機(jī)械感受器Piezo離子通道激活與調(diào)控機(jī)制

郭雨松

華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430030

生物體感受外界機(jī)械刺激并做出正確的反應(yīng)對其維持正常生理功能十分重要。將環(huán)境中的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)的過程稱為機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，是觸覺、聽覺、機(jī)械痛覺等感覺形成的核心信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，也是滲透壓調(diào)節(jié)等機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持的關(guān)鍵途徑。完成機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)這一重要功能的分子機(jī)器即生物體的機(jī)械感受器，在機(jī)體中分布廣泛而稀疏，因此與集中于特定感覺器官的其他感受器(如視網(wǎng)膜上的光感受器，味蕾、鼻黏膜上的化學(xué)感受器)相比，研究難度更大。長期以來，人們在細(xì)菌、線蟲、果蠅等模式生物中找到了一些機(jī)械敏感分子，但其在哺乳動(dòng)物中沒有同源蛋白，或者有同源蛋白但其并不具有機(jī)械敏感特性[1]。直到2010年，美國加州Scripps研究所Ardem Patapoutian教授研究組首次在哺乳動(dòng)物中鑒定了介導(dǎo)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白分子，并命名為Piezo(希臘語意為“壓力”)[2]。

Piezo是一類大型跨膜蛋白，在細(xì)胞膜上以三聚體組成機(jī)械力門控的離子通道[3-6]。Piezo通道受力時(shí)激活，打開孔道使陽離子通過，并存在失活現(xiàn)象(inactivation)，即在作為門控刺激的機(jī)械力持續(xù)存在的情況下，Piezo通道依然會(huì)在打開后迅速自發(fā)關(guān)閉[7]?；诩?xì)胞膜內(nèi)外的離子濃度和電化學(xué)勢，在一般生理?xiàng)l件下，通過Piezo的離子主要包括流入細(xì)胞的鈉離子和鈣離子。因此，Piezo通道開放可以具有兩種效應(yīng)：改變膜電位，可引起其他電壓門控的離子通道開放，進(jìn)而觸發(fā)動(dòng)作電位；同時(shí)，改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，鈣離子作為第二信使引發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

Piezo在哺乳動(dòng)物中有兩個(gè)亞型，Piezo1和Piezo2，兩者均具有機(jī)械敏感性，在人體各組織中廣泛分布，并具有多種重要生理功能[8]。Piezo1目前發(fā)現(xiàn)參與淋巴管[9-10]和血管[11]等內(nèi)皮的發(fā)育和形態(tài)建成、紅細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)[12-14]、神經(jīng)元軸突生長及再生[15]、神經(jīng)干細(xì)胞基于環(huán)境的分化[16]、肺毛細(xì)血管中的靜水壓響應(yīng)[17]及泌尿系統(tǒng)功能[18-20]等。Piezo2與Piezo1結(jié)構(gòu)類似[21]，但電生理特性不同，主要表現(xiàn)為失活更快[2,22]以及對Yoda1等激動(dòng)劑不敏感[23]。Piezo2主要在觸覺[24-26]、本體感覺[27-28]、痛覺[29-31]的產(chǎn)生和傳遞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Piezo1和Piezo2還共同調(diào)節(jié)頸動(dòng)脈竇-主動(dòng)脈弓壓力感受性反射[32]、關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育和損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[33-35]、消化道功能[36-37]等。

可見，Piezo與機(jī)體健康密切相關(guān)。正因?yàn)榇?，發(fā)現(xiàn)并深入研究Piezo的Patapoutian教授被授予2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。目前發(fā)現(xiàn)的Piezo1突變可造成紅細(xì)胞或淋巴管發(fā)育異常疾病[38]，而Piezo2突變疾病則表現(xiàn)為本體感覺缺陷、遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮畸形[39]等。Piezo的表達(dá)水平和功能異常可使上述多種重要生理功能發(fā)生紊亂，與高血壓[40]、慢性疼痛、偏頭痛[41]等疾病高度相關(guān)。值得注意的是，Piezo通道可通過影響血管生成[42]、細(xì)胞增殖遷移[43]以及免疫調(diào)節(jié)[44]等途徑而影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[45]。因此，闡明Piezo激活與調(diào)控的工作機(jī)理，將從調(diào)節(jié)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度為相關(guān)疾病的診斷、治療、藥物研發(fā)帶來新思路和新靶點(diǎn)。

