肌動蛋白染色協(xié)助分析腸上皮增殖和分化的相對定量研究

張如珍，陳 勝，王鋒超，胡先成

(1．重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,重慶 401331；2．陸軍軍醫(yī)大學(xué) 軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系，重慶 400038)

0 引言

細(xì)胞骨架是一種相互連接的精細(xì)結(jié)構(gòu)，主要由肌動蛋白、微管和中間絲組成。其作為膜突出的支架，如微絨毛、纖毛和鞭毛[1]等調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)和生理活性。許多上皮細(xì)胞，如小腸上皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞具有大量微絨毛[2]。微絨毛數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常變化與生理功能有關(guān)，如分泌和吸收[3]。此外，肌動蛋白在很多關(guān)鍵的細(xì)胞進(jìn)程中起著重要作用，包括遷移、內(nèi)吞、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)和mRNA拼接、附著、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜皺褶和胞質(zhì)分裂等[4]，并且它在很大程度上決定了細(xì)胞的形狀以及細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器的位置和形狀[5]。在哺乳動物中，至少有6種肌動蛋白亞型由單獨(dú)的基因編碼，并根據(jù)其等電點(diǎn)分為α、β和γ 3類[6]。到目前為止，有關(guān)肌動蛋白的研究多集中在其結(jié)構(gòu)和功能上[7]，而缺乏利用肌動蛋白在不同細(xì)胞中的差異進(jìn)行形態(tài)學(xué)和定量學(xué)的分析。鑒于腸道上皮細(xì)胞獨(dú)特的細(xì)胞組分及結(jié)構(gòu)，本研究旨在通過對腸道隱窩-絨毛細(xì)胞β-Actin的免疫熒光染色、蛋白免疫印跡法、流式細(xì)胞檢測和細(xì)胞周期分析，以判斷β-Actin在不同腸道細(xì)胞中的表達(dá)量和表達(dá)模式，為利用β-Actin協(xié)助區(qū)分腸道增殖和分化細(xì)胞及細(xì)胞周期的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 小鼠和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠

C57BL/6J小鼠，雄性，8～10周齡12 只，體重25～30 g，購自成都集萃藥康生物科技公司。動物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，小鼠飼料喂養(yǎng)，自由食水，自然光暗周期，室溫22～25℃。本實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)過陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理學(xué)審核通過。

1.1.2 主要試劑和材料

Actin-Tracker Green-488(碧云天貨號C2201S)、PE anti-mouse CD24(BioLegend 貨號101808)、PE/Cy7 anti-mouse/human CD44(BioLegend 貨號103030)、FVD(invitrogen Firable Viability Dye 660 貨號65-0864-14)、 Alexa Fluor 647anti-mouse CD45(BioLegend 貨號103124)、DAPI(索萊寶)、β-Actin(beyotime 貨號：AA128-1)、Akt(beyotime 貨號：AA326-1)、PCNA(CST 貨號：2586T)、Goat anti-Mouse IgG(H+L)(聯(lián)科生物 貨號：GAM007)、Anti-rabbit IgG (CST 貨號：7074S)、BCA試劑(TakaRa 貨號：T9300A-1)、免疫印跡一抗稀釋液(Beyotime 貨號：P0023A)、Super ECL Plus Western Blotting Substrate(葆光生物 貨號：BG0001)、PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)(雅酶 貨號：PG112升級版)、 T-PERTMTissue Protein Extraction Reagent(Thermo 貨號：78510)、TrypLETMExpress(thermo 貨號：12604013)、中性甲醛(重慶川東化工)、多聚甲醛(thermo貨號305362)、EDTA(碧云天 貨號：ST066)、EGTA(國藥集團(tuán) 貨號10809717)、Trition X-100(索萊寶 貨號T8200)、防脫載玻片。

1.2 樣本制備

處死小鼠后取出小腸浸泡于盛有冰冷的PBS緩沖液培養(yǎng)皿中(置于冰上)，沖洗干凈腸內(nèi)殘余物，縱向剪開小腸，輕柔涮洗小腸內(nèi)壁，對折后剪取2 cm左右空腸，置入螯合液中(1×解離buffer：EDTA:EGTA 100∶1∶1)于4℃冰箱的在搖床上螯合40 min，而后用玻片刮取腸上皮，用1×PBS吹散，自然沉降，4℃冰箱存放。

