耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌感染的臨床特征及耐藥機(jī)制研究

鄭 茂，陳宗耀，王登朝，鄒 玉

（德陽市人民醫(yī)院a. 檢驗(yàn)科；b. 輸血科，四川德陽 618000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種臨床常見的條件致病菌，可定植于人體皮膚、黏膜、腸道等部位，常引起肺部感染、尿路感染、血流感染等多種疾病，嚴(yán)重者可危及生命[1]。碳青霉烯類抗生素抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)，是目前臨床治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-lactamase，ESBLs）、頭孢菌素酶（cephalosporinase）等多重耐藥菌引起嚴(yán)重感染的一線用藥，由于抗生素選擇壓力，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CR-KP） 檢出率呈逐年上升態(tài)勢(shì)，給臨床抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)[2]。近年來，匯聚高毒力和高耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”-耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌（carbpenem-resistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）的出現(xiàn)，并導(dǎo)致多次嚴(yán)重醫(yī)院內(nèi)感染事件，更是引起全球公共衛(wèi)生的高度關(guān)注[3-4]。全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示[5]，肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率從2014年的4.8%，4.5%，快速上升至2019年的10.5%，10.9%，耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻。本研究旨在分析CR-KP 感染的臨床特征及耐藥機(jī)制，以期為臨床合理使用抗生素提供參考，更好地防治CR-KP 感染。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年1月～2020年12月從德陽市人民醫(yī)院住院患者各類臨床標(biāo)本中分離的CR-KP。菌株入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S30 關(guān)于CR-KP 的判定標(biāo)準(zhǔn)，即肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南、美羅培南或厄他培南任何一種抗生素耐藥；②同一患者首次分離株。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床資料缺失；②同一患者重復(fù)分離株；③菌株未能妥善保存。CR-KP 感染患者男性61 例，女性28 例，中位年齡60 歲（26 天～93 歲），回顧性調(diào)查患者的臨床資料，包括住院號(hào)、姓名、性別、年齡、科室、標(biāo)本類型、基礎(chǔ)疾病、侵入性操作、菌株檢出前2 周抗生素使用情況、是否并發(fā)其他細(xì)菌感染等。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)2020-04-016）。

1.2 儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）質(zhì)譜儀（德國(guó)布魯克公司），VITEK2 Compact 微生物鑒定系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司），ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）。細(xì)菌藥敏測(cè)試卡、E-test藥敏紙條（法國(guó)生物梅里埃公司），瓊脂平板（鄭州安圖生物公司），細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、Talent qPCR PreMix（北京天根公司）。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603（衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離及藥敏試驗(yàn)：按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第4 版）》要求進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，使用MALDI-TOF-MS 進(jìn)行菌株鑒定、VITEK2 Compact 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，頭孢他啶-阿維巴坦采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，K-B）作為補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)，依據(jù)CLSI M100-S30 標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏結(jié)果。所有CR-KP 均采用E-test 法對(duì)亞胺培南、美羅培南的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）進(jìn)行復(fù)核，確認(rèn)藥敏為碳青霉烯類耐藥。

1.3.2 碳青霉烯酶基因及毒力基因檢測(cè)：復(fù)蘇菌株接種于血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16 ～20 h，次日分離出單個(gè)菌落，按照試劑盒說明書提取CR-KP 基因組DNA，參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)引物，由上海生工公司合成，引物序列見表1。使用SYBR Green 染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）檢測(cè)常見碳青霉烯酶基因（blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM，blaOXA-48）和毒力基因（aerobaction）。PCR 反應(yīng)體系：Talent qPCR PreMix 10 μl，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μl，cDNA 2 μl，RNase-free ddH2O 6.8 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸32 s，40 個(gè)循環(huán)。待PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)整反應(yīng)基線至適宜處，以Ct＜35判定基因?yàn)殛栃员磉_(dá)。