1 經(jīng)典的機(jī)械門控原理

在Piezo通道發(fā)現(xiàn)之前，人們已經(jīng)針對其他已發(fā)現(xiàn)的機(jī)械敏感離子通道進(jìn)行了大量電生理學(xué)、生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等方面的研究，其中研究最充分的是細(xì)菌中的MscL通道[46-47]。MscL是細(xì)菌的“壓力應(yīng)急閥”，當(dāng)細(xì)菌受到較大滲透壓變化時(shí)打開巨大孔道，使大量物質(zhì)通過，迅速平衡細(xì)胞膜兩側(cè)的滲透壓差，使細(xì)胞免于破裂。通過比較MscL通道在打開和關(guān)閉兩種狀態(tài)之間的構(gòu)象差異[48-51]，人們發(fā)現(xiàn)，MscL打開巨大孔道的過程中，在膜平面上的橫截面積增加了約20 nm2。在膜受到張力的情況下，這一面積增加使得整個(gè)通道-膜系統(tǒng)的自由能下降，從而使通道的打開構(gòu)象在受力情況下更為穩(wěn)定[52]。該系統(tǒng)從通道關(guān)閉到打開這一過程中的自由能變化可以用以下公式來描述：

其中ΔG(γ=0)即系統(tǒng)在張力為0時(shí)的自由能變化，γ為膜所受到的張力，ΔA為通道打開過程中膜平面上的橫截面積變化[53]。從這個(gè)公式可以得到：

即相對于通道的關(guān)閉狀態(tài)，其打開構(gòu)象的穩(wěn)定性(ΔG)與膜所受到的張力(γ)成正比，而比例常數(shù)正是膜平面上的橫截面積變化。也就是說，通道從關(guān)閉到打開過程中在膜平面上的橫截面積增加越大，其對機(jī)械力越敏感。這一發(fā)現(xiàn)奠定了機(jī)械門控原理的物理基礎(chǔ)。

人們通過對MscL通道的機(jī)械門控原理研究建立了一個(gè)經(jīng)典的“force from lipids”模型[54]，即通道門控所受到的力來自于磷脂雙分子層中脂質(zhì)分子與通道蛋白之間的相互作用，不需要其他蛋白質(zhì)的參與。這一模型隨后在其他機(jī)械敏感通道的門控研究中也有報(bào)道，比較典型的包括機(jī)械敏感鉀離子通道K2P(如TRAAK)[55-56]。人們發(fā)現(xiàn)，K2P跨膜橫截面積也隨孔道打開而擴(kuò)張，可達(dá)2.7 nm2，從而使通道的開放構(gòu)象在受力時(shí)能量上更穩(wěn)定。晶體結(jié)構(gòu)中還可以直接觀察到磷脂分子與通道蛋白的特異性結(jié)合[56]。

此外，機(jī)械門控通道還可以與其他蛋白質(zhì)高度關(guān)聯(lián)，包括細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白以及細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架[57]。來自胞內(nèi)外的力可通過這些栓系蛋白傳遞到機(jī)械門控通道上，這一作用模式被稱為“force from filament”或栓系模型。比較典型的是內(nèi)耳毛細(xì)胞上的聽覺通道與微絨毛的肌動(dòng)蛋白纖維之間的栓系[58]，在線蟲、果蠅、斑馬魚等模式生物中發(fā)現(xiàn)的一類TRP通道NOMPC與胞內(nèi)的微管之間也存在明確的物理和功能聯(lián)系[59-60]。

Piezo通道如何進(jìn)行機(jī)械門控？Piezo門控機(jī)制與已知模型有什么區(qū)別和聯(lián)系？這些信息將如何幫助我們理解機(jī)械傳導(dǎo)過程及相關(guān)疾?。繃@這些問題，人們運(yùn)用了多種先進(jìn)技術(shù)方法從不同角度開展了大量研究。

2 研究方法

結(jié)構(gòu)與功能相結(jié)合一直是蛋白質(zhì)工作機(jī)制研究的有效手段，離子通道也不例外。不管是獲得2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的第一個(gè)離子通道結(jié)構(gòu)[61]，還是前文提到的MscL機(jī)械門控機(jī)理研究，結(jié)構(gòu)生物學(xué)提供的直觀構(gòu)象信息都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。要闡明Piezo通道如何受力開放，我們同樣需要從這兩方面入手。

