子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miR-455和FABP4表達(dá)水平及臨床意義

張 璇，趙愛琴，鄒 丹，陸海英，周素芳，王曉慶

（蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇蘇州 215000 ）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）是生育年齡婦女常見良性疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常、性交痛、不孕不育等，好發(fā)于25 ～45 歲育齡女性，發(fā)病率為10%～15%，不孕率可達(dá)40%，嚴(yán)重影響婦女身心健康[1-2]。EMT 的發(fā)病機制尚不清楚，有多種因素參與EMT 的發(fā)病和進展過程[3-4]。微小核糖核酸（miRNA）為非編碼小分子RNA，與EMT 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，miR-455 為miRNA 的一種，研究表明，miR-455 可靶向抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9 表達(dá)，從而降低子宮內(nèi)膜的血管通透性[5-6]。脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）是一種脂肪細(xì)胞因子，研究表明，F(xiàn)ABP4 在子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系中有表達(dá)，參與調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲[7]。目前EMT 患者血清miR-455 與FABP4的水平變化尚缺乏研究，本研究回顧性分析EMT患者血清miR-455，F(xiàn)ABP4 的表達(dá)情況，探討miR-455，F(xiàn)ABP4 表達(dá)水平與EMT 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年6月～2021年3月蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的73 例EMT 患者作為觀察對象（EMT 組），年齡20 ～45（32.40±4.70）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合EMT 診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)腹腔鏡手術(shù)及病理檢測確診為EMT；②年齡＞18 歲，且月經(jīng)規(guī)律；③近3 個月內(nèi)未服用對子宮內(nèi)膜增殖有影響的藥物或激素類藥物；④患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①卵巢腫瘤、子宮腺肌病、多囊卵巢綜合征等疾病患者；②子宮發(fā)育異常者；③自身免疫系統(tǒng)疾病患者；④心、肝、肺、腎等重要臟器功能異常者。

根據(jù)美國生育協(xié)會修訂EMT 評分標(biāo)準(zhǔn)分期，其中Ⅰ期患者29 例，Ⅱ期患者16 例，Ⅲ期患者15例，Ⅳ期患者13 例。

另選取同期女性健康體檢人員75 例作為對照組，所有體檢人員體檢無疾病，年齡21 ～47（32.60±5.00）歲。EMT 組與對照組平均年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

研究樣本采集均經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 人FABP4 ELISA 試劑盒（美國R&D 公司）；TRIzol 試劑[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒（日本TAKARA 公司）；miR-455 及U6 引物由上海生工生物工程公司設(shè)計與合成。ABI 7900 型qRTPCR 儀（美國ABI 公司），DU 640 紫外分光光度計（BECKMAN 公司），Multiskan MK3 型全自動酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystem 公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及保存：抽取兩組觀察對象空腹靜脈血5ml，室溫靜置30min，2 000r/min 離心15min，取上層血清，于-80℃冰箱保存。

1.3.2 qRT-PCR 檢測兩組血清miR-455 的表達(dá)：采用qRT-PCR 檢測兩組觀察對象血清miR-455 水平。TRIzol 試劑提取血清總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 的純度與濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板進行qRT-PCR 擴增?？偡磻?yīng)體系15μl，其中SYBR Green Mix 6μl，上下游引物各0.5μl，cDNA 2μl，ddH2O 6μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60s；95℃變性15s，65℃退火45s，72℃延伸30s，共35 個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3 個復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，以U6 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt分析法計算miR-455表達(dá)水平。miR-455上游引物序列：5’ GTGCCTTTGGACTACATC 3’，下游引物序列：5’GAACATGTCTGCGTATCTC 3’；U6 上游引物序列：5’ CTCGCTTCGGCAGCACA 3’，下游引物序列：5’AACGCTTCACGAATTTGCGT 3’。

1.3.3 ELISA 法檢測血清FABP4 水平：采用ELISA法檢測觀察對象血清FABP4，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；Pearson 法分析EMT 患者血清miR-455，F(xiàn)ABP4 表達(dá)水平相關(guān)性，ROC 曲線分析血清miR-455，F(xiàn)ABP4 表達(dá)對EMT 的診斷價值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組觀察對象血清miR-455，F(xiàn)ABP4 表達(dá)水平比較 與對照組比較，EMT 組患者血清FABP4 水平顯著升高（17.34±4.25 ng/ml vs 8.56±2.74 ng/ml），miR-455 水平顯著降低（0.67±0.08 vs 1.05±0.19），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.977， 15.780，均P＜0.05）。

2.2 不同分期EMT 患者血清miR-455，F(xiàn)ABP4 表達(dá)水平比較 隨著EMT 分期的升高，EMT Ⅰ～Ⅳ期患者血清FABP4 表達(dá)水平顯著升高（12.65±3.74ng/ml，16.43±4.54ng/ml，20.65± 4.04ng/ml，24.83±4.21ng/ml），血清miR-455 表達(dá)水平顯著降低（0.87±0.08，0.72±0.06，0.59±0.06，0.41±0.04），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.108，160.947，均P＜0.05）。

