二甲雙胍對(duì)脊髓損傷小鼠的神經(jīng)修復(fù)作用

王大昊，閆 鵬

(錦州醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院骨科,錦州 121000)

0 引言

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是由交通事故及慢性脊柱疾病急性發(fā)作等多種病因引起的突發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓組織嚴(yán)重?fù)p傷的一類臨床疾病，常引起患者的感覺、運(yùn)動(dòng)和自主神經(jīng)功能障礙、嚴(yán)重感染和多器官衰竭的臨床表現(xiàn)，對(duì)社會(huì)發(fā)展及患者家庭造成極大的不良影響[1]。脊髓損傷主要的病理學(xué)機(jī)制有Ca2+內(nèi)流增加，促炎性炎癥因子過載和自噬等[1-4]，靶向相關(guān)分子機(jī)制成為目前臨床和基礎(chǔ)研究脊髓損傷的治療熱點(diǎn)[4]。白介素(interleukin，IL)家族與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[5]。白介素-6(interleukin-6，IL-6)已被證實(shí)，其在病灶微環(huán)境及細(xì)胞自噬的病理生理過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，自噬在脊髓損傷的發(fā)展過程起到保護(hù)作用。脊髓損傷后應(yīng)用雷帕霉素(Rapamycin)治療，可引起脊髓組織的自噬活動(dòng)增強(qiáng)，并降低神經(jīng)元的死亡率，減少脫髓鞘的面積，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[6-7]。綜上所述，經(jīng)推測(cè)，脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞功能與白介素-6之間可能存在一定關(guān)聯(lián)，但是具體的機(jī)制仍不明確。既往研究表明，二甲雙胍(Metformin)可以降低脊髓損傷后IL-6的表達(dá)，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[8]。因此，本研究通過研究二甲雙胍治療后小鼠脊髓損傷病灶中炎癥因子IL-6以及自噬特異蛋白雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的表達(dá)變化，以探討二甲雙胍促進(jìn)脊髓損傷小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取成年雌性C57BL/6小鼠48只，清潔級(jí)，8周齡，體重22～28 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均進(jìn)行封閉、分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24℃。

1.2 分組及模型制備

將48只成年雌性C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、脊髓損傷組(SCI組)和二甲雙胍治療組(Metformin組)，每組16只。各組腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg)，充分麻醉后進(jìn)行消毒并備皮，以T10棘突為中心行縱向切口，充分暴露脊柱后切除T10棘突及椎板，充分暴露完整的小鼠脊髓組織；Sham組行椎板切除術(shù)，不做其他處理。SCI組及Metformin組小鼠采用修改重錘打擊法即Allen’s法構(gòu)建脊髓中度挫傷模型：下端直徑2 mm的10 g重錘自50 mm高度落體。術(shù)后用生理鹽水沖洗脊髓，消毒切口周圍，完全縫合切口。術(shù)后7 d內(nèi)，腹腔注射適量青霉素以預(yù)防小鼠全身感染。術(shù)后每天輕柔、擠壓膀胱三次，直到小鼠恢復(fù)自主正常排尿。Metformin組于術(shù)后2 h腹腔注射二甲雙胍50 mg/(kg·d) 進(jìn)行干預(yù)，每天一次，持續(xù)一周。Sham組和SCI組注射等量的生理鹽水。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)

各組隨機(jī)選取7 只造模小鼠，分別在手術(shù)前(0 d)，手術(shù)后第1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d 及28 d，采用 BMS(Basso Mouse Scale)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估。0 分為“無踝關(guān)節(jié)活動(dòng)”，9 分為功能正常。根據(jù)每組小鼠的平均得分繪制一個(gè)折線圖，據(jù)此來觀察和比較不同處理組對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)狀況。

1.4 免疫印跡

術(shù)后7 d，隨機(jī)取各組3只小鼠處死，收集以損傷點(diǎn)為中心上下各0.5 cm的小鼠脊髓組織。將組織用組織剪切成小塊，然后使用超聲振動(dòng)儀充分破碎，使蛋白質(zhì)充分溶解在RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解緩沖液中。測(cè)定蛋白樣品濃度后制備樣品，在95℃加熱5 min使蛋白質(zhì)變性穩(wěn)定。在聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中每孔分別加入40 μg的等量蛋白質(zhì)樣品，電泳完畢后通過轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF[Poly(vinylidene fluoride)]膜上，然后充分浸沒于封閉液(5%脫脂奶粉)，室溫?fù)u床孵育封閉2 h。洗滌三次后，應(yīng)用兔抗IL-6抗體(1∶1000), 兔抗mTOR抗體(1∶1000),小鼠抗GAPDH抗體(1∶1000)于4℃孵育過夜。第二日，將洗滌后的PVDF膜應(yīng)用HRP(Horse radish peroxidase)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶10 000)以及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶10 000)室溫?fù)u床上孵育2 h，再次充分洗滌后，在凝膠成像系統(tǒng)上顯影。

