參芪蛭龍湯通過ERK/cPLA2 信號通路對膜性腎病小鼠的治療作用及機制研究

薛丕良，李麗琦，徐梅秀，李星宇，王 順，2

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是成人腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）的主要病理類型之一，約占成人NS 的20%［1］。MN 的主要病理特征表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚、免疫復(fù)合物在上皮下彌漫性沉積及IgG 顆粒樣沿毛細(xì)血管袢沉積，主要臨床表現(xiàn)為水腫、高脂血癥、低白蛋白血癥和大量蛋白尿［2］。2003～2014 年，MN 的發(fā)病頻率增加了近一倍，發(fā)病率僅次于IgA 腎病，其中三分之一的患者會發(fā)展為終末期腎病［3，4］。

臨床上，西醫(yī)對MN 的治療效果并不理想，利妥昔單抗或環(huán)磷酰胺（cytoxan，CTX）聯(lián)合類固醇是臨床治療MN 的主要方法，但感染、腎毒性、骨髓毒性、癌癥等副作用的發(fā)生，以及大多數(shù)患者在停藥后會復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者多次住院治療［5-7］。近年來，中醫(yī)藥在治療MN 方面取得較好的療效，與西藥相比，中藥能更快地提高血清白蛋白水平、從而更好地緩解水腫、疲勞等癥狀，且不良反應(yīng)少［8］。

中醫(yī)認(rèn)為，本病的病機主要為脾腎兩虛，濕濁瘀阻，通常以補益脾腎，化瘀利濕為主要治療法則［9］。參芪蛭龍湯是臨床治療MN 的復(fù)方制劑，已在臨床應(yīng)用10 年有余，療效顯著［10］。本方中以黃芪、黨參、淫羊藿為君藥，其中黃芪補肺脾之氣，為補氣要藥，且具有升舉陽氣、利水退腫之效；黨參補益脾胃之氣；淫羊藿補命門，益精氣，利小便，補腎壯陽。川芎、當(dāng)歸、僵蠶、水蛭、地龍為臣藥，其中川芎活血行氣；當(dāng)歸養(yǎng)血活血；地龍通經(jīng)絡(luò)、利小便；僵蠶化痰軟堅散結(jié)；水蛭治惡血，瘀血，月閉，破血瘕積聚，利水道。鳳尾草、虎杖為佐藥，虎杖活血祛瘀、清熱利濕；鳳尾草利濕消腫。全方共湊補脾益腎，活血化瘀，利濕消腫之效。

根據(jù)癥候表現(xiàn)不同，臨床上在參芪蛭龍湯方基礎(chǔ)上加減應(yīng)用治療氣虛血瘀型MN 及特發(fā)性MN，取得較好療效［11，12］。前期藥理研究已表明，參芪蛭龍湯對MN 大鼠的治療作用與下調(diào)腎臟組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和乙酰肝素酶1（heparanase 1，HPA-1）的表達(dá)水平相關(guān)，從而改善腎臟腎小球足突病理變化［13］。本實驗通過建立小鼠MN 模型，通過觀察參芪蛭龍湯對腎臟Nephrin-Podocin-Neph1 受體復(fù)合物及ERK/cPLA2 通路的影響，進一步探討參芪蛭龍湯治療MN 的具體的分子機制，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

參芪蛭龍湯中藥材飲片（黨參、黃芪、水蛭、地龍、當(dāng)歸、川芎、虎杖、僵蠶、淫羊藿、鳳尾草）均購自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院。雷公藤多苷片（湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z43020138，規(guī)格：10 mg/片）。

1.2 動物

SPF 級ICR 小鼠60 只，雌雄各半，6 周齡，體質(zhì)量（23±4）g，購于遼寧長生生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（遼）2020-0001。動物使用許可證號SCXK（黑）2018-003。動物飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫23～25 ℃，相對濕度為50%～55%，12 h晝夜節(jié)律的動物房，自由飲水及進食。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。所有動物實驗均獲黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，編號：201912014。