2.3 EMT 患者血清miR-455 與FABP4 相關(guān)性 見圖1。相關(guān)性分析顯示，EMT 患者血清miR-455 表達(dá)水平與FABP4 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.482，P＜0.05）。

2.4 血清miR-455，F(xiàn)ABP4 對EMT 的診斷價值 見圖2 和表1。血清miR-455 診斷EMT 的曲線下面積為0.879，截斷值為0.79，敏感度和特異度分別為83.56%，78.67%。血清FABP4 診斷EMT 的曲線下面積為0.882，截斷值為12.51 ng/ml，敏感度和特異度分別為86.42%，79.23%。血清miR-455和FABP4 聯(lián)合診斷EMT 的曲線下面積為0.922，敏感度和特異度分別為87.67%，81.33%。

圖1 EMT 患者血清miR-455 與FABP4 的相關(guān)性分析散點圖

圖2 ROC 曲線分析血清miR-455，F(xiàn)ABP4 對EMT 的診斷價值

表1 聯(lián)合檢測Logistic 分析

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥（EMT）的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，70%～80%的患者有不同程度的盆腔疼痛，嚴(yán)重影響婦女身心健康，目前腹腔鏡檢查是診斷EMT 的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有有創(chuàng)性，因此尋找有效標(biāo)志物對EMT 的診斷具有重要意義[9]。

miRNA 在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，可通過調(diào)控靶基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖侵襲而參與EMT 的發(fā)生發(fā)展[10]。多項報道顯示，miRNA 在EMT 患者血清中異常表達(dá)，劉玉瑰等[11]研究表明，EMT 患者血清miR-1304-3p 水平升高，miR-17-5p 水平降低，且與患者病情嚴(yán)重程度和不孕癥有關(guān)。趙喜艷等[12]研究表明，EMT 患者血清miR-494-5p 與miR-1304-3p 表達(dá)水平升高，且隨病情進展而逐漸增加，對EMT 的病情進展評估具有一定意義。miR-455 為miRNA 的一種，與慢性乙型肝炎、肺炎、腫瘤等多種疾病有關(guān)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，miR-455 在EMT 患者血清中表達(dá)水平顯著低于健康人群，提示miR-455 可能與EMT 的發(fā)生有關(guān)；另外III ～I(xiàn)V 期EMT 患者血清miR-455 表達(dá)水平顯著低于I ～I(xiàn)I 期患者，提示miR-455 與EMT 的病情嚴(yán)重程度有關(guān)。研究顯示[15]，miR-455 可以通過激活Nrf2 信號通路保護成骨細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，EMT 的發(fā)生機制涉及氧化應(yīng)激病例過程，本研究推測EMT 患者血清miR-455 水平異常表達(dá)，可能與子宮內(nèi)膜的氧化應(yīng)激有關(guān)。

FABP4 是脂肪因子，調(diào)控脂類生成及降解、參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運和代謝，F(xiàn)ABP4 還可調(diào)控腫瘤細(xì)胞脂肪酸代謝，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移[16]。研究表明[17]，F(xiàn)ABP4 與胚胎植入有關(guān)，抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中FABP4 可消除雌激素和孕激素聯(lián)合誘導(dǎo)的子宮受體的表達(dá)，并減少黏附在子宮內(nèi)膜細(xì)胞上的滋養(yǎng)細(xì)胞球體的數(shù)量。miR-455 可通過調(diào)節(jié)FABP4 來保護人類子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，F(xiàn)ABP4 在EMT 組患者血清中水平升高，提示FABP4 可能促進細(xì)胞增殖，與EMT 發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。

目前EMT 的病因及發(fā)病機制尚不完全清楚，多項報道顯示，異位內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、侵襲、氧化應(yīng)激、血管生成是主要病理生理過程[19]。雖然EMT 為良性疾病，但也具有侵襲性、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等與腫瘤類似的生物學(xué)特性，EMT 還與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系[20]。本研究推測miR-455，F(xiàn)ABP4 參與EMT 的發(fā)展可能與miR-455，F(xiàn)ABP4 參與血管生成、細(xì)胞增殖與侵襲有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，EMT 患者血清miR-455 表達(dá)水平與FABP4 呈負(fù)相關(guān)，表明二者可能存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系。唐文波等[21]研究表明，miR-455 可通過靶向調(diào)控FABP4 而保護過氧化氫誘導(dǎo)的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。本研究推測miR-455 可能通過靶向調(diào)控FABP4 的表達(dá)參與EMT 的發(fā)生與發(fā)展。進一步分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-455，F(xiàn)ABP4 聯(lián)合診斷EMT 的曲線下面積為0.922，敏感度和特異度分別為87.67%，81.33%，提示miR-455 和FABP4 聯(lián)合檢測對于早期診斷EMT 具有一定價值，有一定臨床應(yīng)用意義[22]。

綜上所述，血清miR-455，F(xiàn)ABP4 在EMT 患者中分別呈低、高表達(dá)，均與患者病情相關(guān)，可能作為EMT 早期診斷的分子標(biāo)志物。但由于本研究臨床樣本數(shù)據(jù)少，結(jié)果可能存在一定偏倚，后續(xù)仍需擴大樣本量做進一步研究。