1.3.3 CR-KP 高黏性表型判斷：將CR-KP 接種于血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16 ～20 h，用接種環(huán)輕柔向上挑起單個(gè)菌落，重復(fù)2 次，若挑起的黏液絲長(zhǎng)度≥5 mm，即拉絲試驗(yàn)陽性，稱菌株為高黏性表型。1.3.4 CR-KP 高毒力株篩選：參照文獻(xiàn)[7-8]將毒力基因（aerobactin）和拉絲試驗(yàn)同時(shí)陽性，作為判斷高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP）的標(biāo)志，從CR-KP 中篩選出高毒力株，即CR-hvKP。

表1 real-time PCR 引物序列表

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、WHONTE5.6 軟件進(jìn)行藥敏分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，危險(xiǎn)因素采用logistic 回歸分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CR-KP 檢出變化趨勢(shì) 2016 ～2020年總計(jì)分離出2 562 株肺炎克雷伯菌，其中89 株CR-KP 占比3.47%。歷年檢出的CR-KP 株數(shù)分別為7，13，22，17 和30，在肺炎克雷伯菌中占比分別為1.59%，2.64%，3.58%，3.78%和4.87%，總體上呈逐年上升趨勢(shì)。

2.2 CR-KP 來源科室及標(biāo)本類型分布 見表2。CRKP 主要來源于ICU（17.98%，16/89）、感染科（14.61%，13/89）、腫瘤科（14.61%，13/89）；標(biāo)本類型主要為痰液（50.56%，45/89）、尿液（15.73%，14/89）、膿液（12.36%，11/89）。

表2 CR-KP 來源科室及標(biāo)本類型分布（n=89）

2.3 CR-KP 對(duì)常用抗生素的藥敏情況 見表3。CR-KP 對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類、單環(huán)類等抗生素普遍耐藥，耐藥率均＞70%。CR-KP 對(duì)氨基糖苷類阿米卡星、慶大霉素耐藥率相對(duì)較低，分別為28.54%，39.33%。CR-KP 對(duì)新型β 內(nèi)酰胺類復(fù)合制劑頭孢他啶-阿維巴坦和脂肽類黏菌素耐藥率低，分別為14.61%，7.87%。

2.4 CR-KP 碳青霉烯酶基因攜帶情況 總計(jì)有70株CR-KP 檢出碳青霉烯酶基因陽性表達(dá)，檢出率為78.65%（70/89），包括56 株攜帶blaKPC，10 株攜帶blaNDM，3 株攜帶blaIMP和2 株攜帶blaVIM，其中1 株同時(shí)攜帶blaKPC和blaNDM。本研究未檢出blaOXA-48陽性表達(dá)。

表3 CR-KP 對(duì)常用抗生素的藥敏情況 [n (%)]

2.5 CR-KP 中高毒力株檢出情況及感染危險(xiǎn)因素比較 見表4。從CR-KP 中篩選出16 株CR-hvKP（17.98%，16/89），將CR-KP 感染患者分為高毒力株感染組（CR-hvKP 組）和非高毒力株感染組（CR-cKP 組）。單因素分析表明，年齡≥60歲、糖尿病、肝膽疾病、機(jī)械通氣、留置導(dǎo)管、入住ICU 等共6 個(gè)因素，在CR-hvKP 組和CRcKP 組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2或Fisher=4.973 ～19.377，均P＜0.05）。

表4 CR-hvKP 組和CR-cKP 組的危險(xiǎn)因素比較 [n (%)]

2.6 CR-hvKP 感染的多因素logistic 回歸分析 見表5。將2.5 中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的6 個(gè)變量進(jìn)一步納入多因素logistic 回歸分析，結(jié)果顯示在CRKP 感染患者中，糖尿病（OR=10.947，95%CI：1.751 ～68.424，P=0.010）、入住ICU（OR=16.012，95%CI：2.589 ～99.036，P=0.003）是CR-hvKP 感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表5 CR-hvKP 感染的多因素logistic 回歸分析

