基于UF1000i尿沉渣分析儀對(duì)Clinitek Atlas尿干化學(xué)分析儀白細(xì)胞計(jì)數(shù)與反射率的關(guān)系研究及思考

張洪波,張 輝,黃 銘,陳 星，李 果

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430030）

根據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》質(zhì)量要求（簡(jiǎn)稱(chēng)ISO15189）[1-2]，實(shí)驗(yàn)室需要每年兩次對(duì)尿液化學(xué)試紙分析儀進(jìn)行設(shè)備校準(zhǔn)，就像尿沉渣分析儀一樣，以符合中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）的要求[3]。校準(zhǔn)完成后，需要進(jìn)行校準(zhǔn)驗(yàn)證，通常校準(zhǔn)由授權(quán)的主管工程師進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室人員可以完成校準(zhǔn)驗(yàn)證。針對(duì)尿干化學(xué)分析儀而言，因其為定性導(dǎo)致其校準(zhǔn)存在著一定的盲區(qū)，細(xì)節(jié)上也不符合質(zhì)量體系的要求，迫切需要尿干化學(xué)分析儀由定性向定量方向發(fā)展，因此以本文此前一篇紅細(xì)胞和反射率的研究為基礎(chǔ)，驗(yàn)證了白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC 計(jì)數(shù))與其反射率之間的關(guān)系，解析出其定量關(guān)系曲線(xiàn)，逐步驗(yàn)證了尿干化學(xué)分析儀定量的可行性，從而有助于優(yōu)化尿干化學(xué)分析儀的校準(zhǔn)流程，也為尿干化學(xué)分析儀各指標(biāo)定量化進(jìn)程奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 UF1000i 尿沉渣分析儀白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞1 000/μl，配以人工鏡檢確認(rèn)，無(wú)上皮細(xì)胞，無(wú)結(jié)晶黏液絲干擾，其它結(jié)果無(wú)異常的尿標(biāo)本。

1.2 儀器和試劑 UF1000i 尿沉渣分析儀（日本）及其原裝配套試劑；西門(mén)子Clinitek Atlas 自動(dòng)尿液化學(xué)分析儀（ 德國(guó) ）及其配套試劑，室內(nèi)質(zhì)控采用伯樂(lè)的尿干化學(xué)質(zhì)控品。湖北省室間質(zhì)評(píng)、衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)、以及2020年進(jìn)行的美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果合格。

1.3 方法

1.3.1 獲得合格的尿標(biāo)本，在200×g 離心5 min，輕輕吸棄上清尿液，加入生理鹽水洗滌，再在200×g 離心5 min，輕輕吸棄上清液，再加入生理鹽水，再離心棄上清，反復(fù)3 次。

1.3.2 將洗滌好的標(biāo)本加生理鹽水配制成10 ml 的樣本備用，樣本分別在Clinitek Atlas 自動(dòng)尿液化學(xué)分析儀和UF1000i 尿沉渣分析儀上檢測(cè)，然后補(bǔ)足生理鹽水至10 ml，再檢測(cè)，重復(fù)上述過(guò)程，直至尿干化學(xué)檢測(cè)白細(xì)胞脂酶（Leucocyte 1lipase, LEU）為陰性為止。尿干化學(xué)分析儀完成一次檢測(cè)需要0.6 ml 樣本，尿沉渣分析儀完成一次檢測(cè)需要0.8 ml樣本，即對(duì)樣本進(jìn)行等比稀釋?zhuān)╭=0.86）的連續(xù)檢測(cè)。1.3.3 配制好的標(biāo)本需要在1h 內(nèi)完成標(biāo)本的檢測(cè)[4-5]，記錄干化學(xué)白細(xì)胞反射率的值和尿沉渣對(duì)應(yīng)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPadPrism8 統(tǒng)計(jì)分析程序確定白細(xì)胞計(jì)數(shù)與反射率之間的關(guān)系，并通過(guò)KAPPA 檢驗(yàn)確定WBC 定性分級(jí)的反射率臨界點(diǎn)(即陰性、微量和1+，2+，3+對(duì)應(yīng)的反射率臨界值）。

