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    天名精總倍半萜內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

    2022-08-22 08:04:22姚思凡陳迪路周小江
    關(guān)鍵詞:特勒倍半萜藥代

    姚思凡,陳迪路,張 藝,周小江,2*

    (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208;湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410208)

    天名精(Carpesium abrotanoides L)為菊科天名精屬草本植物,又稱鶴虱草、活鹿草、天門精、玉門精等。廣泛生長于路邊、溪邊和山坡,分布于我國西南、華中、華南等地區(qū)[1]。 天名精始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品。其性辛涼,味苦,有小毒,具有驅(qū)蟲的功效[2-3],《本草綱目·草部》曾記載:“久服身輕耐老”[4]?,F(xiàn)收錄于2009 版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》,用于治療咽喉腫痛,蛔蟲病、蟯蟲病等蟲積腹痛,在苗族、土家族等少數(shù)民族被廣泛應(yīng)用[5]。

    在前期藥效學(xué)和毒理學(xué)試驗(yàn)中,本課題組證明了天名精總倍半萜內(nèi)酯提取物具有較好的抗癌和抗流感病毒作用,同時(shí)毒副作用小[6]。研究表明,天名精總倍半萜內(nèi)酯具有抗甲型H1N1 流感病毒的藥理作用,其中11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮為其主要活性成分,具有抗炎、抗菌、抗病毒等廣泛的藥理活性[7-10]。 但是目前尚無關(guān)于天名精總倍半萜內(nèi)酯相關(guān)成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道。 本文對天名精總倍半萜內(nèi)酯進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究,以期解釋3 種天名精總倍半萜內(nèi)酯在動(dòng)物體內(nèi)的代謝規(guī)律,進(jìn)一步為天名精總倍半萜內(nèi)酯提取物抗甲型H1N1 流感病毒藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 儀器與材料

    1.1 主要儀器與試劑

    LC-16 型高效液相色譜儀(日本島津公司);As3120型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);CP214 型分析天平(美國奧豪斯公司);SorvaLL ST 8R 型高速離心機(jī)(美國賽默飛公司);HSC-24A型氮?dú)獯蹈蓛x(天津恒奧科技有限公司);QL-866 型渦旋振蕩器(海門市其林貝爾公司)。 怡寶水(華潤集團(tuán),批號:60220010265);乙腈(色譜純,批號:20145210)、甲醇(色譜純,批號:32157560)均購自美國天地公司;乙酸乙酯(分析純,國藥集團(tuán),批號:20191013)。

    1.2 試藥

    供試品:天名精總倍半萜內(nèi)酯,自制。對照品:11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯和天名精內(nèi)酯酮均為自制,經(jīng)1D-和2D-NMR 分析,同時(shí)參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11-14]確定結(jié)構(gòu),并經(jīng)HPLC 峰面積歸一化法檢測,純度均大于97%。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康清潔級雄性SD 大鼠(270±10) g。 購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)[許可證號:SYXK(湘)2013-005]。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

    色譜柱:WondaSiL C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(29.5∶70.5);流速:1.0 mL/min;檢測波長:211 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。 在該色譜條件下,11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮的色譜峰理論塔板數(shù)均大于4000,各個(gè)色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,符合要求。

    2.2 母液配置

    精密稱取干燥至恒重的11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯和天名精內(nèi)酯酮適量,分別置于25 mL 容量瓶中,加入甲醇,分別配置成濃度為44、40、40 μg/mL的對照品溶液。 置于4 ℃冰箱中避光保存,備用。

    2.3 血漿樣品處理

    精密移取血漿100 μL,置于1.5 mL EP 管中,加入500 μL 乙酸乙酯,渦旋混勻3 min,在4 ℃、10 000 r/min 條件下高速離心10 min(離心半徑6 cm),取上清液于1.5 mL EP 管中,重復(fù)萃取2 次,合并2次的乙酸乙酯萃取液,加入4 倍量乙腈沉淀蛋白,渦旋混勻30 s,于40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?,殘?jiān)尤?00 μL 流動(dòng)相渦旋振蕩溶解,在4 ℃,10 000 r/min條件下高速離心10 min(離心半徑6 cm),取上清液20 μL 進(jìn)樣。

    2.4 方法學(xué)考察[15-17]

    2.4.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別移取100 μL 空白血漿、加入25%羥丙基-β-環(huán)糊精的100 μL 陰性對照、加入天名精總倍半萜內(nèi)酯提取物的100 μL 空白血漿、100 μL 給藥后大鼠血漿,按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品后,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)和25%羥丙基-β-環(huán)糊精不干擾天名精總倍半萜內(nèi)酯中3 種主成分的測定,且3 種主成分的色譜峰峰型良好。 保留時(shí)間分別為43.3、46.5、50.8 min,詳見圖1。