3 討論

肺炎克雷伯菌是中國(guó)臨床分離率常居第二位的革蘭陰性菌，也是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，其耐藥日益嚴(yán)重，尤其是CR-KP 感染不斷涌現(xiàn)，使得臨床治療面臨巨大困境[9]。研究顯示患者感染CR-KP后通常造成治療失敗、住院時(shí)間延長(zhǎng)、死亡率升高等，特別是與血流感染、入住ICU 或接受器官移植相關(guān)的死亡率明顯升高[10]。因此，CR-KP 長(zhǎng)期以來都是醫(yī)院內(nèi)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。

本研究中CR-KP 在肺炎克雷伯菌中占比呈逐年上升趨勢(shì)，2020年達(dá)到4.87%，縱然該數(shù)據(jù)尚低于全國(guó)水平（10.9%），但仍明顯高于許多省份，如山西、廣西、海南等[9]，故需高度警惕肺炎克雷伯菌的泛耐藥傳播。CR-KP 首要來源于ICU，這與諸多因素有關(guān)。ICU 患者常具有多種基礎(chǔ)疾病、免疫力低下、住院時(shí)間長(zhǎng)，加之大量廣譜抗生素的使用，更是增加了CR-KP 感染的機(jī)會(huì)。LI 等[11]報(bào)道的一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)4年追蹤研究證實(shí)，通過綜合的感染預(yù)防及控制措施，可以使ICU 獲得性CR-KP 定植或感染顯著減少。因此，加強(qiáng)對(duì)重癥患者的病原微生物送檢，能盡早發(fā)現(xiàn)CR-KP 感染并進(jìn)行相應(yīng)治療，降低并發(fā)癥發(fā)生。另外，兒科檢出的CR-KP 占比高達(dá)13.48%，且在新生兒中更常見，但嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育尚不完善，藥物使用禁忌多，造成可選的抗生素種類極少。鄧文喻等[12]報(bào)道2015 ～2018年廣東省某婦幼保健院嬰幼兒呼吸道感染分離的肺炎克雷伯菌，對(duì)亞胺培南的耐藥率從4.35%上升至19.15%，增長(zhǎng)趨勢(shì)十分明顯，這說明減少兒科患者的廣譜抗生素使用率已十分必要，或有助于降低其分離的肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥性。

本研究發(fā)現(xiàn)CR-KP 對(duì)氨基糖苷類耐藥率相對(duì)較低，對(duì)頭孢他啶-阿維巴坦、黏菌素耐藥率則更低。臨床治療CR-KP 感染時(shí)，可經(jīng)驗(yàn)性優(yōu)選慶大霉素、阿米卡星、頭孢他啶-阿維巴坦等藥物，或根據(jù)藥敏結(jié)果合理選用抗生素。SHIELDS 等[13]報(bào)道對(duì)于CR-KP 引起的菌血癥，氨基糖苷類尤其是慶大霉素，具有不錯(cuò)的抗菌效果。然而，由于氨基糖苷類具有較明顯的耳毒性、腎毒性等不良反應(yīng)，兒科患者應(yīng)用受限。盡管CR-KP 對(duì)黏菌素耐藥率低，但臨床和PK-PD 數(shù)據(jù)證實(shí)黏菌素臨床療效有限，其應(yīng)與一個(gè)或多個(gè)其他抗生素聯(lián)合使用。食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration, FDA）于2015年批準(zhǔn)頭孢他啶-阿維巴坦用于治療泌尿系統(tǒng)和腹腔感染革蘭陰性桿菌的患者，CLSI M100 亦給出其參考折點(diǎn)，這為多重耐藥菌感染提供了治療依據(jù)。體外研究證實(shí)頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)攜帶blaKPC的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）具有較強(qiáng)抗菌活性，對(duì)攜帶blaNDM，blaIMP的CRE 抗菌活性較弱[14]。另外，對(duì)頭孢他啶、美羅培南和黏菌素耐藥，以及對(duì)多種藥物聯(lián)合應(yīng)用也耐藥的腸桿菌，頭孢他啶-阿維巴坦仍然具有高度的抗菌活性[15]。周琴等[16]對(duì)120株CR-KP 進(jìn)行抗菌分析證實(shí)頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥率僅為16.67%，與本研究結(jié)果接近。由此可見，頭孢他啶-阿維巴坦有望成為將來治療CR-KP 感染的一線用藥。

