廣東省豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離鑒定及耐藥表型和耐藥基因檢測(cè)與分析

徐民生，柯海意，施科達(dá)，楊冬霞，翟少倫，臧瑩安，李春玲

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣州 510305；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所,廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640)

中國(guó)是世界上重要的豬肉生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，廣東省作為全國(guó)重要的產(chǎn)豬大省，其規(guī)模和出欄量均位于全國(guó)前列。自2019年國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部準(zhǔn)備實(shí)施“飼料禁抗”政策以來，傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式的改變也加大了病原菌在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)傳播的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。在引起豬呼吸道疾病的幾類傳染病中，由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia，PCP)在世界范圍內(nèi)造成了較高的發(fā)病率和死亡率[3]。APP是一種定植于豬上呼吸道的革蘭氏陰性、無運(yùn)動(dòng)的桿狀細(xì)菌，主要導(dǎo)致發(fā)病豬出現(xiàn)急性或慢性的壞死性-纖維素性胸膜肺炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

根據(jù) APP 生長(zhǎng)對(duì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的依賴性，將其分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[5]。同時(shí)以莢膜多糖的抗原特性將該物種分為19種血清型,眾多的血清型及區(qū)域流行的差異、暫無高效安全的疫苗及耐藥菌株的出現(xiàn)，給APP的防控和治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)[6-7]。發(fā)病豬被認(rèn)為是最主要的傳染源，且在<1 m的短距離中APP也會(huì)隨著空氣進(jìn)行傳播，所有年齡的豬均會(huì)感染，特別是3月齡的育肥豬最易感染，且通常會(huì)導(dǎo)致較高的發(fā)病率和死亡率[8-9]。使用抗生素是目前最主要的預(yù)防和治療手段，但抗生素的濫用導(dǎo)致APP對(duì)常用抗生素的耐藥性(AMR)日益嚴(yán)重，且越來越多的多重耐藥菌株也為臨床治療和防控該疾病帶來了很大困擾[10]。已有研究表明，對(duì)豬的最佳治療和謹(jǐn)慎使用抗生素是防止關(guān)鍵耐藥性發(fā)展和確保動(dòng)物健康的必要條件,某些細(xì)菌的耐藥性也會(huì)隨著使用情況和時(shí)間的推移發(fā)生變化[11]。因此，對(duì)豬致病菌耐藥性的持續(xù)監(jiān)測(cè)顯得十分必要。

為了解和掌握近3年廣東省內(nèi)規(guī)?；i場(chǎng)APP感染和耐藥的情況，本研究以疑似APP感染病豬為研究對(duì)象，分別進(jìn)行APP的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及耐藥基因的檢測(cè)，并進(jìn)一步分析耐藥表型和耐藥基因的關(guān)系，以期為臨床上防治APP提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及菌株 2019-2021年采集廣東省不同地區(qū)不同規(guī)模化豬場(chǎng)疑似感染豬傳染性胸膜肺炎的病死豬的肺臟、肝臟等組織。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA培養(yǎng)基)、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基)、普通綿羊血平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(北京索萊寶科技有限公司)；小牛血清(廣州蕊特生物科技有限公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×rTaqMix、DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；革蘭氏染液、生化反應(yīng)管和藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)。

電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品)；PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 無菌采集病死豬組織病料，使用接種環(huán)無菌接種于TSA固體培養(yǎng)基(含10%小牛血清及0.1% NAD)上，于37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形態(tài)，挑取疑似單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。并對(duì)純化后的菌落進(jìn)行涂片和革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察并記錄菌體形態(tài)。

1.2.2 生化鑒定試驗(yàn) 將分離菌株的液體培養(yǎng)物分別接種于添加了0.1% NAD的生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其生化反應(yīng)特性并按照說明書進(jìn)行鑒定。

1.2.3 APP菌種的PCR鑒定 參考王海麗等[12]合成APP菌種特異性靶基因OmlA的引物。引物序列為：F：5′-AAGGTTGATATGTCCG-CACC-3′；R：5′-CACCGATTACGACTTGCC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為952 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用試劑盒提取DNA并以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系25 μL：2×rTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，回收陽性PCR產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 相似性及進(jìn)化樹分析 將測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)。選取NCBI數(shù)據(jù)庫中與APP相似性相近的10條序列(表1)，用Mega 7.0 軟件對(duì)選取的序列進(jìn)行編輯，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 參考菌株信息

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用K-B藥敏紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離菌株接種至含有10%小牛血清及0.1% NAD的TSB培養(yǎng)基中，制成含菌量約為0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海?00 μL并用無菌棉簽均勻涂布于TSA平板(含0.1% NAD和10%小牛血清)表面，待液體吸干后用無菌鑷子夾取抗生素藥敏紙片貼在平板表面，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)30 min，后倒置培養(yǎng)12～18 h，記錄抑菌圈直徑并參照杭州微生物試劑有限公司提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判定分離菌為耐藥(R)、中介(I)和敏感(S)。