    圖1 專屬性色譜圖

    2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取“2.2”項(xiàng)下配制的11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮各8 mL,溶于25 mL 容量瓶中,加甲醇適量定容,得到3 種主成分的混標(biāo)母液,混勻備用。移取混標(biāo)母液,配置成系列濃度的混合對照品溶液。 取各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μL,加入100 μL 空白血漿,配制成相應(yīng)的系列質(zhì)量濃度含藥血漿樣品,按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品,再以各主成分相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸,得各成分的回歸方程:11(13)-二氫特勒內(nèi)酯為Y=25 909X-527.53,R2=0.993;特勒內(nèi)酯為Y=29 787X+493.56,R2=0.995;天名精內(nèi)酯酮為Y=28 107X-2026,R2=0.991。 詳見圖2。

    圖2 3 種天名精總倍半萜內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    結(jié)果表明,在此色譜條件下,特勒內(nèi)酯、11(13)-二氫特勒內(nèi)酯在濃度為0.031~12.8 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 天名精內(nèi)酯酮在濃度為0.034~14.1 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取混標(biāo)母液及大鼠空白血漿100 μL,分別配制低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液:11(13)-二氫特勒內(nèi)酯(0.64、0.64、0.70 μg/mL)、特勒內(nèi)酯(1.60、1.60、1.76 μg/mL)、天名精內(nèi)酯酮(6.40、6.40、7.04 μg/mL),每個(gè)濃度平行配制5 份。將血漿按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后,取上清液進(jìn)行色譜分析,測定血漿中3 種天名精總倍半萜內(nèi)酯成分。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算質(zhì)量濃度,計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)3 d 重復(fù)上述操作,計(jì)算日間精密度。 詳見表1。

    結(jié)果顯示,上述方法測得的日內(nèi)RSD、日間RSD和相對回收率均小于15%,符合生物分析方法指導(dǎo)原則的要求。

    2.4.4 回收率實(shí)驗(yàn) 取大鼠空白血漿加入混標(biāo)母液,分別配制低、中、高3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每個(gè)質(zhì)量濃度平行配制5 份。 按照“2.3”項(xiàng)下的方法處理血漿樣品后檢測,記錄目標(biāo)峰的峰面積為血漿標(biāo)準(zhǔn)峰面積。 另取3 支EP 管,每組取一支加入與配制血漿對照品溶液相同的對照品溶液,40 °C 氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶,取20 μL上清液進(jìn)液相檢測;記錄低、中、高3 種不同濃度下目標(biāo)化合物的峰面積為對照品的峰面積。 計(jì)算血漿中樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積比值,即為絕對回收率。詳見表1。

    表1 精密度和回收率考察結(jié)果

    結(jié)果顯示,RSD 均小于15%,符合生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則的要求。

    2.4.5 樣品穩(wěn)定性測定 分別配制低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液,每個(gè)濃度平行配制5 份。取低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理,取0、12、24、48 h 的樣品上清液注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析,測定血漿中目標(biāo)化合物的峰面積,考察室溫條件下放置48 h 血漿樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品中,11(13)-二氫特勒內(nèi)酯RSD 分別為6.02%、3.15%、5.20%;特勒內(nèi)酯RSD 分別為4.05%、1.61%、5.76%;天名精內(nèi)酯酮RSD 分別為4.59%、3.54%、5.73%。

    取低、中、高3 種不同濃度的血漿質(zhì)控樣品,反復(fù)凍融3 個(gè)循環(huán),測定血漿樣品從-80 ℃至室溫條件下凍融3 個(gè)循環(huán)的穩(wěn)定性。 低、中、高3 個(gè)不同濃度血漿質(zhì)控樣品中11(13)-二氫特勒內(nèi)酯的RSD 分別為3.46%、4.38%、5.76%;特勒內(nèi)酯的RSD 分別為6.71%、5.81%、1.78%;天名精內(nèi)酯酮RSD 分別為8.95%、3.18%、1.79%。

    取低、中、高3 個(gè)不同濃度的血漿質(zhì)控樣品,考察樣品在-80 ℃條件下凍存7 d 的穩(wěn)定性。 3 個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品中11(13)-二氫特勒內(nèi)酯的RSD 分別為6.11%、2.55%、4.07%;特勒內(nèi)酯的RSD 分別為7.03%、7.74%、2.46%;天名精內(nèi)酯酮RSD 分別為7.71%、6.18%、1.43%。 詳見表2。

