肺鱗狀細(xì)胞癌組織中LncRNA MIR205HG的表達(dá)及對(duì)癌細(xì)胞增殖克隆的影響和機(jī)制研究

沈運(yùn)濤，蔡篤雄

（1.海口市瓊山區(qū)婦幼保健院兒科，海口 571100；2. 海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，?？?570102）

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）發(fā)生率約占肺癌總發(fā)生率的80%～85%，其亞型中肺鱗狀細(xì)胞癌死亡率較高，年死亡率約為40 萬[1-3]。目前，針對(duì)特定基因靶向藥物的開發(fā)已大大改善了肺鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell lung carcinoma, SQCLC)患者的治療現(xiàn)狀，然而仍有一小部分肺鱗狀細(xì)胞癌患者具有驅(qū)動(dòng)基因靶向治療，導(dǎo)致5年生存率＜5%，原因是鉑類化療藥的副作用[4]。因此，探究肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)更有效的治療方案顯得至關(guān)重要。近年二代測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)證實(shí)只有1%～2%的人類基因組可以編碼蛋白質(zhì)，沒有編碼潛力的RNA 根據(jù)長度被分成短鏈非編碼RNA 和長鏈非編碼RNA（lncRNAs，≥200nt）兩個(gè)亞類[5]。研究表明，lncRNAs 通過多種機(jī)制對(duì)多種生物過程產(chǎn)生影響，包括翻譯抑制、mRNA 降解、RNA 誘餌、招募染色質(zhì)修飾因子、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等[6]，暗示lncRNAs 可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后生存的分子標(biāo)志物[7]。且表明，lncRNAs 異常表達(dá)參與人類疾病的發(fā)展過程，特別是癌癥的發(fā)生發(fā)展[8]。因此，本研究通過數(shù)據(jù)庫篩選出肺鱗狀細(xì)胞癌中差異性表達(dá)最顯著lncRNA，并探究了其在肺鱗狀細(xì)胞癌中的作用及其參與肺鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 人肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SK-MES-1 購于上海細(xì)胞庫，含10g/dl 胎牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)加入鏈霉素100 μg/ml 和青霉素100 IU/ml，培養(yǎng)在含5ml/dl 的CO2和95%濕度的37℃培養(yǎng)箱中。同時(shí)選取2020年12月期間本院收治的4 例人肺鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織及其對(duì)應(yīng)正常肺組織標(biāo)本進(jìn)行研究，標(biāo)本來自醫(yī)院病理科，于低溫液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)液（美國Gibco 公司），鏈霉素、青霉素（北京索萊寶科技有限公司），PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司），Lipo2000（美國Invitrogen 公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-rad 公司），MTS 反應(yīng)液（南京凱基生物技術(shù)有限公司），MIR205HG 干擾siRNA 序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 臨床數(shù)據(jù)篩選及編碼能力預(yù)測(cè)：檢索GEPIA[9]臨床數(shù)據(jù)庫，以tumor/normal ＞2 為條件篩選出在肺鱗狀細(xì)胞癌中差異性最高表達(dá)的lncRNA，并通過檢索PholyCSF[10]數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)目的lncRNA 編碼蛋白質(zhì)的潛力。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)（RT-qPCR）：采用TRIzol 試劑盒提取細(xì)胞及組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板配置PCR 反應(yīng)體系為cDNA 4 μl，qPCR mix 5 μl，primer 1 μl，加ddH2O 至總體積為20 μl，行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃35 s，95℃ 20 s，72℃ 15 s，循環(huán)40 次。使用primer 3 設(shè)計(jì)特異性qPCR 引物，引物序列MIR205HG 正向：5’-GCGATGACATTCGCAGCG-3’，反向：5’-CA GTGCCTGTGCTGCAGT-3’；GAPDH 正向：5’-ACG AGAGTGCATGGCTCAC-3’，反向：5’-CGAGCAGG CTGTTCGTGTAG-3’；采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：以6 孔板為例：將10 μl MIR205 HG-siRNA 與50 μl Opti-MEM 培養(yǎng)液混勻，將5 μl上述混勻液與2 μl 脂質(zhì)體合并混勻，靜置20 min后常規(guī)培養(yǎng)6 h，更換無血清培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：取轉(zhuǎn)染后待測(cè)細(xì)胞以1×105個(gè)/孔鋪于96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)生物重復(fù)，培養(yǎng)48 h。按照MTS ∶培養(yǎng)液=1∶20 比例配制MTS 反應(yīng)液，每孔加入反應(yīng)溶液約100 μl，每30 min 檢測(cè)一次吸光度。每孔加入150 μl 二甲基亞砜，置搖床低速振蕩10 s，使結(jié)晶物充分溶解，490 nm處測(cè)各孔吸光度值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：取轉(zhuǎn)染后待測(cè)細(xì)胞以1×106個(gè)/孔鋪于6 孔板，每個(gè)樣品做3 個(gè)生物重復(fù)，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)收集細(xì)胞，PBS 洗滌兩次，常溫固定5 min，含0.5g/dl 結(jié)晶紫甲醇溶液固定15 min，水洗掉紫色背景，晾干掃描，10g/dl醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，測(cè)量590 nm 處測(cè)吸光度值。