1.3 熒光探針染色

將制備好的隱窩絨毛樣本使用10%中性甲醛常溫固定30 min，而后用1×PBS洗滌3次，自然沉降，而后用0.5%的Triton X-100常溫破膜2 h，后用1×PBS洗滌3次，自然沉降，而后用Actin-Tracker Green-488 (1∶200)探針室溫染色1h，1×PBS洗滌3次，滴加UEA(1∶100)孵育30 min，洗滌3次，防熒光淬滅劑混勻封片。

1.4 蛋白免疫印跡分析

將收集的隱窩和絨毛結(jié)構(gòu)用RIPA裂解液作用30 min，離心收集上清液，取出10 μL用BCA法進(jìn)行蛋白定量分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算樣品蛋白濃度，并將所有蛋白配制成等量關(guān)系，然后置于99℃的金屬浴中變性10 min，待蛋白冷至室溫后，以每孔18 μL的量加入準(zhǔn)備好的凝膠中進(jìn)行電泳(恒壓135 V)。之后采用三明治法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(恒流400 mA)，接著用5%脫脂奶粉封閉90 min，配制一抗(β-Actin 1∶5000、Akt 1∶1000、PCNA 1∶1000)在4℃下孵育過夜后用1× TBST洗滌3次，并室溫孵育二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L)1∶1000、 Anti-rabbit IgG 1∶1000)90 min，再用TBST洗滌3次，配制化學(xué)發(fā)光液(1∶1)上機(jī)進(jìn)行曝光分析。

1.5 流式分析

1.5.1 隱窩細(xì)胞表面標(biāo)記染色流式分析

將螯合結(jié)束的腸段通過震搖方式分離隱窩絨毛，并通過70 μm濾器過濾，將富集隱窩濾液放入預(yù)冷過的4℃離心機(jī)上700 rpm離心5 min，棄上清液，向隱窩沉淀中加入1 mL TryPLETM裂解液和250 μL的胰蛋白酶(4∶1)，在恒溫37℃金屬浴中將隱窩裂解成單細(xì)胞后終止裂解，1×PBS洗滌3次，1500 rpm離心5 min，100 μL液體重懸后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，分別加入PE Anti-mouse CD24(1∶200)、PE/Cy7 Anti-mouse/human(1∶100)、CD45(1∶1000)熒光抗體以及FVD(1∶500)熒光染料，充分混勻，冰上孵育30 min后洗滌3次，1500 rpm離心5 min，400 μL 1×PBS重懸上機(jī)。

1.5.2 隱窩細(xì)胞周期流式分析

如上法將制備好的單細(xì)胞懸液加入PE Anti-mouse CD24(1∶200)、FVD(1∶500)、CD45(1∶1000)冰上孵育30 min，而后1500 rpm離心5 min，加入400 μL 4% PFA冰上固定30 min，1500 rpm離心5 min，0.1% Triton X-100室溫破膜15 min，1500 rpm離心5 min加入DAPI原液400 μL室溫染色30 min，洗滌，離心后400 μL 1×PBS重懸后上機(jī)。

1.6 數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析

流式數(shù)據(jù)使用SonyMA900流式分析/分選儀進(jìn)行樣本分析，使用奧林巴斯顯微鏡進(jìn)行免疫熒光圖片采集。使用ImageJ對蛋白免疫印跡條帶進(jìn)行灰度值測定。使用FlowJoV10版本軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)處理，通過流式熒光參數(shù)進(jìn)行Actin定量分析。使用Image-Pro plus 6.0版本對熒光圖片進(jìn)行熒光定量分析，RGB模式選區(qū)，其通道閾值分別為R 0～255、G 14～255、B 0～255。通過SPSS 19.0版本進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，運(yùn)用Graphpad 8.0版本進(jìn)行統(tǒng)計圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 β-Actin 在隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)中的分布