    表2 樣品穩(wěn)定性考察

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,天名精總倍半萜內(nèi)酯血漿樣品穩(wěn)定性RSD 均小于10%,說明天名精總倍半萜內(nèi)酯血漿樣品在以上3 種情況下基本穩(wěn)定。

    2.5 大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

    用50 μL 乙醇溶解樣品后,以25%的羥丙基-β-環(huán)糊精為溶劑,制備質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的天名精總倍半萜內(nèi)酯藥液,超聲使其完全溶解。選取9只健康雄性SD 大鼠,通過尾靜脈注射給藥,劑量為50 mg/kg。 給藥后5、10、15、20、30、45 min 及1、1.5、2、3、4、6、8 h 通過眼底靜脈叢取血約0.5 mL,將采集的全血收集于肝素抗凝管中,以4000 r/min 的速度離心15 min(離心半徑6 cm),吸取上層血漿。 按照“2.3”項(xiàng)下方法處理大鼠血漿樣品,按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣,進(jìn)行高效液相色譜分析,記錄色譜峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物質(zhì)量濃度。 對于計(jì)算求得的血藥濃度,使用軟件DAS 2.0 進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)擬合計(jì)算,獲得天名精總倍半萜內(nèi)酯3 種主要成分給藥后藥時(shí)曲線與相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

    分析主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并結(jié)合藥時(shí)曲線可知,天名精總倍半萜內(nèi)酯3 種成分單次尾靜脈給藥后,體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程中11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯符合三室模型,天名精內(nèi)酯酮符合二室模型。 給藥后,11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮的血藥質(zhì)量濃度迅速達(dá)到最大值,分別為3.843、9.076、2.060 μg/mL;曲線下面積AUC(0~T)分別為145.564、262.401、98.086 min/(μg·mL);藥物半衰期t1/2為15.835、62.318、41.843 min;血漿清除率CLz為0.183、0.145、0.311 L/(min·kg),結(jié)果見圖3 和表3。利用DAS 2.0 軟件對測得的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行房室模型擬合。

    表3 天名精總倍半萜內(nèi)酯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

    圖3 天名精總倍半萜內(nèi)酯的藥時(shí)曲線

    3 討論

    中藥藥代動(dòng)力學(xué)是借用化學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究手段,研究中藥活性成分、組分、單味中藥和復(fù)方在機(jī)體內(nèi)的過程及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,以探討中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、中藥組分的相互作用、中藥配伍機(jī)制和中藥炮制機(jī)制等科學(xué)問題[18]。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC測定大鼠尾靜脈注射天名精總倍半萜內(nèi)酯后的多指標(biāo)成分的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。通過方法學(xué)驗(yàn)證,此方法可快速、靈敏、準(zhǔn)確地同時(shí)測定11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮3 種成分,測定結(jié)果均符合現(xiàn)行生物分析方法的相關(guān)規(guī)定[19-20]。

    在給藥前選擇溶解天名精總倍半萜內(nèi)酯方法時(shí),因其溶解度不佳,先后對比了DMSO、乙醇、β-環(huán)糊精、吐溫80、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇等表面活性劑,在查閱文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)后選擇了用乙醇溶解樣品,加入25%羥丙基-β-環(huán)糊精作為表面活性劑,增加了天名精總倍半萜內(nèi)酯的溶解度,可用于下一步的尾靜脈注射給藥[21]。 在選擇血漿樣品預(yù)處理方法時(shí),本實(shí)驗(yàn)先后對比了蛋白沉淀法和液液萃取法,液液萃取法所選擇的溶劑為乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮等試劑,蛋白沉淀法所選擇的溶劑為甲醇和乙腈。 通過計(jì)算提取回收率,發(fā)現(xiàn)先用乙酸乙酯萃取后用乙腈沉淀蛋白為天名精總倍半萜內(nèi)酯血漿藥代動(dòng)力學(xué)中最佳的樣品處理方法。

    綜上所述,本研究建立了HPLC 測定大鼠尾靜脈注射天名精總倍半萜內(nèi)酯后的多指標(biāo)成分的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,首次研究了天名精總倍半萜內(nèi)酯靜脈給藥后在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律,為天名精總倍半萜內(nèi)酯臨床用藥提供了相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)支持,完善了湘產(chǎn)中藥材天名精的研究,為天名精總倍半萜內(nèi)酯的抗甲型H1N1 流感病毒的中藥新藥研發(fā)提供了相關(guān)數(shù)據(jù)支持,為天名精總倍半萜內(nèi)酯的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ),對進(jìn)一步開發(fā)利用湘產(chǎn)中藥材天名精具有重大意義。

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