1.5 免疫組化染色檢測(cè)

隨機(jī)取各組3只小鼠麻醉、灌流、固定后，提取以T10脊髓損傷處為中心上下各0.25 cm的脊髓組織，切成厚度為10 μm冰凍組織切片。將各組切片置于室溫充分晾干后，用3 %過氧化氫孵育30 min以達(dá)到充分滅活組織內(nèi)內(nèi)源性過氧化物酶的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。?yīng)用正常山羊血清封閉非特異性抗原2 h后，滴加兔抗IL-6抗體(1:200)或兔抗mTOR抗體(1∶100)，4℃冰箱過夜后，PBS充分洗滌3次，每次5 min滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶100) 37℃恒溫孵育60 min。加入DAB(diaminobezidin)-過氧化氫顯色液，待顯微鏡下觀察到室溫顯色充分后立即漂洗。采用蘇木素復(fù)染，按70%、80%、95%、100%乙醇逐級(jí)脫水2次，每次5 min，二甲苯透明20 min，中性樹膠封片，擠壓蓋玻片以防氣泡產(chǎn)生。于顯微鏡下觀察目的蛋白的表達(dá)，染色陽性的組織/細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍治療可促進(jìn)脊髓損傷小鼠功能恢復(fù)

3組小鼠在脊髓損傷前BMS評(píng)分均為9.00分；脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)SCI組和Metformin組小鼠BMS評(píng)分均明顯小于Sham組，BMS評(píng)分在1～28 d內(nèi)呈明顯升高趨勢(shì)。脊髓損傷后7 d 起，Metformin組小鼠BMS高于SCI組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。提示二甲雙胍促進(jìn)脊髓損傷小鼠功能恢復(fù)(表1)。

表1 各組小鼠的行為學(xué)評(píng)分

2.2 二甲雙胍治療抑制mTOR表達(dá)

在各組行為學(xué)評(píng)分出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后二甲雙胍治療第7 d)，行免疫印跡及免疫組化實(shí)驗(yàn)。免疫印跡結(jié)果顯示，與Sham組相比，SCI組及Metformin組小鼠脊髓mTOR蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)；與SCI組相比，Metformin組小鼠mTOR蛋白的表達(dá)也明顯降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示，mTOR蛋白染色陽性顆粒呈棕褐色，主要位于神經(jīng)元中，Sham組小鼠mTOR蛋白的表達(dá)量較高。與Sham組比較，SCI組及Metformin組小鼠損傷脊髓mTOR蛋白的表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SCI組相比，Metformin組小鼠mTOR蛋白的表達(dá)也明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示二甲雙胍促進(jìn)脊髓損傷后的自噬(圖1)。

圖1 二甲雙胍治療脊髓損傷小鼠的mTOR蛋白表達(dá)情況aP<0.05，與Sham組比較；bP<0.05，與SCI組比較

2.3 二甲雙胍治療抑制IL-6表達(dá)

在術(shù)后二甲雙胍治療第7 d，行免疫印跡及免疫組化實(shí)驗(yàn)。免疫印跡結(jié)果顯示，與Sham組相比，SCI組及Metformin組小鼠脊髓IL-6蛋白的表達(dá)升高(P<0.05)；與SCI組相比，Metformin組小鼠IL-6蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示，IL-6蛋白染色陽性顆粒呈棕褐色，主要位于小膠質(zhì)細(xì)胞中，Sham組小鼠損傷脊髓IL-6蛋白的表達(dá)量較低。與Sham組比較，SCI組小鼠損傷脊髓IL-6蛋白的表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SCI組相比，Metformin組小鼠IL-6蛋白的表達(dá)量也明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示二甲雙胍抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)(圖2)。