β-Actin作為細(xì)胞骨架蛋白在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，為探究腸道絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)β-Actin分布及表達(dá)情況，將獲得的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)進(jìn)行免疫熒光染色(圖1A)，發(fā)現(xiàn)絨毛的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，隱窩的熒光強(qiáng)度相對較弱。通過對其熒光密度進(jìn)行量化統(tǒng)計，結(jié)果表明隱窩和絨毛間β-Actin的表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)；為了進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果的可靠性，通過震搖方法分別富集高純度的隱窩細(xì)胞和絨毛結(jié)構(gòu)(圖1B)，并進(jìn)行蛋白免疫印跡分析(圖1C)，結(jié)果同樣表明隱窩和絨毛間β-Actin表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)，即絨毛β-Actin表達(dá)量約是隱窩的1.74倍。

圖1 β-Actin在隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)中的表達(dá)A：小鼠隱窩-絨毛免疫熒光染色，熒光密度定量(P<0.05 T-test(scale bar= 50μm)；B：小鼠隱窩和絨毛結(jié)構(gòu)；C：小鼠隱窩-絨毛免疫印跡結(jié)果，β-Actin密度定量(P<0.05 T-test)

2.2 UEA染色分析增殖細(xì)胞和非增殖細(xì)胞β-Actin的表達(dá)

鑒于隱窩復(fù)雜的細(xì)胞組分及隱窩各細(xì)胞不同的功能，存在處于增殖和非增殖兩種狀態(tài)的細(xì)胞，腸道β-Actin蛋白主要參與腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和遷徙。為了探究隱窩底部細(xì)胞β-Actin表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)隱窩底部干細(xì)胞龕中存在一群高密度熒光細(xì)胞群(圖2A)，為進(jìn)一步探究其是否具有增殖能力，我們進(jìn)行了荊豆凝集素(Ulex Europaeus Agglutinin, UEA)染色，一種分泌系細(xì)胞如潘氏細(xì)胞(Paneth cells PC)、內(nèi)分泌細(xì)胞(Endocrine cells EEC)和杯狀細(xì)胞(Goblet cell GC)等染料，以區(qū)分干細(xì)胞龕增殖與非增殖細(xì)胞群。通過熒光強(qiáng)度曲線分析發(fā)現(xiàn)，隱窩底部紅色熒光區(qū)域可見綠色熒光相對較強(qiáng)，提示非增殖的細(xì)胞具有更高β-Actin蛋白的表達(dá)。

圖2 β-Actin在非增殖細(xì)胞中高表達(dá)(scale bar =50 μm)A：小鼠隱窩免疫熒光染色；B：非增殖細(xì)胞與β-Actin免疫熒光共染

2.3 β-Actin 在隱窩和絨毛細(xì)胞表達(dá)的流式細(xì)胞分析

為了進(jìn)一步定量隱窩-絨毛細(xì)胞β-Actin表達(dá)情況，選擇流式細(xì)胞技術(shù)對隱窩和絨毛進(jìn)行定量分析。通過分別制備絨毛、隱窩細(xì)胞單細(xì)胞懸液，在保證染色條件相同前提下，經(jīng)過β-Actin熒光探針染色后通過流式細(xì)胞技術(shù)對隱窩和絨毛細(xì)胞進(jìn)行熒光定量分析，如圖3A所示，隱窩細(xì)胞熒光跨度較大，提示隱窩細(xì)胞中各細(xì)胞成分之間存在增殖、分化及功能上的較大差異。作為分化后的絨毛細(xì)胞β-Actin表達(dá)相對集中，進(jìn)一步提示增殖細(xì)胞相較于非增殖細(xì)胞的低表達(dá)β-Actin的結(jié)論。但就細(xì)胞的平均表達(dá)量而言(圖3B)，絨毛細(xì)胞β-Actin表達(dá)量是隱窩細(xì)胞均值的1.46倍，這種差異性提示β-Actin作為整個腸上皮蛋白內(nèi)參的局限性[8]，同時，也可為內(nèi)參校正提供參考。

圖3 β-Actin蛋白在絨毛細(xì)胞和隱窩細(xì)胞表達(dá)比較A：隱窩和絨毛細(xì)胞的熒光密度峰圖；B：隱窩和絨毛細(xì)胞熒光密度定量圖(流式熒光定量分析 *P<0.05 T-test)