2 結(jié)果

圖1 白細(xì)胞計(jì)數(shù)和反射率關(guān)系曲線(xiàn)圖

2.1 建立白細(xì)胞計(jì)數(shù)和反射率關(guān)系曲線(xiàn) 見(jiàn)圖1。按1.3 方法構(gòu)建白細(xì)胞計(jì)數(shù)(X)和反射率(Y)之間的關(guān)系。在上述分析的同時(shí)，對(duì)原始尿液樣本進(jìn)行Wright-Giemsa 染色后進(jìn)行分類(lèi)。在這份尿液標(biāo)本中，中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)的86%，淋巴細(xì)胞占5%，單核細(xì)胞占9%。由于UF1000i 檢測(cè)的是所有的白細(xì)胞，而干化學(xué)檢測(cè)的僅為中性粒細(xì)胞，所以對(duì)上述曲線(xiàn)進(jìn)行了修正，修正后的關(guān)系曲線(xiàn)為：Y=109.14ln(X)+931.94。

2.2 定性等級(jí)的反射率臨界點(diǎn)驗(yàn)證 見(jiàn)表1。與Clinitek Atlas 自動(dòng)尿液化學(xué)分析儀的濃度等級(jí)（陰性、微量、1+，2+，3+）相對(duì)應(yīng)的反射率臨界點(diǎn)取決于儀器的設(shè)定，此處我們只能通過(guò)驗(yàn)證的方式來(lái)獲取實(shí)際的濃度等級(jí)反射率臨界點(diǎn)。為此我們選擇了8 例患者標(biāo)本，共計(jì)測(cè)試187 條有效數(shù)據(jù)點(diǎn)，并結(jié)合Kappa 檢驗(yàn)，確定各等級(jí)的臨界反射率。

表1 臨界點(diǎn)反射率及Kappa 值統(tǒng)計(jì)表

2.3 基于反射率的白細(xì)胞臨界點(diǎn)驗(yàn)證 見(jiàn)表2。通過(guò)將臨界反射率值代入白細(xì)胞計(jì)數(shù)與反射率的關(guān)系曲線(xiàn)（即3.1 節(jié)得到的關(guān)系曲線(xiàn)），可以得到白細(xì)胞臨界點(diǎn)的驗(yàn)證濃度。

表2 反射率對(duì)應(yīng)的白細(xì)胞濃度（個(gè)/μl）

3 討論

3.1 選擇標(biāo)本 本實(shí)驗(yàn)在白細(xì)胞的制備上未能延續(xù)此前對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)采用的梯度濃度的方法[6]，是因?yàn)樵趯?duì)白細(xì)胞進(jìn)行鹽水洗滌時(shí)，細(xì)胞丟失不容易控制。因此，改進(jìn)采用了洗滌后等比稀釋的模式。也就是說(shuō)，對(duì)于10ml 制備好的標(biāo)本，完成尿干化學(xué)檢測(cè)需要0.6ml，尿沉渣檢測(cè)需要0.8ml，共計(jì)1.4 ml，一次檢測(cè)完成剩余8.6 ml，再補(bǔ)足生理鹽水至10ml，進(jìn)行下一次檢測(cè)，即整個(gè)過(guò)程采取以q=0.86 的等比稀釋模式。

同時(shí)，在選擇尿白細(xì)胞計(jì)數(shù)大于1 000/μl 的標(biāo)本時(shí)，瑞氏-吉姆薩染色鏡檢排除因退變或巨噬細(xì)胞較多時(shí)對(duì)中性脂酶檢測(cè)的影響，基于此門(mén)診標(biāo)本更合適，因?yàn)殚T(mén)診標(biāo)本急性感染的可能性較大，白細(xì)胞在尿路中停留時(shí)間相對(duì)較短，使溶解和變性的可能性降低。所以此次標(biāo)本主要來(lái)源于門(mén)診證實(shí)的尿路感染，但同時(shí)細(xì)菌感染也要被去除，特別是高上皮細(xì)胞標(biāo)本[7]，以排除上皮細(xì)胞的干擾。

在對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行離心洗滌時(shí)，應(yīng)采取低速離心（實(shí)際將離心力由400g 降為200g），以排除因高速離心對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行解聚洗滌時(shí)造成的白細(xì)胞破裂導(dǎo)致脂酶釋放（即離心力越高，解聚難度越大），整個(gè)過(guò)程對(duì)標(biāo)本的處理要輕，以避免白細(xì)胞被破壞導(dǎo)致中性脂肪酶溢出進(jìn)而影響尿液化學(xué)分析儀的檢測(cè)。