圖2 二甲雙胍治療脊髓損傷小鼠的IL-6蛋白表達(dá)情況aP<0.05，與Sham組比較；bP<0.05，與SCI組比較

3 討論

脊髓損傷是嚴(yán)重的中樞神經(jīng)創(chuàng)傷性疾病，常導(dǎo)致攜帶電信號(hào)的神經(jīng)根或有髓神經(jīng)束的重大損傷[9]。SCI包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷兩個(gè)病理過程，而后者在脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能恢復(fù)過程中起到更加重要的作用，多由炎癥反應(yīng)、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加、Ca2+過載與細(xì)胞自噬異常等因素引起[10-11]。而神經(jīng)細(xì)胞自噬的調(diào)控和脊髓微環(huán)境的炎癥應(yīng)答更是影響著脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)進(jìn)程及預(yù)后結(jié)局[12-13]。但是，目前靶向脊髓損傷病理過程的相關(guān)分子機(jī)制還沒有闡明。

自噬(autophagy)是細(xì)胞吞噬自身胞內(nèi)蛋白或細(xì)胞器，被囊泡包裹后降解其所包含內(nèi)容物的過程，通過這一降解過程以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要并進(jìn)行胞內(nèi)特定細(xì)胞器的更新[14]。此外，自噬也是細(xì)胞調(diào)節(jié)自身穩(wěn)態(tài)的重要病理的生理過程，不僅參與細(xì)胞死亡，還有細(xì)胞保護(hù)性作用[15]。自噬通路分為特異性自噬通路與非特異性自噬通路[16]，而mTOR 蛋白是自噬的一種特異性經(jīng)典蛋白，生理病理過程中抑制 mTOR 的活性，最終激活自噬，并促進(jìn)自噬小體的生成[17-20]。本研究表明，給予二甲雙胍可以明顯抑制mTOR的表達(dá)，激活神經(jīng)元自噬而促進(jìn)功能恢復(fù)。

自噬通過參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換在神經(jīng)元突觸形成過程中發(fā)揮著重要的作用，異常的自噬活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致突觸功能的失調(diào)[19]。生理?xiàng)l件下，突觸可保證神經(jīng)元有條不紊地接收傳遞儲(chǔ)存信息，是神經(jīng)環(huán)路的“樞紐”。同時(shí)，突觸結(jié)構(gòu)內(nèi)的廢物需及時(shí)清理才能維持正常的突觸功能，但這樣就會(huì)使得突觸結(jié)構(gòu)區(qū)域有著高耗能以及高蛋白更新率的狀態(tài)[21]。神經(jīng)炎癥導(dǎo)致的神經(jīng)元自噬形成不足，會(huì)造成許多蛋白降解的不完全和炎癥反應(yīng)過載反饋，常導(dǎo)致許多神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，如自閉癥、阿爾茲海默病和衰老等[21]。缺血后神經(jīng)炎癥通常被認(rèn)為是神經(jīng)功能的有害因素，并導(dǎo)致腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性退化[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞，負(fù)責(zé)清除死亡細(xì)胞及碎片，并與神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突觸的消除和維持有關(guān)[18]。當(dāng)被直接機(jī)械損傷等刺激觸發(fā)時(shí)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓病灶中表達(dá)高水平的IL-6，并造成神經(jīng)元的死亡[5]。研究證實(shí)，IL-6可以進(jìn)一步增強(qiáng)局灶微環(huán)境的炎癥水平，并加劇神經(jīng)元死亡和功能障礙[5]。盡管已經(jīng)有許多研究報(bào)道了自噬的激活和炎癥的抑制可以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的恢復(fù)，但到目前為止，在SCI 疾病中，炎癥和自噬的相關(guān)性還沒有闡明。

二甲雙胍是一種臨床應(yīng)用的降糖藥，已被證明可有效治療阿爾茲海默癥、腦中風(fēng)及心血管等多種疾病[22]。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還可以降低IL-6的表達(dá)，并促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)[8]。然而，二甲雙胍對(duì)脊髓損傷的自噬作用尚未確定。鑒于脊髓損傷的預(yù)后在很大程度上是由神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞主導(dǎo)的，并且二甲雙胍已被證明對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥激活具有抑制的作用?；谝陨涎芯炕A(chǔ)推測(cè)，脊髓損傷后二甲雙胍可能通過抑制炎癥促進(jìn)神經(jīng)元自噬和神經(jīng)功能恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)研究中，小鼠脊髓損傷后7 d mTOR表達(dá)下調(diào)和IL-6表達(dá)上調(diào)，可以說明，急性期炎癥和自噬參與了脊髓損傷的病理過程。術(shù)后腹腔注射二甲雙胍7 d后，BMS評(píng)分升高，mTOR和IL-6表達(dá)明顯下調(diào)，結(jié)果可知，二甲雙胍可以促進(jìn)自噬活動(dòng)和抑制神經(jīng)炎癥，進(jìn)而促進(jìn)脊髓損傷后小鼠運(yùn)動(dòng)功能的好轉(zhuǎn)。