2.4 CD24表面標(biāo)記區(qū)分下的各譜系細(xì)胞β-Actin表達(dá)的流式分析

隱窩細(xì)胞成分包含干細(xì)胞、前體細(xì)胞和分化后細(xì)胞，通過CD24表面標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)隱窩細(xì)胞成分的區(qū)分[9]，如圖4A所示。通過SSC-A和CD24流式參數(shù)將隱窩細(xì)胞分為潘氏細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、增殖細(xì)胞以及其他分化細(xì)胞，通過對其熒光定量分析發(fā)現(xiàn)(圖4B、4C)各細(xì)胞系間存在β-Actin表達(dá)上的差異，其中Paneth細(xì)胞β-Actin表達(dá)量分別是內(nèi)分泌細(xì)胞的1.46倍、增殖細(xì)胞的2.49倍，與成像結(jié)果非增殖細(xì)胞表達(dá)較高相一致，而內(nèi)分泌細(xì)胞是增殖細(xì)胞的1.7倍，這些結(jié)果提示，β-Actin蛋白在分化后分泌細(xì)胞中具有更高表達(dá)量，可能參與了細(xì)胞分化和相關(guān)功能的執(zhí)行。

圖4 β-Actin在增殖細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、Paneth細(xì)胞中表達(dá)情況A：隱窩細(xì)胞CD24染色細(xì)胞分群(Progenitor cells, Pro Cells)；B：隱窩細(xì)胞β-Actin表達(dá)熒光峰圖；C：隱窩細(xì)胞β-Actin表達(dá)熒光定量分析柱狀圖(流式熒光定量分析 *P<0.05 T-test)

2.5 β-Actin表達(dá)與細(xì)胞周期的關(guān)系

腸道隱窩細(xì)胞是一群快速增殖的細(xì)胞，干細(xì)胞分化后通過TA(transient amplifying)區(qū)域快速擴(kuò)增來確保絨毛細(xì)胞的更新?lián)Q代。這種快速的增殖和遷徙勢以及分化勢必會引起細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)變化，為探究隱窩細(xì)胞β-Actin與細(xì)胞周期的關(guān)系，對不同β-Actin表達(dá)的細(xì)胞群進(jìn)行周期分析。如圖5A所示，隱窩細(xì)胞呈現(xiàn)出不同β-Actin表達(dá)量的細(xì)胞群，通過β-Actin-H和β-Actin-L細(xì)胞群周期分析發(fā)現(xiàn)(圖5B、5C)，β-Actin-H細(xì)胞主要處于G0/G1期，約占整個細(xì)胞群80%以上，與β-Actin-L細(xì)胞群(約占整個細(xì)胞群的50%～60%)具有顯著差異，這種周期上的差異表明，β-Actin在細(xì)胞增殖過程中為維持自身骨架重構(gòu)的流動性而處于相對低表達(dá)狀態(tài)，一旦細(xì)胞停止增殖走向分化，將伴隨骨架蛋白的表達(dá)增高，以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的發(fā)揮。

圖5 隱窩細(xì)胞β-Actin表達(dá)水平不同的細(xì)胞的細(xì)胞周期分析A：隱窩細(xì)胞鬼筆環(huán)肽染色后細(xì)胞分群；B、C：不同β-Actin表達(dá)水平細(xì)胞的細(xì)胞周期分析(*P<0.05 T-test)

3 討論

腸道是哺乳動物重要的消化、吸收、排泄、免疫和內(nèi)分泌器官，腸道上皮的更新依靠位于隱窩底部腸道干細(xì)胞的增殖分化來實(shí)現(xiàn)[10]。腸道干細(xì)胞擴(kuò)增后通過向上遷移至絨毛頂端最后脫落至腸腔，在3～5天內(nèi)完成腸上皮細(xì)胞的一次更新過程[11]。腸道干細(xì)胞關(guān)鍵細(xì)胞事件離不開細(xì)胞骨架的作用。細(xì)胞骨架是細(xì)胞在分裂、生長和發(fā)育過程中發(fā)生變化的動態(tài)結(jié)構(gòu)[12]。肌動蛋白絲、微管和中間絲是哺乳動物細(xì)胞骨架的主要成分。肌動蛋白絲代表在分化過程中經(jīng)歷廣泛重塑的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，是負(fù)責(zé)細(xì)胞剛度和韌性的細(xì)胞骨架的主要組成部分[13]。

