miR-21靶向調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路對骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

姜富祥，阿爾賓，高 飛，王 興

（內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市醫(yī)院脊柱外科，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000)

骨肉瘤（osteoma cells）是一種來源于骨骼的原發(fā)惡性腫瘤，好發(fā)于10 ～20 歲青少年，該年齡段是人體生長發(fā)育最快階段，若骨細(xì)胞發(fā)生惡性突變，形成惡性骨肉瘤，會嚴(yán)重威脅青少年健康成長，但關(guān)于骨肉瘤的發(fā)病機制尚不明確，仍缺乏病因治療[1-2]。因此，尋找在骨肉瘤發(fā)病過程中具有調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵基因，并深入探討其調(diào)控機制，可以為骨肉瘤的后期治療提供新方向。微小核糖核酸（microRNA, miR）-21 作為具有調(diào)控作用的非編碼微小RNA，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與了腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的各個階段[3]。有研究報道，miR-21 在肺癌中具有致癌活性，其高表達對非小細(xì)胞肺癌的總生存期有負(fù)面影響，并且可以預(yù)測非小細(xì)胞肺癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率和生存率，可作為判斷肺癌疾病進展的分子預(yù)后標(biāo)志物[4]。另有研究報道，miR-21 在胃癌、腎細(xì)胞癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均作為促癌因子，抑制miR-21 表達，則對患者體內(nèi)癌細(xì)胞的增殖及侵襲起到一定的抑制作用，這可能為惡性腫瘤的治療提供新的潛在策略[5-7]。此外，還有研究證實miR-21 在骨肉瘤組織中高表達，且與病理分期、腫瘤等級及肺轉(zhuǎn)移等臨床病理有關(guān)，但關(guān)于miR-21 作用骨肉瘤的調(diào)控機制卻鮮有報道[8]。因此，本研究著重分析miR-21 在人骨肉瘤細(xì)胞系中的表達及抑制miR-21 表達后對骨肉瘤MG-63 細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響，進而深入探討miR-21 在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機制。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞株來源 人正常骨細(xì)胞hFOB1.19，人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，U2OS 和Saos-2 均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 儀器與試劑 胎牛血清，DMEM 培養(yǎng)液（鄭州九龍生物制品有限公司）； RNA 試劑盒，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]；CKK-8 試劑盒（上海通蔚實業(yè)有限公司）；PTEN，PI3K，AKT，p-AKT 多克隆抗體（北京艾柏森生物科技有限公司）；LipofectAMINE 2000 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒（杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；Transwell 小室（北京明陽科華生物科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Binder 公司）；熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將hFOB1.19，MG-63，U2OS 和Saos-2 細(xì)胞接種于含10g/dl 胎牛血清，100 U/ml 青霉素和鏈霉素混合液配置的DMEM 培養(yǎng)液，放置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至融合度為80%時，用胰蛋白酶消化、傳代，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2 qRT-PCR 檢測各細(xì)胞中miR-21 的表達：依照RNA 提取試劑盒說明書對上述對數(shù)生長期的各組細(xì)胞進行總RNA 提取，取少量純度高的RNA 加入提前滅菌的無酶離心管，再依次加入RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的相關(guān)試劑，通過酶促反應(yīng)合成第一鏈cDNA；用上述合成的第一鏈cDNA 作為模板進行qRT-PCR 擴增，擴增體系為25 μl，擴增條件為：95 ℃ 15 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)35 次；所有操作完成后即可通過PCR 儀檢測各組細(xì)胞中miR-21 表達量，其相對表達量采用2-△△Ct法計算。PCR 引物序列：miR-21：上游5’-GTCGAGCGTCGCACGT-3’，下游5’-GCCGGTAC GTTATCACAGTGT-3’；內(nèi)參U6：上游5’-CTAAC TGATACTGCGCTAGCA-3’，下游5’-TGCGACCG ACGACAATGAA-3’。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的MG-63 細(xì)胞接種于24 孔板，待細(xì)胞渾濁度為90%～95%時，將其隨機分為三組，即Control 組，miR-21-NC 組及miR-21-inhibitor 組，在每組細(xì)胞培養(yǎng)板中加入提前混合均勻的LipofectAMINE 2000 試劑和DNA 稀釋液，并輕輕搖動使細(xì)胞與混合液充分融合，轉(zhuǎn)染4 ～6 h 后將細(xì)胞以1∶10 比例轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后通過qRT-PCR 法驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.3.4 細(xì)胞增殖實驗：取上述轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化后接種于96 孔板中，每組設(shè)5 個復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24，48，72，96 h，取出后每孔加20 μl CKK-8 溶液，盡量避免產(chǎn)生氣泡，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育1 ～4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度（A），吸光度值越大則細(xì)胞增殖能力越強。