耐藥率(%)=對(duì)某種抗菌藥物耐藥的菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100%

耐藥表型率(%)=對(duì)某類抗菌藥物耐藥的總菌株數(shù)/檢測(cè)某類抗菌藥物的總菌株數(shù)×100%

1.2.6 耐藥基因檢測(cè) 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA作為PCR反應(yīng)模板，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)細(xì)菌耐藥情況及參考相關(guān)文獻(xiàn)[13-19]報(bào)道，設(shè)計(jì)合成7類23種耐藥基因引物并進(jìn)行檢測(cè)，包括：β-內(nèi)酰胺類blaCMY、blaOXA、blaSHV、blaTEM基因；氨基糖苷類ant(6′)-Ⅰa、aph(2″)-Ⅰb、aph(2″)-Ⅰc和aph(2″)-Ⅰd基因；大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類mefA、ermA、ermB基因；磺胺類sul1、sul2和sul3基因；四環(huán)素類tetA、tetB、tetM、tetO和tetR基因；喹諾酮類gyrA和parC基因；氯霉素類floR和fexA基因。引物信息見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×rTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性40 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

耐藥基因攜帶率(%)=對(duì)某種耐藥基因的陽性菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100%

耐藥基因平均攜帶率(%)=對(duì)某類抗菌藥物的總攜帶率/某類抗菌藥物耐藥基因總數(shù)×100%

耐藥基因與耐藥表型相符率(%)=耐藥基因平均攜帶率/耐藥表型率×100%

表2 耐藥基因引物信息

續(xù)表

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

在TSA(含NAD)平板上分離出圓形、小而透明的露珠樣黏液型菌落(圖1)，革蘭氏染色結(jié)果顯示分離菌為革蘭氏陰性菌，多成短桿狀，兩極著色明顯(圖2)，共獲得20株分離菌。

圖1 分離菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the isolated bacteria

圖2 分離菌革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)Fig.2 Gram staining results of the isolated bacteria (1 000×)

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，20株分離菌對(duì)葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、甘露醇、尿素酶和硝酸鹽還原酶的反應(yīng)為陽性；蕈糖、棉子糖、血清菊糖、山梨醇、水楊素和七葉苷反應(yīng)為陰性(表3)。生化試驗(yàn)結(jié)果與APP生化特性一致，可初步確定分離菌為APP。

表3 20株臨床分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.3 分離菌株P(guān)CR鑒定

采用針對(duì)APP菌種的特異性引物進(jìn)行OmlA基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示，分離株均獲得長(zhǎng)度為952 bp的特異性條帶(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。本試驗(yàn)共成功分離到20株APP，分別將其命名為GD1901～GD1908、GD2009～GD2014、GD2115～GD2120，并保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所豬病研究室。

M，DL2000 DNA Marker；-，陰性對(duì)照；+，陽性對(duì)照；1～20，分離株M，DL2000 DNA Marker;-，Negative control;+，Positive control;1-20,The isolates圖3 分離株OmlA基因PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification results of OmlA gene of the isolates

2.4 序列相似性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

20株APP分離菌株經(jīng)OmlA基因擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與參考菌株進(jìn)行序列相似性分析，結(jié)果顯示，分離菌株與已發(fā)表的10株APP序列相似性在98%～100%之間。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，APP廣東分離株GD1904、GD2119、GD1905、GD2117、GD2118、GD2116與APP瑞士分離株WF83和德國(guó)分離株AP76親緣關(guān)系較近，聚成一簇，并與中國(guó)分離株JL03和美國(guó)分離株NCTC11384處在同一分支；GD1901、GD1902、GD1903進(jìn)化關(guān)系較近，并與巴西分離株MV279和加拿大分離株L20處在同一分支；GD1906、GD1907親緣關(guān)系較近，GD2115、GD2009、GD2011、GD2014、GD2010、GD2012、GD2013的進(jìn)化關(guān)系較近，促成一簇并與丹麥分離株NCTC10976和愛爾蘭分離株S405處在同一分支；GD1908和GD2120都與韓國(guó)分離株KL16處在同一分支(圖4)。

圖4 APP分離株OmlA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of OmlA gene of APP isolates

2.5 藥物敏感性鑒定

藥敏結(jié)果顯示，分離的20株APP菌株對(duì)臨床上常用的18種抗菌藥物產(chǎn)生不同程度的多重耐藥性，對(duì)青霉素、克拉霉素、磺胺異噁唑、四環(huán)素和林可霉素5種藥物的耐藥率最高，達(dá)到70%～100%；對(duì)氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素和氟苯尼考6種藥物的耐藥率為30%～60%；對(duì)頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻肟(凱福隆)、卡那霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星7種藥物耐藥率較低，為10%～25%；其中對(duì)頭孢唑啉(先鋒Ⅴ)、阿奇霉素2種藥物敏感(表4)。