事實(shí)上，我們也使用過(guò)細(xì)胞分離方法來(lái)獲得高純度的中性粒細(xì)胞，如使用solarbio 和TBD 品牌的人外周血中性粒細(xì)胞分離液來(lái)分離全血細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞，但有其局限性。分離成功率不高，相同的分離條件分離全血的重復(fù)性不好，研究發(fā)現(xiàn)可能與全血的紅細(xì)胞平均體積有關(guān)：平均紅細(xì)胞體積越大，離心力越大，其他條件不變時(shí)分層效果越好。此外，即使分離中性粒細(xì)胞，如一些論文報(bào)道，分離液可以顯著分層細(xì)胞[8-9]，卻沒(méi)有適當(dāng)?shù)姆椒▽⒎蛛x層中的中性粒細(xì)胞有效的剝離（將中性粒細(xì)胞剝離出來(lái)又不帶淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞），因此本研究未采用全血白細(xì)胞分離法。

同時(shí)需要說(shuō)明的是，此處用UF1000i 替代金標(biāo)準(zhǔn)的手工方法來(lái)計(jì)數(shù)白細(xì)胞，是因?yàn)閁F1000i 尿沉渣分析儀的性能符合要求，同時(shí)其對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)手工方便快捷，最現(xiàn)實(shí)的問(wèn)題是尿干化學(xué)搭配尿沉渣對(duì)尿液進(jìn)行檢測(cè)符合日常實(shí)際工作流程[10-13]。

3.2 白細(xì)胞臨界值濃度的解釋 從表2 中，白細(xì)胞計(jì)數(shù)的臨界濃度驗(yàn)證與操作手冊(cè)中給出的值之間存在差異。這就需要我們對(duì)尿液化學(xué)試紙分析儀的校準(zhǔn)進(jìn)行反思。對(duì)于UF1000i 尿沉渣分析儀，每6 個(gè)月對(duì)設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)，在Clinitek Atlas 自動(dòng)化尿液化學(xué)分析儀的報(bào)告中只給出了每個(gè)指標(biāo)的校準(zhǔn)范圍，沒(méi)有給出標(biāo)準(zhǔn)濃度白細(xì)胞對(duì)應(yīng)的反射率值。如Clinitek Atlas 自動(dòng)尿液化學(xué)分析儀校準(zhǔn)報(bào)告所示，白細(xì)胞的反射率相對(duì)較寬，范圍為949 ～1 088，根據(jù)此范圍計(jì)算出WBC 反射率的變異系數(shù)約為2%，而中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YYT0475-2011 尿干化學(xué)分析儀第3.2 節(jié)描述的重復(fù)性表明，尿干化學(xué)分析儀反射率測(cè)試結(jié)果的變異系數(shù)，即CV值應(yīng)不大于1%[14-15]，從這個(gè)角度來(lái)講，此設(shè)備的校準(zhǔn)報(bào)告是不符合要求的。而白細(xì)胞計(jì)數(shù)和反射率曲線(xiàn)的建立，構(gòu)建修正后的關(guān)系曲線(xiàn)為：Y=109.14ln(X)+931.94，此關(guān)系曲線(xiàn)從計(jì)算方法上雖與先前報(bào)道的不同[16]，但方向一致同為對(duì)數(shù)曲線(xiàn)，這將有助于尿干化學(xué)分析儀由定性向定量方向改進(jìn)，再利用標(biāo)準(zhǔn)濃度的校準(zhǔn)品對(duì)設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)并能有力的彌補(bǔ)現(xiàn)行的尿干化學(xué)分析儀設(shè)備校準(zhǔn)環(huán)節(jié)的不足。

3.3 尿干化學(xué)分析儀在定量開(kāi)發(fā)中的優(yōu)勢(shì)

3.3.1 精細(xì)尿干化學(xué)分析儀的校準(zhǔn)：尿液化學(xué)分析儀向定量轉(zhuǎn)化后，檢測(cè)值可由間斷型向連續(xù)型轉(zhuǎn)化，以此有效彌補(bǔ)目前尿液化學(xué)分析儀在校準(zhǔn)過(guò)程中存在的不足，定量改進(jìn)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17]。同時(shí)設(shè)計(jì)出定量尿干化學(xué)分析儀的定值校準(zhǔn)品對(duì)設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)，猶如目前用定值校準(zhǔn)品對(duì)UF1000i 進(jìn)行校準(zhǔn)一樣，可以更容易檢測(cè)設(shè)備單元老化等問(wèn)題，從而更好地提醒工程師準(zhǔn)確調(diào)整激光單元的相關(guān)參數(shù)，將設(shè)備的狀態(tài)調(diào)整至最佳。