1.3.5 細(xì)胞凋亡實驗：分別取上述轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，經(jīng)消化、離心后收集全部細(xì)胞至1.5 ml 離心管，用提前預(yù)冷的PBS 洗滌兩次，然后加入1×結(jié)合緩沖液1 ml 重懸細(xì)胞。取100μl 細(xì)胞重懸液加入5 ml 培養(yǎng)管中，加入5μl FITC 標(biāo)記的Annexin-V 和5μl PI 染液，混勻后室溫避光孵育15 min，然后再加入 400μl 的1×結(jié)合緩沖液，整個操作過程不能用力吹打細(xì)胞，反應(yīng)完畢后應(yīng)在1h 內(nèi)上機檢測，用FL1 通道檢測FITC-Annexin V 熒光，用FL2 通道檢測PI 熒光。

1.3.6 細(xì)胞侵襲實驗：用50 mg/L Matrigel 1∶8 稀釋液包被Transwell 小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。取上述轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，終止消化后用PBS 潤洗1 ～2 遍，用含BSA 的無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105，取200μl 細(xì)胞重懸液接種于放有Transwell 小室的24 孔板中，在24 孔板下室加入500μl 含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)液，若下層培養(yǎng)液與小室之間出現(xiàn)氣泡，則需將小室提起，去除氣泡后再放進培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h，取出Transwell 小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，下層細(xì)胞經(jīng)PBS清洗和酒精固定后，用0.1g/dl 結(jié)晶紫染色20 min，PBS 清洗2 次，倒置晾干后即可在光學(xué)顯微鏡下進行計數(shù)并拍照。

1.3.7 免疫印跡實驗：分別取上述轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，置于冰上，加入1ml PBS 重懸后，4 ℃離心5 min，除去細(xì)胞中殘留的微量血清，然后加入IP 細(xì)胞裂解液輕輕重懸細(xì)胞，在 4℃，13 000 r/min 的條件下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml 離心管，取5μl 進行蛋白定量，將所有蛋白濃度調(diào)整為統(tǒng)一大小后，100 ℃ 加熱5 min，以充分變性蛋白。然后在提前準(zhǔn)備好的電泳槽中開始上樣，每孔上樣量為10μl，上樣完畢后蓋好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)電壓進行電泳，上層濃縮膠電壓為80 V，下層分離膠電壓為110 V，待溴酚藍染料前沿下至凝膠末端3cm 處停止電泳。按照陰極碳板、海綿、三濾紙、膠、膜、三濾紙、海綿、陽極碳板的順序進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA，60min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后把蛋白膜放入Western 洗滌液漂洗3 min，5g/dl 脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入提前稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜，回收一抗，洗膜液漂洗3 次后加入二抗，搖床孵育1 h，回收二抗，洗膜液漂洗3 次后根據(jù)顯影定影試劑說明進行洗片，常溫晾干后將膠片置于凝膠成像儀觀察拍照，并用Image-J 軟件分析各組蛋白相對表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進行實驗結(jié)果分析，服從正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人正常骨細(xì)胞和人骨肉瘤細(xì)胞系中miR-21 表達水平比較 qRT-PCR 結(jié)果表明，人骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2，U2OS 和MG-63 中miR-21 的相對表達水平分別為1.29±0.14，1.75±0.21，2.12±0.25，較人正常骨細(xì)胞hFOB 1.19 中miR-21 表達水平（0.75±0.12）顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=38.037，P=0.002）。