多重耐藥情況的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，分離菌均呈現(xiàn)多重耐藥性(表5)。其中10重及以上耐藥的菌株最多，有7株，占比達(dá)到35%，9重和8重耐藥菌株占比分別達(dá)到10%和5%，由此可見約50%分離菌株為8重及以上耐藥；6重和7重耐藥菌株也較多，共有8株，占比達(dá)到40%；5重耐藥菌株數(shù)占比較少，為10%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，分離的20株APP的多重耐藥情況十分嚴(yán)重。

表5 APP臨床分離株的多重耐藥情況

2.6 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，20株APP中β-內(nèi)酰胺類中blaCMY基因攜帶率最高，為85%(17/20)，blaOXA、blaTEM、blaSHV基因均未檢測(cè)出；氨基糖苷類中aph(2″)-Ⅰb基因攜帶率最高，為85%(17/20)，aph(3″)-Ⅲa、ant(6′)-Ⅰa、aph(2″)-Ⅰc和aph(2″)-Ⅰd基因未檢測(cè)出；氯霉素類中floR基因攜帶率最高，為80%(16/20)，未檢測(cè)到fexA基因；磺胺類sul3基因攜帶率最高，為75%(15/20)，sul1和sul2耐藥基因攜帶率分別為50%(10/20)和60%(12/20)；四環(huán)素類中tetB和tetO基因攜帶率最高，為100%(20/20)，tetM基因攜帶率為85%(17/20)，tetR基因攜帶率為70%(14/20)，tetA基因攜帶率為30%(6/20)；未檢測(cè)出大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類相關(guān)耐藥基因。部分凝膠電泳結(jié)果見圖5～7。

①A～C，分別為blaCMY、aph(2″)-Ⅰb和floR基因。②M，DL2000 DNA Marker；1～8，GD1901～GD1908；9～14，GD2009～GD2014；15～20，GD2115～GD2120。下同①A-C，blaCMY，aph(2″)-Ⅰb and floR genes,respectively；②M，DL2000 DNA Marker；1-8，GD1901-GD1908；9-14，GD2009-GD2014；15-20，GD2115-GD2120.The same as below圖5 blaCMY、aph(2″)-Ⅰb和floR耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of blaCMY,aph(2″)-Ⅰb and floR resistance genes

A～C,分別為sul1、sul2和sul3基因A-C,sul1,sul2 and sul3 genes,respevtively圖6 磺胺類耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification results of sulfonamides resistance genes

A～E,分別為tetA、tetB、tetM、tetO和tetR基因A-E,tetA,tetB,tetM,tetO and tetR genes,respectively圖7 四環(huán)素類耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR amplification results of tetracyclines resistance genes

2.7 耐藥表型與耐藥基因相關(guān)性

在檢測(cè)的20株APP中，耐藥表型不同程度地高于相應(yīng)耐藥基因的攜帶率(表6)。分離株對(duì)磺胺類和四環(huán)素類藥物表現(xiàn)出較高程度的耐藥性，同時(shí)磺胺類耐藥基因(sul1、sul2和sul3基因)和四環(huán)素類耐藥基因(tetB和tetO基因等)的陽性檢出率也較高，表現(xiàn)較為一致，相符率達(dá)到94.9%和99.4%；β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和的耐藥表型和耐藥基因的攜帶率均較低，為20%～40%；氯霉素類藥物中針對(duì)氟苯尼考藥物的耐藥基因(floR基因)檢出率較高，與藥物的耐藥表型也基本一致；而對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類和喹諾酮類沒有檢測(cè)到相關(guān)的耐藥基因，但在表型上表現(xiàn)出一定的耐藥率，分別為31.7%、100%和15%。

表6 分離株APP耐藥基因與耐藥表型相關(guān)性

3 討 論

豬傳染性胸膜肺炎被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)工業(yè)化養(yǎng)豬的三大呼吸道疾病之一[20]，目前商業(yè)疫苗只能提供有限的保護(hù)，抗生素的使用依然是臨床上治療該病的有效措施，但由于長(zhǎng)期以來抗生素的濫用導(dǎo)致許多耐藥菌株的出現(xiàn)[21]，世界衛(wèi)生組織更是將耐藥性列為世界公共衛(wèi)生的三大威脅之一[11]。因此，進(jìn)行流行病學(xué)跟蹤以明確APP的耐藥譜和耐藥基因的攜帶率對(duì)臨床上科學(xué)的指導(dǎo)用藥和減少耐藥性的產(chǎn)生具有重要意義。

