎附植、血管生成、器官發(fā)生等[37]，其在妊娠后期表達降低，可能是一種保護性胎盤適應機制，使胎兒在不同發(fā)育階段攝取不同的必需脂肪酸。在大鼠的研究中，Knipp等[38]發(fā)現(xiàn)FABP的表達水平隨孕齡不斷升高，可能與妊娠后期胎兒的快速生長有關。雌激素能夠上調子宮內FABP7的表達[39]，而雌激素水平與妊娠期呈正相關，這可能也是FABP7隨著妊娠期表達量上調的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，母豬背膘過厚(>20 mm)導致胎盤CD36、FATP1基因表達量下調，這與胎兒循環(huán)中的脂質含量下降一致[40]。Ao等[41]發(fā)現(xiàn)，胎盤中FATP4基因表達下調可能是導致胎兒循環(huán)脂肪酸水平降低而引發(fā)克隆豬體重偏低的重要原因。FATP4的作用主要包括將長鏈脂肪酸激活成?；o酶A，從而使脂肪酸衍生物參與脂質代謝途徑[42]，F(xiàn)ATP1也可以促進長鏈脂肪酸的細胞攝取[43]。隨著孕齡增加，胎兒對長鏈不飽和脂肪酸的需求量增加，胎盤脂肪酸轉運體的轉運能力也增加[44]。此外，大量證據(jù)表明從母體循環(huán)獲得的脂肪酸在圍產期大量沉積在胎兒組織中[45]，這表明妊娠后期胎兒對脂肪酸的需求量在不斷增加。因此，豬胎盤中FATP1、FATP2、FATP4、FABP5、FABP7、CD36等相關轉運體基因可能是妊娠中后期調控胎盤脂肪酸轉運進而影響胎兒生長發(fā)育的重要基因。

4 結 論

豬胎盤中SLC38A10、SLC7A4、SLC1A3、SLC2A3、FATP1、FATP2、FATP4、FABP5、FABP7、CD36等基因的表達在妊娠第65和95天上調，說明這些營養(yǎng)轉運基因可能是胎兒生長和發(fā)育的重要調控因子。結果可為建立提高豬胎兒宮內發(fā)育質量的新策略提供理論依據(jù)。