本研究免疫熒光染色結(jié)果顯示，隱窩β-Actin的表達(dá)量低于絨毛的，與蛋白免疫印跡結(jié)果一致。原因可能為處于未分化狀態(tài)的細(xì)胞形態(tài)需要處于一個動態(tài)變化的過程，以適應(yīng)關(guān)鍵細(xì)胞增殖和分化進(jìn)程的發(fā)生；此時肌動蛋白絲處于解聚狀態(tài)，在細(xì)胞中形成不連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，故增殖細(xì)胞中β-Actin的表達(dá)量低于分化細(xì)胞的[14]。另外，通過隱窩細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，隱窩底部Paneth細(xì)胞β-Actin的表達(dá)量較其他隱窩細(xì)胞高，揭示了處于高度活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞其β-Actin的表達(dá)量最低。研究表明，動物細(xì)胞在進(jìn)行胞質(zhì)分裂事件，即處于中后期時，肌動蛋白絲開始聚集在細(xì)胞質(zhì)中各細(xì)胞器的周圍并參與形成中央紡錘體及收縮環(huán)，相互間形成豐富的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以完成最后的胞質(zhì)分裂事件[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象：流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示，大部分處于G0/G1期的細(xì)胞和少量G2/M期的細(xì)胞，β-Actin的熒光密度較強(qiáng)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。這些結(jié)果提示在整個細(xì)胞周期中，處于活躍的細(xì)胞分裂時期，細(xì)胞形態(tài)的變化較大，故需要相關(guān)骨架蛋白成分發(fā)生較大的變動使細(xì)胞骨架陣列的重排，來滿足細(xì)胞分裂所需的形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞極化[15-16]。

本研究完成了對隱窩-絨毛細(xì)胞群β-Actin相對定量分析，測量出隱窩-絨毛細(xì)胞的β-Actin平均表達(dá)量差異比值，這一結(jié)果可為β-Actin作為內(nèi)參蛋白在研究絨毛-隱窩蛋白表達(dá)量時提供校正依據(jù)。同時，利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步分析腸道各細(xì)胞群包括前體細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞的β-Actin蛋白表達(dá)相對定量值，揭示了腸道隱窩細(xì)胞群β-Actin蛋白表達(dá)上的差異，而這種差異致使在選用β-Actin蛋白作為內(nèi)參時不可避免的產(chǎn)生誤差，因?yàn)樵谀承┠Ｐ秃图膊l件下隱窩細(xì)胞成分是存在差異的[17]，即使不同腸段細(xì)胞成分占比也存在明顯差異[18]，而本文相對定量研究結(jié)果可為研究小腸上皮隱窩細(xì)胞β-Actin蛋白作為內(nèi)參提供校正加權(quán)值。另外，在β-Actin與周期分析中揭示了β-Actin的表達(dá)可能與細(xì)胞的增殖活性有關(guān)，處于高度增殖活性的細(xì)胞，其細(xì)胞骨架處于一個高度動態(tài)重組狀態(tài)，以適應(yīng)細(xì)胞形態(tài)變化，并完成細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵細(xì)胞進(jìn)程。同時，也提示當(dāng)細(xì)胞退出細(xì)胞周期可能需要β-Actin蛋白來穩(wěn)定細(xì)胞骨架參與隱窩細(xì)胞終末分化。鑒于這一結(jié)果，肌動蛋白染色和定量分析在一定程度上可以作為一種標(biāo)記來協(xié)助對腸上皮細(xì)胞增殖和分化狀態(tài)進(jìn)行區(qū)分，甚至可以結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)，測算隱窩細(xì)胞中成熟分泌系細(xì)胞的比例，這都為研究腸上皮增殖和分化機(jī)制以及相關(guān)疾病模型提供了新的方法。接下來，我們將把注意力集中在β-Actin蛋白和骨架調(diào)控在腸干細(xì)胞和前體細(xì)胞分化中的具體作用上，為了解腸上皮組織再生和癌癥發(fā)生等病理現(xiàn)象提供新的數(shù)據(jù)。