1.3 試劑

陽離子牛血清白蛋白（c-BSA）（美國Chondrex公司，貨號：9058，規(guī)格：20 mg）；完全弗氏佐劑（美國Chondrex 公司，貨號：7008）；白蛋白（albumin，ALB）、總蛋白（total protein，TP）、血肌酐（Creatinine，CRE）、尿素氮（urea nitrogen，UREA）、膽固醇（cholesterol，CHO）、甘油三脂（triglyceride，TG）（中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為181511、182512、181401、183105、182022、187831）；微量總蛋白測定試劑盒（德國德賽診斷系統(tǒng)有限公司，批號：60137949）；BeyoFast SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit（北京碧云天科技有限公司，貨號：D7268M）；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（北京碧云天科技有限公司，貨號：P1051）；IL-6、IL-4 和TNF-α 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號均為：20200326）；兔抗鼠p-cPLA2 抗體（美國Affinity 公司，貨號分別為：AF3329）、兔抗鼠cPLA2 抗體、p-ERK1/2 抗體、ERK1/2 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號分別為：WL02539、WLP1512、WL01864）；HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（美國Thermo Fisher Scientific 公司，貨號：31490）；蘇木素（北京索萊寶科技有限公司公司，貨號：517-28-2）；山羊血清（北京索萊寶科技有限公司，貨號：SL038）；DAB（邁新試劑公司，貨號：DAB-1031）。

1.4 儀器

PUZS-600A 型全自動生化分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；CX23 光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司）；RM2235 切片機（德國Leica 公司）；iMark 型全自動酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD 公司）；RM2016 型石蠟切片機（萊卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司）；Amersham Imager 600 型凝膠成像系統(tǒng)（美國GE 公司）；CP100NX 型超速冷凍離心機（日本HIMAC 公司）。

1.5 方法

1.5.1 藥物制備 取黨參20 g、當(dāng)歸15 g、黃芪30 g、水蛭5 g（需研末）、川芎15 g、僵蠶15 g、地龍20 g、虎杖15 g、鳳尾草15 g、淫羊藿30 g，加10 倍量水浸泡1 h，武火煎煮1 h，濾過，收集藥液。藥渣再加10 倍量水，煎煮1 h，濾過，收集藥液。合并兩次濾液后，濃縮至1.2 g/mL，分裝后，-80 ℃冰箱凍存。

1.5.2 膜性腎病模型制備 參照文獻(xiàn)方法制備模型腎病小鼠模型［14］，具體方法如下：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機分為空白對照組（10 只）和造模組（50只）。將陽離子牛血清白蛋白（c-BSA）（2 mg/mL，10 mL PBS）與等體積的弗氏完全佐劑混合，制備成乳濁液。小鼠尾根部、腹股溝多點皮下注射上述制備好的乳濁液0.2 mL（c-BSA：0.2 mg），進行初次免疫。2 周后，造模組小鼠首次尾靜脈注射100 μg（c-BSA：0.1 mg/mL，體積1 mL），隔日注射，注射劑量增加至300 μg（c-BSA：0.3 mg/mL，體積1 mL），每周注射3 次，連續(xù)4 周。造模結(jié)束后，測定24 h 尿蛋白數(shù)值，大于8 g/L，為模型成功小鼠。

1.5.3 動物分組及給藥 將造模成功的小鼠按照尿蛋白數(shù)值隨機分為模型組及參芪蛭龍湯低、高劑量組（12、24 g 生藥/kg，按生藥總量計；根據(jù)體表面積換算法，其分別為人臨床等效劑量0.5、1 倍）和雷公藤多苷片組（14 mg/kg，為人臨床等效劑量1 倍）?？瞻捉M小鼠給予等體積蒸餾水，每日1 次，連續(xù)4 周。