碳青霉烯酶按照Ambler 分類法則，可分為A，B，D 三類。A 類為絲氨酸碳青霉烯酶，編碼基因包括blaKPC，blaSME等，以blaKPC流行最常見、分布最廣泛；B 類為金屬β-內(nèi)酰胺酶，編碼基因包括blaNDM，blaIMP，blaVIM等，其中blaNDM自2009年印度首次發(fā)現(xiàn)后，現(xiàn)已在全球廣泛播散；D 類為苯唑西林酶，對(duì)碳青霉烯酶水解活性較低，編碼基因主要有blaOXA-48[17]。本研究中超過3/4 的CR-KP 檢出碳青霉烯酶基因陽性，主要為blaKPC，blaNDM，表明KPC 酶、NDM 酶是該院CR-KP 所流行的主要碳青霉烯酶，這與ZHANG 等[18-19]報(bào)道的全國(guó)調(diào)查數(shù)據(jù)一致。雖然KPC 酶是CR-KP 最常見的碳青霉烯酶，所幸該類酶仍然可以被多種新型復(fù)合制劑所抑制，包括亞胺培南-瑞來巴坦、美羅培南-維博巴坦和頭孢他啶-阿維巴坦等[20]。

hvKP 是肺炎克雷伯菌的新變種，攜帶多種毒力基因，致病力強(qiáng)，能引起肝膿腫、眼內(nèi)炎、腦膜炎等侵襲性感染，其在平板上生長(zhǎng)菌落常呈高黏液性，可通過拉絲試驗(yàn)驗(yàn)證，但目前仍缺乏有效的表型確證試驗(yàn)[21]。鐵載體是細(xì)菌在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖不可或缺的條件，RUSSO 等[22-23]報(bào)道aerobaction是hvKP 最重要的鐵載體，也是介導(dǎo)毒力的關(guān)鍵因子。既往研究常將攜帶aerobaction 基因的肺炎克雷伯菌定義為hvKP[7,24]，故本研究以aerobactin 基因和拉絲試驗(yàn)同時(shí)陽性，從CR-KP 中篩選出CRhvKP。以往多重耐藥菌幾乎都不是高毒力，但CRhvKP 兼具高毒力和高耐藥表型，儼然是一種“超級(jí)細(xì)菌”，對(duì)于重癥患者而言很可能是致命的。研究顯示CR-hvKP 感染臨床治愈率低，傳播性強(qiáng)，明確相關(guān)危險(xiǎn)因素是做好預(yù)防控制措施的關(guān)鍵[25]。本研究發(fā)現(xiàn)在CR-KP 感染患者中，糖尿病、入住ICU 是CR-hvKP 感染的重要危險(xiǎn)因素。中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)（NETs）能夠以非共價(jià)形式結(jié)合多種抗菌成分，捕獲和殺滅病原微生物，是hvKP 主要的抗菌防御機(jī)制。JIN 等[26]報(bào)道糖尿病患者的NETs 結(jié)構(gòu)表面存在損傷，而這種NETs 殺菌缺陷很可能是導(dǎo)致糖尿病患者易感CR-hvKP 的機(jī)制。ICU患者大都病情較重，接受侵入性操作多，這無疑增加了感染的機(jī)會(huì)，故CR-hvKP 引起的嚴(yán)重院內(nèi)感染也常集中發(fā)生在ICU[3-4,27]。CR-hvKP 感染并非無藥可用，YU 等[28]報(bào)道頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)其依然具有較強(qiáng)抗菌活性（MIC90 ≤1 μg/ml），這可能是治療CR-hvKP 感染的理想選擇。

綜上所述，細(xì)菌耐藥已成為威脅公共衛(wèi)生的世界性難題，尤以CR-KP 呈全球流行趨勢(shì)頗為嚴(yán)峻。當(dāng)前形勢(shì)下，多模式、多學(xué)科的感染控制策略，規(guī)范化抗感染治療，嚴(yán)格的抗菌藥物管理，對(duì)遏制CR-KP 的傳播至關(guān)重要。