3.3.2 定量研發(fā)的邊際成本低：針對(duì)各尿干化學(xué)制造商而言，目前所要做的工作只需要將尿十項(xiàng)(隱血、白細(xì)胞、亞硝酸鹽、比重、pH、蛋白質(zhì)、葡萄糖、酮體、尿膽原、膽紅素)的關(guān)系曲線(xiàn)或者說(shuō)擬合曲線(xiàn)植入到設(shè)備中，再設(shè)計(jì)出相應(yīng)的可視化界面將各項(xiàng)目的檢測(cè)值呈現(xiàn)給客戶(hù)就好。尿干化學(xué)分析儀在近20年技術(shù)革新不明顯，不尋求改變?cè)谌招略庐惖慕裉煊斜皇袌?chǎng)淘汰的風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)在設(shè)備生產(chǎn)商只需要對(duì)設(shè)備軟件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，給用戶(hù)提供以反射率為基礎(chǔ)的定量服務(wù)，在幾乎不需要投入新的研發(fā)成本的基礎(chǔ)上就能給用戶(hù)新的價(jià)值的體驗(yàn)。

3.3.3 臨床需求：定量改進(jìn)能更準(zhǔn)確地反映病人的病情，在對(duì)醫(yī)生對(duì)尿常規(guī)的關(guān)注度調(diào)查中，當(dāng)問(wèn)及“參考尿常規(guī)在你的疾病領(lǐng)域的診斷中所占的比例是多少？”時(shí)，參考比例僅在0 ～25%之間，根本原因可能是尿常規(guī)給臨床提供的信息太少，目前尿干化學(xué)結(jié)果全部陰性對(duì)臨床意義更顯著，也就是特異度作用更顯著。從這個(gè)角度來(lái)看，尿液化學(xué)分析儀從定性到定量的發(fā)展也符合臨床需要,以充分發(fā)揮尿干化學(xué)的作用[18]。舉一個(gè)簡(jiǎn)單的例子，在白細(xì)胞定性結(jié)果同在3+時(shí)，如果做到了定量改進(jìn)，定量結(jié)果更能反映出患者病情的細(xì)微變化。

3.3.4 更及時(shí)的報(bào)告：關(guān)于報(bào)告的時(shí)間有效性，門(mén)診患者尿干化學(xué)分析的TAT 時(shí)間（turn around time）為40 min，本實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的尿生化TAT 時(shí)間為3h。尿干化學(xué)分析的定量改進(jìn)能將TAT 時(shí)間由3h縮短為40min。這對(duì)確診后治療監(jiān)測(cè)的患者是省時(shí)又經(jīng)濟(jì)的。

3.3.5 雙贏的局面：事實(shí)上按照3.3.3，設(shè)備制造商和用戶(hù)是雙贏的，設(shè)備制造商為用戶(hù)提供了一個(gè)可視化的定量界面，用戶(hù)可以以此為基礎(chǔ)在白細(xì)胞領(lǐng)域開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)指標(biāo)，用反射率定量檢測(cè)白細(xì)胞中性脂肪酶濃度，結(jié)合尿沉渣分析儀白細(xì)胞計(jì)數(shù)，我們可以得到一個(gè)新的檢測(cè)指標(biāo)：平均白細(xì)胞脂酶含量，這個(gè)指標(biāo)將有助于尿路感染的診斷，因?yàn)閺睦碚撋?，尿路感染?huì)使更多的白細(xì)胞吞噬細(xì)菌自溶、中性脂酶釋放，同時(shí)有形白細(xì)胞減少，從而使平均白細(xì)胞脂酶含量的值增加。這一理論的證實(shí)取決于設(shè)備制造商對(duì)設(shè)備的定量改進(jìn)。

基于上述，尿干化學(xué)分析儀應(yīng)在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，逐步向定量方向發(fā)展，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系發(fā)展的需要，以更好地為臨床服務(wù)。更重要的是，定量改進(jìn)對(duì)設(shè)備商、用戶(hù)及患者都是有益的。