1.5.4 血液生化指標(biāo)測定 末次給藥后，各組小鼠摘眼球取血，肝素鈉抗凝后，低溫下3 000 r/min 離心10 min，分離血漿，應(yīng)用全自動生化分析儀測定各組小鼠TG、TC、TP、ALB、CRE、UA、UREA 的含量。應(yīng)用全自動酶標(biāo)儀，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書操作，測定血清IL-6、IL-4 和TNF-α 含量。

1.5.5 尿蛋白測定 末次給藥前1 d，代謝籠，收集各組小鼠24 h 尿液，應(yīng)用全自動生化分析儀，采用鄰苯三酚紅比色法測定尿蛋白值。

1.5.6 腎臟HE 染色 末次給藥后1 h，各組小鼠腹腔注射5%水合氯醛（0.7 mL/100 g）麻醉后，無菌分離小鼠腎臟組織，立即放入4%多聚甲醛緩沖液中固定過夜。梯度濃度乙醇逐級脫水后，滴加液體石蠟，冷卻后制成蠟塊。切片機手動切片，厚度為5 μm。參照試劑盒說明書進行染色并于光鏡下觀察。

1.5.7 腎臟免疫組化染色 無菌分離小鼠腎臟組織，4%多聚甲醛緩沖液中固定過夜。用切片機將腎組織蠟塊切成4 μm 厚的薄片，切片烘烤后放入裝有二甲苯的溶液中脫蠟、梯度濃度酒精進行脫水，然后用檸檬酸緩沖液進行抗原修復(fù)。3%過氧化氫孵育后，10%正常山羊血清室溫封閉。一抗孵育、二抗孵育、DAB 顯色、蘇木素復(fù)染，最后脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察切片效果，并拍照。

1.5.8 RT-PCR 法檢測腎臟組織Neph-1、Nephrin及Podocin 表達(dá) 將凍存組織從-80 ℃冰箱中取出，稱取500 mg 組織至于研缽中，向研缽中倒入少量液氮，研磨成細(xì)粉后，轉(zhuǎn)移至無RNA 酶的1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol 裂解液，混勻后，靜置10 min。加入0.2 mL 氯仿，混勻10 s，靜置5 min。4 ℃，12 000 r/min，離心10 min 后，混合液分為3 層即無色的水相、中間層和黃色的有機相，將水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入與水等體積的異丙醇，混勻后，置于-20 ℃條件下過夜。15 h 后，10 000 r/min，離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀。4 ℃3 400 r/min 離心3 min，棄上清后室溫放置5 min，讓殘留的乙醇揮發(fā)。加30 μL 無RNA酶的ddH2O，充分混勻，待沉淀完全溶解，即為腎臟組織樣本的總RNA。測定RNA 濃度后，根據(jù)Beyo-Fast SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit。對上述提取的腎臟組織總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR 反應(yīng)。引物序列如下：Neph-1 上游引物：ACCTGTCGCAGTATGAATGA，下游引物：CCACCTGTAGCCCAAGAT；Nephrin 上游引物：ACTATGCCCTCTTCAAATGC，下游引物：CTCACGCTCACAACCTTCA；Podocin 上游引物：AGGATGGCGGCTGAGATT，下游引物：TGGTTTGGAGGAACTTGG；β-actin 上游引物：CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT，下游引物：TTTGATGTCACGCACGATTTCC。目的基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt來表示。

1.5.9 Western-blot 法檢測腎臟組織ERK 及cPLA2蛋白表達(dá) 稱取500 mg 凍存腎臟組織至于研缽中，向研缽中倒入少量液氮，研磨成細(xì)粉后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，加入1 mL 加強型RIPA 裂解液（含1×蛋白磷酸酶抑制劑），冰浴下裂解30 min，低溫12 000g離心10 min，收集上清總蛋白提取液。蛋白定量、變性后，按SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒說明進行電泳，然后進行濕轉(zhuǎn)印，封閉。加入p-ERK1/2（1∶1 500）、ERK1/2（1∶1 500）、p-cPLA2（1∶2 000）、cPLA2（1∶1 500）和β-actin（1∶2 000）一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜。次日，將孵育一抗后的NC 膜取出，放入TBST 中清洗5 min，共3 次，用TBST 按比例稀釋二抗，室溫孵育2 h。將孵育完二抗的NC 膜浸入TBST 中清洗5 min，共3 次。然后加入配置好的ECL 發(fā)光試劑，室溫避光備用。曝光成像，結(jié)果用Image J 凝膠圖片處理軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 參芪蛭龍湯對MN 小鼠UTP 及肝功能的影響