1.3.6 基因功能分析：檢索cBioPortal[11]數(shù)據(jù)庫找尋MIR205HG 的共表達(dá)基因，經(jīng)metascape 行通路分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)計(jì)三次重復(fù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選具有臨床意義的LncRNA 研究檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫共找到在肺鱗狀細(xì)胞癌中差異表達(dá)的lncRNA 有289 個(gè)，其中63 個(gè)在癌組織中高表達(dá)，226 個(gè)在正常組織中高表達(dá)，通過火山圖篩選出在肺鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)且對(duì)比正常組織表達(dá)差異最顯著的MIR205HG，見圖1a。通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，MIR205HG 僅在部分組織和腫瘤中表達(dá)，相較于肺腺癌，MIR205HG 僅在肺鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)（P＜0.05），見圖1b；同時(shí)發(fā)現(xiàn)相比338 例正常組織（1.084±0.036），MIR205HG 在486 例肺鱗狀組織（6.785±0.462）中顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=188.873，P=0.000），暗示了MIR205HG在肺癌且僅在肺鱗狀細(xì)胞癌中具有作用。

圖1 篩選具有臨床意義的lncRNA

2.2 探究MIR205HG 在肺鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮功能的形式 研究通過PholyCSF 數(shù)據(jù)庫對(duì)MIR205HG的編碼能力進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MIR205HG 不具有蛋白編碼能力，其通過lncRNA 形式在肺鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮功能。

2.3 研究MIR205HG 在肺鱗狀細(xì)胞癌中的重要性見圖2。研究提取4 組臨床正常肺組織和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中RNA，通過DNA 電泳（圖2a）以及qPCR 實(shí)驗(yàn)（圖2b），均驗(yàn)證了MIR205HG 在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)（P＜0.05）；通過檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，臨床分期越高M(jìn)IR205HG 表達(dá)水平越高（P=0.047 2，圖2c）。通過轉(zhuǎn)染2 條shRNA至肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)shMIR205HG#1 組和shMIR205HG#2 組細(xì)胞中MIR205HG 表達(dá)分別為0.289±0.046，0.304±0.051，明顯低于轉(zhuǎn)染無義序列shCTL 對(duì)照組的1.000±0.003，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=314.271，P＜0.001），提示敲降MIR205HG 表達(dá)轉(zhuǎn)染成功。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染72h 時(shí)shMIR205HG#1 組和shMIR205HG#2組細(xì)胞增殖率分別為0.709±0.032，0.736±0.026，明顯低于shCTL 對(duì)照組的0.988±0.039，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.163，P＜0.001）。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)shMIR205HG#1 組和shMIR205HG#2 組細(xì)胞克隆形成速率分別為0.324±0.021，0.402±0.023，亦明顯低于shCTL 對(duì)照組的1.809±0.019，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=423.093，P＜0.001），提示敲低MIR205HG 表達(dá)可明顯抑制肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖及克隆形成。

2.4 探究MIR205HG 在肺鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮功能的作用方式 見圖3。研究在數(shù)據(jù)庫中找到與MIR205HG 共表達(dá)的基因，通過KEGG 和HallMark信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，MIR205HG 可能參與P53 這個(gè)重要的致癌信號(hào)通路（圖3a）。通過蛋白質(zhì)免疫印跡驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRNA 介導(dǎo)敲低MIR205HG 時(shí)，shMIR205HG#1 組和shMIR205HG#2 組細(xì)胞中P53表達(dá)分別為5.988±0.321，5.702±0.345，下游重要的P21 蛋白表達(dá)分別為3.857±0.362，3.698±0.314，均明顯高于shCTL 對(duì)照組的1.022±0. 152，1.106±0.253，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=285.386，73.106，均P＜0.001，圖3b），提示MIR205HG 可能通過下調(diào)P53 以及抑制其介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌的生長增殖。