2.2 MG-63 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果驗證 qRT-PCR 驗證發(fā)現(xiàn)，Control 組miR-21 表達水平為2.07±0.28，miR-21-NC 組其表達水平為2.02±0.33，miR-21-inhibitor 組 miR-21 表達水平（1.07±0.15）較以上兩組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=33.357，P=0.005），說明轉(zhuǎn)染成功。

2.3 抑制miR-21 表達對MG-63 細(xì)胞增殖能力的影響 見表1。CKK-8 結(jié)果表明，與Control 組和miR-21-NC 組相比，miR-21-inhibitor 組各個時間點A值均顯著下降，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71.409 ～378.281，均P＜0.001），說明抑制miR-21 表達可抑制MG-63 細(xì)胞增殖。

2.4 抑制 miR-21 表達對MG-63 細(xì)胞凋亡能力的影響 流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，Control 組MG-63細(xì)胞凋亡數(shù)為8.65%，miR-21-NC 組細(xì)胞凋亡數(shù)為10.60%，抑制 miR-21 表達后，其凋亡數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的45.0%，較Control組和miR-21-NC組顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.134，P＜0.001）。

2.5 抑制 miR-21 表達對MG-63 細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell 細(xì)胞侵襲實驗表明，miR-21-inhibitor 組細(xì)胞穿膜數(shù)為102±9 個，較Control 組細(xì)胞穿膜數(shù)（189±12 個）及miR-21-NC 組細(xì)胞穿膜數(shù)（177±16 個）明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=158.781，P＜0.001），說明抑制miR-21 表達可以抑制MG-63 細(xì)胞的侵襲。

表1 不同時間點各組細(xì)胞吸光值（A）比較（± s）

表1 不同時間點各組細(xì)胞吸光值（A）比較（± s）

注：24，48，72，96h ③組 vs ①組，t=9.013，15.936，23.186，10.753，均P＜0.001; ③組 vs ②組，t=8.343，14.500，21.321，9.847，均P＜0.001。

時間（h）Control①miR-21-NC 組②miR-21-inhibitor 組③FP 240.214±0.0170.205±0.0210.093±0.00971.409＜0.001 480.452±0.0230.431±0.0170.219±0.012168.511＜0.001 720.874±0.0260.842±0.0280.476±0.019257.545＜0.001 961.014±0.0310.992±0.0270.753±0.031378.281＜0.001

2.6 抑制 miR-21 表達對MG-63 細(xì)胞中PTEN，PI3K，AKT 及p-AKT 蛋白表達的影響 見表2。Western blot 結(jié)果表明，與Control 組和miR-21-NC 組相比，miR-21-inhibitor 組PTEN 蛋白表達顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=102.781，P＜0.001），PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平顯著下降，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=86.309，P＜0.001；F=138.615，P＜0.001），但抑制miR-21 表達對AKT 蛋白表達水平無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.527，P=0.152）。

表2 抑制miR-21 表達對各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達水平的影響（± s）

表2 抑制miR-21 表達對各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達水平的影響（± s）

項 目ControlmiR-21-NC 組miR-21-inhibitor 組FP PTEN0.61±0.0170.65±0.0211.12±0.009102.781＜0.001 PI3K0.75±0.0230.72±0.0170.41±0.01286.309＜0.001 AKT0.92±0.0260.89±0.0280.90±0.01914.5270.152 p-AKT1.01±0.0310.99±0.0270.54±0.031138.615＜0.001