與空白組比較，模型組小鼠UTP 值顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，給藥后，參芪蛭龍湯低劑量組、高劑量組和雷公藤多苷片組小鼠UTP 值顯著下降（P＜0.01）。此外，與空白組比較，模型組小鼠ALB 和TP 含量均顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量、高劑量組小鼠TP、ALB 含量均顯著升高（P＜0.05、P＜0.01）；雷公藤多苷片組TP 含量顯著升高（P＜0.05），而對ALB 的含量無影響（P＞0.05）。見表1。

表1 參芪蛭龍湯對MN 小鼠UTP 及肝功能的影響（g/L，n=10，±s）Tab 1 Effects of Shenqi Zhilong Decoction on UTP and liver function in MN mice（g/L，n=10，±s）

表1 參芪蛭龍湯對MN 小鼠UTP 及肝功能的影響（g/L，n=10，±s）Tab 1 Effects of Shenqi Zhilong Decoction on UTP and liver function in MN mice（g/L，n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

TP 51.89±3.11 48.28±2.63**53.47±1.55##53.11±1.66##51.77±4.25#95.775 0.000組別空白組模型組參芪蛭龍湯低劑量組參芪蛭龍湯高劑量組雷公藤多苷組劑量（g/kg）--1 2 24 0.014 FP UTP 3.18±0.63 16.28±4.34**9.17±3.41##7.94±2.85##7.06±2.23##76.512 0.000 ALB 23.77±5.91 18.34±3.35**23.52±6.58#24.48±4.68##19.58±6.71 47.631 0.000

2.2 參芪蛭龍湯對MN 小鼠腎功能的影響

與空白組比較，模型組小鼠CRE、UREA、UA含量無顯著變化（P＞0.05）。與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量、高劑量組CRE、UREA、UA 含量無顯著變化（P＞0.05）；雷公藤多苷片組CRE 顯著升高（P＜0.05）、UREA 顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 參芪蛭龍湯對MN 小鼠腎功能指標(biāo)的影響（μmol/L，n=10，±s）Tab 2 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on renal function indexes of MN mice（μmol/L，n=10，±s）

表2 參芪蛭龍湯對MN 小鼠腎功能指標(biāo)的影響（μmol/L，n=10，±s）Tab 2 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on renal function indexes of MN mice（μmol/L，n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

UA 121.93±17.81 120.78±36.71 119.37±18.75 121.25±22.47 120.65±31.53 1.251 0.654組別空白組模型組參芪蛭龍湯低劑量組參芪蛭龍湯高劑量組雷公藤多苷組劑量（g/kg）--1 2 24 0.014 FP CRE 33.82±7.40 32.79±7.28 31.66±5.24 31.29±6.27 38.78±4.41#13.154 0.035 UREA 6.09±1.51 6.05±1.12 5.80±1.97 5.82±1.71 5.31±0.42##5.841 0.024

2.3 參芪蛭龍湯聯(lián)對MN 小鼠血脂的影響

與空白組比較，模型組CHO、TG 含量顯著上升（P＜0.05）。與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量、高劑量組及雷公藤多苷片組小鼠CHO 含量均顯著降低（P＜0.05）；參芪蛭龍湯低劑量、劑量組TG 含量顯著降低（P＜0.05），而雷公藤多苷片組小鼠TG含量無顯著變化（P＞0.05）。見表3。

表3 參芪蛭龍湯對MN 小鼠血脂的影響（mmol/L，n=10，±s）Tab 3 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on blood lipid in MN mice（mmol/L，n=10，±s）