本試驗(yàn)針對(duì)廣東省不同地區(qū)豬場(chǎng)分離得到20株APP，經(jīng)PCR擴(kuò)增OmlA基因(OmlA基因?yàn)锳PP外膜脂蛋白的種特異性靶基因，可準(zhǔn)確快速地鑒定細(xì)菌[12])鑒定后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI上選取的10株參考菌株進(jìn)行BLAST比對(duì)，相似性達(dá)98%以上。進(jìn)化樹結(jié)果顯示,分離株GD1904、GD2119、GD1905、GD2117、GD2118、GD2116與中國(guó)分離株JL03親緣關(guān)系較近，處在同一分支；其他分離株分別與不同國(guó)家的APP分離株有進(jìn)化關(guān)系，表明20株APP可能由于在地理位置上分布廣，沒有表現(xiàn)出明顯的地域特性和物種特性。

本研究針對(duì)臨床上常用的20種抗菌藥，對(duì)分離株分別進(jìn)行7大類23種耐藥基因和耐藥表型檢測(cè)，結(jié)果顯示，20株分離菌除了對(duì)阿奇霉素和頭孢唑啉(先鋒Ⅴ)完全不耐藥外，對(duì)青霉素等其他抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，對(duì)磺胺異噁唑、林可霉素和四環(huán)素高度耐藥，耐藥率為100%；對(duì)氨芐西林、慶大霉素等6種藥物較耐藥，耐藥率為30%～60%；對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻肟(凱福隆)等7種藥物耐藥率較低，為10%～25%。Kucerova等[22]報(bào)道捷克APP分離菌株對(duì)氟苯尼考、阿莫西林-克拉維酸藥物耐藥性較低，而對(duì)四環(huán)素耐藥性較高，為23.9%；Kim等[23]和Archambault等[24]報(bào)道的APP分離菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性低；王丹丹等[21]檢測(cè)蘇中地區(qū)APP藥敏結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物高度敏感，對(duì)鏈霉素耐藥；余波等[25]分析貴州省APP耐藥表型的結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)四環(huán)素及磺胺類藥物耐藥，但對(duì)氟苯尼考敏感。通過比較可發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)分離株的耐藥表型與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)相似，但與國(guó)外差異較大，其中四環(huán)素類的耐藥性大幅增加，氟苯尼考的耐藥性也有所變化，這可能由于四環(huán)素耐藥菌株的不斷進(jìn)化和臨床上對(duì)氟苯尼考的使用頻率加大導(dǎo)致APP菌對(duì)該藥物的耐藥率增加。耐藥基因方面，本研究共檢測(cè)到blaCMY、aph(2″)-Ⅰb、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetM、tetO、tetR和floR共11種耐藥基因，四環(huán)素類的耐藥基因tetB和tetO的攜帶率最高，達(dá)到100%；blaCMY、aph(2″)-Ⅰb、tetM和floR基因的攜帶率達(dá)到80%～85%；磺胺類耐藥基因sul2和sul3、四環(huán)素類tetM基因和氟苯尼考中的floR基因檢出率為60%以上。李海利等[16-17]報(bào)道河南省APP對(duì)四環(huán)素類耐藥基因的最高檢出率為78.8%，磺胺類耐藥基因sul2的檢出率為100%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)本研究對(duì)四環(huán)素類耐藥基因的檢出率增加，這與前面藥敏試驗(yàn)結(jié)果中對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥性較高表現(xiàn)一致；值得注意的是有些分離菌株對(duì)氟苯尼考不耐藥，但仍然能檢出floR基因。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，耐藥基因檢出結(jié)果與耐藥表型基本一致，表明耐藥基因的攜帶是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因之一。但大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類的耐藥基因均未檢測(cè)到，藥敏結(jié)果卻顯示部分分離株對(duì)克拉霉素和恩諾沙星耐藥，說明可能存在其他未檢出的耐藥基因，或其他尚未發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究檢測(cè)分析了2019-2021年從廣東省不同豬場(chǎng)分離到的20株APP耐藥譜和耐藥基因的攜帶情況。藥敏結(jié)果顯示，分離株對(duì)四環(huán)素類和磺胺類藥物表現(xiàn)出廣泛耐藥，且為多重耐藥；耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，部分耐藥菌株同時(shí)攜帶多種耐藥基因，以tetB、tetO和floR等耐藥基因?yàn)橹?。APP耐藥機(jī)制復(fù)雜，結(jié)合耐藥表型和耐藥基因的檢測(cè)，篩選敏感藥物，可減少或避免耐藥菌株的出現(xiàn)，對(duì)防治豬傳染性胸膜肺炎有重要的實(shí)踐意義。