3 討論

由于骨肉瘤早期癥狀與普通的關(guān)節(jié)疼痛相似，不易被重視，且骨肉瘤侵襲能力強，在早期極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致術(shù)后5年生存率較低，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[9]。因此，急需尋找新的治療方法和靶向藥物來進一步提高骨肉瘤患者的生存率，改善其不良預(yù)后。miR-21 屬于原癌基因，幾乎所有的癌癥都有參與，主要包括細(xì)胞分化、基因調(diào)控、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)行為[10]。趙琦等[11]研究表明，與對照組相比，miR-21在肺癌患者血漿表達水平明顯升高，且其表達水平與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及化療療效相關(guān)。ZHANG 等[12]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21 高表達通過調(diào)節(jié)PDCD4基因來促進成纖維細(xì)胞的激活，顯著增加MMP-3，MMP-9，PDGF 和CCL-7 的表達，進而促進胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細(xì)胞系的侵襲及增加了PDAC 的耐藥性，說明miR-21 是激活與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)劑。此外，大量研究顯示，miR-21 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤中作為促癌因子，與癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等密切相關(guān)[13-14]。關(guān)于miR-21 對骨肉瘤的影響也有部分報道，但其作用機制尚不明確，還需進一步的驗證[15]。

PI3K/AKT 通路廣泛存在于細(xì)胞中，與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)，其異常激活不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且能促進腫瘤細(xì)胞增殖、生長及分化等，PTEN 作為miR-21 的靶向調(diào)控因子，能夠通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 途徑影響到腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡，對癌癥的發(fā)生發(fā)展起到重要作用[16-17]。WU 等[18]發(fā)現(xiàn)miR-21 在食道癌組織中高表達，抑制miR-21 表達，可降低癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移活性，并且miR-21 低表達可以負(fù)向調(diào)控靶基因PTEN 的表達，進而抑制PI3K/AKT 活化，為食管癌的臨床治療提供了新方法。ZHAO 等[19]研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可以誘導(dǎo)TCP-1 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，其作用機制可能與miR-21/ PTEN/ Akt 途徑有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚在體外通過miR-21/PTEN/AKT 途徑抑制肺癌A549 細(xì)胞的生長；在體內(nèi)促進腫瘤細(xì)胞凋亡，這可能是一種更特異、更有效治療肺癌的新方法[20]。

本研究首先采用qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞系中miR-21 表達水平顯著高于正常骨細(xì)胞，因此可以推斷miR-21 與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是一種促癌基因；此外還能觀察到miR-21 在MG-63細(xì)胞中的表達最為顯著，因此，選擇該細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染實驗，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染抑制劑能顯著降低MG-63細(xì)胞中miR-21 的表達，說明利用脂質(zhì)體2000 進行轉(zhuǎn)染實驗是穩(wěn)定可行的；CKK-8 實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，干擾miR-21 表達可以降低MG-63 細(xì)胞的增殖和侵襲能力。流式結(jié)果顯示，Control 組和miR-21-NC 組MG-63 細(xì)胞膜保持完好，活細(xì)胞比例較高，只出現(xiàn)了少量壞死和早期凋亡。miR-21-inhibitor 組MG-63 正常細(xì)胞比例顯著降低，而晚期細(xì)胞凋亡比例顯著升高，推測其原因可能是通過RNA 干擾技術(shù)抑制miR-21 表達，則可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞從正常期向凋亡期轉(zhuǎn)變，加快其凋亡進程。同時本研究經(jīng)Westernblot 實驗檢測發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21 表達后PTEN 蛋白表達上調(diào)，預(yù)測PTEN 在骨肉瘤中亦可作為miR-21 的靶向結(jié)合位點；另PI3K 和磷酸化AKT 水平下調(diào)，對AKT 表達無顯著影響，提示miR-21 抑制MG-63 細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)凋亡可能與激活PTEN/PI3K/AKT 通路有關(guān)。

綜上所述，miR-21 作為促癌因子在骨肉瘤細(xì)胞中高表達，并且能通過抑制miR-21 表達來激活PTEN/AKT/mTOR 信號通路，進而抑制骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。但本研究還存在一定的局限性，首先只做了體外實驗，miR-21 在體內(nèi)實驗的表達水平及調(diào)控機制還有待進一步驗證；其次miR-21 是否還能通過其他途徑來調(diào)控骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展還需進行深入研究。