表3 參芪蛭龍湯對MN 小鼠血脂的影響（mmol/L，n=10，±s）Tab 3 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on blood lipid in MN mice（mmol/L，n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別劑量（g/kg）CHO TG空白組模型組參芪蛭龍湯低劑量組參芪蛭龍湯高劑量組雷公藤多苷組--1 2 24 0.014 2.60±0.67 3.39±0.89*2.68±0.56#2.61±0.43#2.70±0.46#1.02±0.24 1.40±0.29*1.16±0.12#1.10±0.36#1.20±0.23 50.257 0.009 FP 71.254 0.002

2.4 參芪蛭龍湯對MN 小鼠腎臟病理變化的影響

空白組小鼠腎小球系膜、管腔大小正常。模型組小鼠腎小球出現(xiàn)分葉現(xiàn)象，腎小球系膜增厚、管腔擴大、腎小囊壁上皮破損、細(xì)胞數(shù)量減少。與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量、高劑量組及雷公藤多苷片組小鼠腎小球系膜增厚、管腔擴大、上皮破損現(xiàn)象明顯減輕，細(xì)胞數(shù)量趨向正常，其中以參芪蛭龍湯高劑量組最佳。

此外，空白組小鼠腎臟組織中IgG 表達(dá)呈陰性，即無IgG 沉積。模型組小鼠IgG 表達(dá)顯著升高，即有大量IgG 沉積。與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量、高劑量組及雷公藤多苷片組小鼠甚至組織中IgG 表達(dá)顯著降低，即IgG 沉積減少，其中以參芪蛭龍湯高劑量組最佳。見圖1。

圖1 參芪蛭龍湯對MN 小鼠腎臟病理形態(tài)及IgG 表達(dá)的影響（×200）Fig 1 Effects of Shenqi Zhilong Decoction on renal pathological morphology and IgG expression in MN mice（×200）

2.5 參芪蛭龍湯對MN 小鼠血清IL-6、IL-4、TNF-α含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清IL-6、IL-4、TNF-α 含量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量、高劑量組及雷公藤多苷片組小鼠血清IL-6、IL-4 和TNF-α 的含量顯著降低（P＜0.05、P＜0.01）。見表4。

表4 參芪蛭龍湯對MN 小鼠血清IL-6、IL-4、TNF-α 含量的影響（ng/L，n=10，±s）Tab 4 Effects of Shenqi Zhilong Decoction on serum IL-6，IL-4 and TNF-α in MN mice（ng/L，n=10，±s）

表4 參芪蛭龍湯對MN 小鼠血清IL-6、IL-4、TNF-α 含量的影響（ng/L，n=10，±s）Tab 4 Effects of Shenqi Zhilong Decoction on serum IL-6，IL-4 and TNF-α in MN mice（ng/L，n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

TNF-α 11.16±7.66 105.64±31.25**73.16±27.71#68.81±25.17##67.85±26.44##135.153 0.000組別空白組模型組參芪蛭龍湯低劑量組參芪蛭龍湯高劑量組雷公藤多苷組劑量（g/kg）--1 2 24 0.014 FP IL-6 105.62±7.92 125.74±18.06**110.39±10.65#105.73±11.59##102.60±16.43##22.367 0.000 IL-4 57.77±11.19 80.32±12.57**67.33±10.44#65.84±10.34#64.89±11.54#29.574 0.000

2.6 參芪蛭龍湯對MN 小鼠ERK/cPLA2 信號通路的影響

與空白組比較，模型組小鼠腎臟組織p-ERK1/2 和p-cPLA2 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），cPLA2和ERK1/2 蛋白表達(dá)無顯著變化（P＞0.05）。與模型組比較，參芪蛭龍湯低劑量、高劑量及雷公藤多苷片組p-cPLA2 和p-ERK1/2 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），cPLA2 和ERK1/2 蛋白表達(dá)無顯著變化（P＞0.05）。見表5、圖2。