圖2 研究MIR205HG 在肺鱗狀細(xì)胞癌中的重要性

圖3 探究MIR205HG 在肺鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮功能的作用方式

3 討論

近年，越來越多證據(jù)發(fā)現(xiàn)LncRNA 參與了包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[12]，為腫瘤的臨床研究及診治提供了新的目標(biāo)和思路。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄物大小超過200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA[8]。LncRNA 在結(jié)構(gòu)上與mRNA 相似，但其具有更高的組織表達(dá)特異度[13]。LncRNAs 可作為識(shí)別癌癥的特異性生物標(biāo)志物和功能驅(qū)動(dòng)因子。大量研究表明，LncRNAs 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化學(xué)耐藥中都起著重要作用，例如：LncRNAs CCAT1 下調(diào)增強(qiáng)了人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感度[14]。LncRNAs-GAS5/miR-221-3p/DKK2 軸通過Wnt/βcatenin 信號(hào)通路調(diào)控abcb1 介導(dǎo)的乳腺癌阿霉素耐藥[15]。LncRNA TUC338 通過激活MAPK 通路促進(jìn)了肺癌的增殖、侵襲及遷移[16]。近年眾多研究也發(fā)現(xiàn)，多種lncRNAs 與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如LncRNA MALAT1 通過調(diào)節(jié)miR - 124/STAT3 軸參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生[17]。體外實(shí)驗(yàn)表明，敲低PVT1 會(huì)抑制肺鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18]。CCAT2 通過調(diào)節(jié)Wnt /β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生[19]。因此，找尋更多肺鱗狀細(xì)胞癌中特異性表達(dá)的分子靶標(biāo)，探究其表達(dá)發(fā)揮作用對(duì)臨床治療及攻克意義顯著。

本研究首先通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫找到在肺癌中差異表達(dá)的lncRNA 有289 個(gè)，進(jìn)一步篩選到在肺癌中過表達(dá)且相比于正常組織表達(dá)差異最明顯的MIR205HG 作為研究目的基因，探究發(fā)現(xiàn)其主要通過lncRNA 形式在肺鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮功能。既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MIR205HG 通過調(diào)控miR-122-5p 加速宮頸癌腫瘤細(xì)胞的生長進(jìn)展[20]。lncRNA MIR205HG 能夠引起Hsa-miR-590-3p 缺失導(dǎo)致頭頸部鱗狀細(xì)胞癌不受抑制的增殖，促進(jìn)其發(fā)展進(jìn)程[21]。LncRNA MIR205HG 通過miR-299-3p/VEGFA 軸支持黑色素瘤的生長，是黑色素瘤治療的潛在靶點(diǎn)[22]。LncRNA MIR205HG 在食管腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其過表達(dá)可抑制體外細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，涉及對(duì)Hh 信號(hào)通路的調(diào)控作用[23]；且發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控miR-214/SOX4 軸驅(qū)動(dòng)了食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[24]。提示MIR205HG 在臨床癌癥中的癌基因作用，故進(jìn)一步探究其在肺鱗狀細(xì)胞癌中的作用機(jī)制十分必要。研究通過經(jīng)典的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)MIR205HG 可促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌的生長增殖和克隆形成。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MIR205HG可能參與P53 致癌的信號(hào)通路。P53 關(guān)鍵靶基因P21 和14-3-3σ 在幾種類型的人類腫瘤中的異常表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤抑制因子，以P53 依賴性方式發(fā)揮功能[25]。而研究通過敲低MIR205HG 對(duì)P53 及其關(guān)鍵靶基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)敲降其表達(dá)會(huì)促進(jìn)P53 以及其下游關(guān)鍵靶基因P21, 14-3-3σ 的表達(dá)，由此說明了MIR205HG 可能通過調(diào)控P53 表達(dá)，并阻斷其參與的信號(hào)通路來發(fā)揮作用參與肺鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展。本研究從基因篩選、發(fā)揮作用形式、功能驗(yàn)證和作用機(jī)制探討四個(gè)方面探究了MIR205HG 在肺鱗狀細(xì)胞癌中的重要作用，但其功能機(jī)制尚不夠全面深入，故后期還需進(jìn)一步的研究闡明。

綜上所述，lncRNA MIR205HG 在肺鱗狀細(xì)胞癌中顯著高表達(dá)，其參與調(diào)控肺鱗狀細(xì)胞癌的增殖與P53 信號(hào)通路密切相關(guān)，可將其作為肺鱗狀細(xì)胞癌的潛在藥物治療靶點(diǎn)。