圖2 參芪蛭龍湯對MN 小鼠ERK/cPLA2 信號通路的影響Fig 2 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on ERK /cPLA2 signaling pathway in MN mice

表5 參芪蛭龍湯對MN 小鼠ERK/cPLA2 信號通路的影響（n=10，±s）Tab 5 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on ERK / cPLA2 signaling pathway in MN mice（n=10，±s）

表5 參芪蛭龍湯對MN 小鼠ERK/cPLA2 信號通路的影響（n=10，±s）Tab 5 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on ERK / cPLA2 signaling pathway in MN mice（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別劑量（g/kg）相對表達(dá)量ERK1/2/β-actin 0.41±0.05 0.39±0.04 0.41±0.07 0.40±0.08 0.41±0.03 1.264 0.234 p-cPLA2/cPLA2 0.21±0.02 0.99±0.06**0.81±0.06##0.21±0.09##0.29±0.03##45.126 0.000空白組模型組參芪蛭龍湯低劑量組參芪蛭龍湯高劑量組雷公藤多苷組cPLA2/β-actin 0.59±0.03 0.57±0.05 0.60±0.04 0.60±0.03 0.57±0.04 1.147 0.341--1 2 24 0.014 FP p-ERK1/2/ ERK1/2 0.22±0.06 0.92±0.08**0.53±0.09##0.36±0.08##0.37±0.06##64.245 0.000

2.7 參芪蛭龍湯對MN 小鼠腎臟組織Nephrin、Podocin 和Neph1 表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠腎臟組織Nephrin、Podocin 和Neph1 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）與模型對照組比較，參芪蛭龍湯低劑量、高劑量及雷公藤多苷片組小鼠腎臟組織中Nephrin、Podocin及 Neph1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見表6。

表6 參芪蛭龍湯對MN 小鼠臟組織Nephrin、Podocin 和Neph1 表達(dá)的影響（n=10，±s）Tab 6 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on the expression of Nephrin，Podocin and Neph1 in visceral tissue of MN mice（n=10，±s）

表6 參芪蛭龍湯對MN 小鼠臟組織Nephrin、Podocin 和Neph1 表達(dá)的影響（n=10，±s）Tab 6 Effect of Shenqi Zhilong Decoction on the expression of Nephrin，Podocin and Neph1 in visceral tissue of MN mice（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別劑量（g/kg）相對表達(dá)量Podocin 1.00±0.05 0.19±0.04**0.41±0.07##0.68±0.03##0.66±0.06##214.025 0.000 Neph1 1.00±0.06 0.22±0.02**0.58±0.11##0.85±0.11##0.81±0.09##132.015 0.000空白組模型組參芪蛭龍湯低劑量組參芪蛭龍湯高劑量組雷公藤多苷組--1 2 24 0.014 FP Nephrin 1.00±0.04 0.28±0.05**0.52±0.05##0.75±0.04##0.77±0.05##141.58 0.000

3 討論

陽離子化牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）誘導(dǎo)的MN 小鼠動物模型是目前應(yīng)用較為廣泛的模型之一［15］。cBSA 能夠通過帶正電荷的陽離子與腎小球基膜上的陰離子位點相結(jié)合，形成免疫復(fù)合物沉積在基膜上，導(dǎo)致腎小球濾過屏障破壞，出現(xiàn)大量蛋白尿［16］。本實驗結(jié)果顯示，參芪蛭龍湯可顯著減少MN 小鼠尿蛋白定量數(shù)值，提高血清白蛋白水平，降低血脂CHO、TG 水平，表明參芪蛭龍湯對腎小球濾過屏障的破壞具有一定的保護作用。

腎小球濾過屏障是由毛細(xì)血管內(nèi)皮、基底膜和裂隙隔膜構(gòu)成，而裂隙隔膜蛋白（如Nephrin，Podocin 和Neph1 等）是保證腎小球濾過屏障功能的關(guān)鍵［17，18］。Nephrin 屬于免疫球蛋白家族成員之一，是一種跨膜蛋白，由一個短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和連接有8個遠(yuǎn)端IgG 樣基序和一個Ⅲ型連接蛋白樣基序的胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，特異性表達(dá)于腎小球，對維持腎小球屏障的選擇性通透性方面具有重要作用［19，20］。Podocin 是氣孔蛋白家族成員之一，其C 端結(jié)構(gòu)域可以與Nephrin 的胞質(zhì)部分相結(jié)合，與CD2AP 相互作用所介導(dǎo)的PI3K/AKT 信號通路的激活，能夠抑制足細(xì)胞凋亡［21，22］。Neph1 是跨膜蛋白Neph1 家族成員之一，Neph1 和Neph1 通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，傳導(dǎo)由外到內(nèi)的復(fù)雜信號，誘導(dǎo)肌動蛋白在質(zhì)膜上聚集［23］。Nephrin，Podocin 和Neph1 作為裂孔隔膜的跨膜受體，組成了Nephrin-podocin-Neph1 受體復(fù)合物，而編碼這些蛋白質(zhì)的基因突變或丟失時，會導(dǎo)致人類腎病綜合征的發(fā)生［24，25］。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，參芪蛭龍湯可顯著升高MN小鼠Nephrin、Podocin、Neph1 基因表達(dá)水平，表明參芪蛭龍湯能夠通過調(diào)節(jié)Nephrin-Podocin-Neph1受體復(fù)合物相關(guān)基因表達(dá)，保護腎小球濾過屏障。

MN 是由于抗原和抗體形成的免疫復(fù)合物沉積于腎小球臟層上皮下并激活補體形成膜攻擊復(fù)合物（C5b-9），導(dǎo)致腎小球上皮細(xì)胞（glomerular epithelial cells，GEC）損傷、足細(xì)胞功能障礙和腎小球屏障功能的喪失，產(chǎn)生蛋白尿［26］。胞質(zhì)磷脂酶A2（cPLA2）是一種高度保守的脂質(zhì)修飾酶，其通過催化SN-2 位置的水解鍵從甘油磷脂中裂解花生四烯酸，從而增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，是C5b-9 依賴性GEC 損傷的重要介質(zhì)［27，28］。ERK1/2 的雙位點Ser/Thr 被磷酸化后，激活ERK 信號通路，ERK 信號通路能促進細(xì)胞質(zhì)靶蛋白磷酸化，其中cPLA2 是ERK磷酸化的主要靶點之一，因此ERK 信號通路的激活也可導(dǎo)致cPLA2 的激活［29］。ERK1/2 信號通路的激活能夠促進TNF-α 等促炎因子的分泌［30］。此外，GEC 損傷能夠分泌促炎細(xì)胞因子，從而加重炎癥反應(yīng)［31］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參芪蛭龍湯組基底膜明顯增厚、腎小囊腔增大程度減輕；可顯著抑制p-ERK1/2 和p-cPLA2 蛋白的表達(dá)；降低血漿中IL-6、IL-4 和TNF-α 含量，表明參芪蛭龍湯通過抑制ERK/cPLA2 途徑的激活，減輕GEC 損傷，從而減少促炎細(xì)胞因子的分泌。

綜上所述，參芪蛭龍湯對MN 小鼠具有較好的治療作用，作用機制與調(diào)節(jié)Nephrin-podocin-Neph1受體復(fù)合物相關(guān)基因表達(dá)，保護腎小球濾過屏障，抑制ERK/cPLA2 途徑的激活，減輕腎小球上皮細(xì)胞損傷，從而減少促炎細(xì)胞因子分泌有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

實驗由薛丕良設(shè)計及實驗操作，徐梅秀、李星宇負(fù)責(zé)指標(biāo)檢測，李麗琦和徐梅秀對實驗數(shù)據(jù)進行分析。文章由薛丕良撰寫，最終由王順進行審核。

以上作者對文章無利益沖突。