在功能方面，以膜片鉗技術(shù)為主體的電生理學(xué)是離子通道研究的經(jīng)典方法。Piezo通道發(fā)現(xiàn)之初，其基本通道特性即通過電生理學(xué)被闡明，包括離子選擇性、電導(dǎo)率、激活及失活的時(shí)間常數(shù)、壓力激活曲線等[2,7]。在此基礎(chǔ)上，人們探索了不同的施力方法，以模擬Piezo在復(fù)雜多樣的生理環(huán)境中響應(yīng)位移、形變、震動(dòng)、滲透壓、剪切力等不同機(jī)械刺激的場景，包括小滴脂雙層(droplet lipid bilayer)[62]、彈性微柱陣列(elastomeric pillar array)[63]、磁力[22,64]、超聲[65-66]、原子力顯微鏡[67-68]等。小分子激動(dòng)劑或抑制劑是離子通道研究的重要工具，同時(shí)也是藥物開發(fā)的潛在先導(dǎo)分子。針對Piezo通道的小分子藥物篩選，目前已發(fā)現(xiàn)以Yoda1為代表的一系列Piezo1特異性激動(dòng)劑[23,69]，盡管其作用機(jī)理還未知，但已為Piezo相關(guān)的細(xì)胞、生理、病理等各類研究提供了極大便利[70-71]。

在結(jié)構(gòu)方面，隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，包括離子通道在內(nèi)的膜蛋白結(jié)構(gòu)解析工作大大加速。目前小鼠Piezo1[4-6](圖1)和Piezo2[21]關(guān)閉構(gòu)象的高分辨率結(jié)構(gòu)均已解析，為理解Piezo工作機(jī)理提供了核心支持。不過，通道門控是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，而目前Piezo結(jié)構(gòu)解析僅捕捉到靜態(tài)構(gòu)象。原子力顯微鏡則能夠在給樣品施加力的同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，其在XY平面上分辨率約為1 nm，為高分辨率的靜態(tài)結(jié)構(gòu)提供了很好的補(bǔ)充[68]。值得一提的是，隨著高質(zhì)量結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的增多，以實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)為起點(diǎn)、基于經(jīng)典牛頓力學(xué)運(yùn)動(dòng)的分子動(dòng)力學(xué)模擬近年來發(fā)展迅速。尤其針對Piezo的受力動(dòng)態(tài)過程，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制下，分子動(dòng)力學(xué)模擬有其獨(dú)特的優(yōu)勢[72]。

圖1 Piezo1關(guān)閉狀態(tài)結(jié)構(gòu)。小鼠Piezo1三聚體結(jié)構(gòu)模型(PDB ID 6B3R)，三個(gè)亞基分別為紅、綠、藍(lán)，灰色為電子密度圖。黑色方框所示為C端胞外結(jié)構(gòu)域與一個(gè)旋臂之間的靜電相互作用區(qū)域。右上小圖為左圖黑框部分的表面靜電勢圖，最藍(lán)為電勢值+2 kBT/e，最紅為電勢值-2 kBT/e。右下小圖為左圖黑框部分的絲帶模型圖，其中參與靜電相互作用的關(guān)鍵氨基酸由棒狀模型顯示(修改自參考文獻(xiàn)[4])

3 “膜穹頂”激活機(jī)制

利用上述研究方法，目前，Piezo機(jī)械激活機(jī)制的基本原理已經(jīng)有了被廣泛認(rèn)可的解釋。根據(jù)多個(gè)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)[4-6,21]，Piezo通道由蛋白三聚體組成，共有114條跨膜螺旋，是目前已知最大的膜蛋白之一。Guo和MacKinnon發(fā)現(xiàn)，Piezo關(guān)閉構(gòu)象中，三輻對稱的龐大旋臂圍繞中央的孔道，將整個(gè)通道及附近的去垢劑膠束或磷脂雙分子層彎曲成圓頂狀，由此提出了“膜穹頂機(jī)制(membrane dome mechanism)”：Piezo通道通過曲率變化來控制開關(guān)，受力時(shí)彎曲的Piezo通道變得較平并打開孔道，其在膜平面上的投影面積變化與其機(jī)械敏感度成正比[4]。這一過程可表示為：

其中，ΔGprot和ΔGbend分別是從通道關(guān)閉到打開過程中來源于Piezo蛋白和細(xì)胞膜的自由能差，ΔAproj為Piezo關(guān)閉到打開構(gòu)象在膜平面上的投影面積變化。ΔGprot為正值，即不受力時(shí)Piezo蛋白傾向于保持在彎曲關(guān)閉的狀態(tài)，而ΔGbend為負(fù)值，即不受力時(shí)磷脂膜傾向于展平，這兩者相互抵消。ΔGprot絕對值比ΔGbend略大，使ΔGprot+ΔGbend為一個(gè)正值，即當(dāng)張力γ為0時(shí)，整個(gè)通道-膜系統(tǒng)的自由能差ΔG為正，通道從關(guān)閉到打開的過程不會(huì)發(fā)生。而當(dāng)張力γ逐漸增加，直至γΔAproj這一項(xiàng)的絕對值大于ΔGprot+ΔGbend時(shí)，整體自由能差ΔG為負(fù)，通道打開的過程即會(huì)發(fā)生。

由此可見，雖然與MscL相比，Piezo打開的是一個(gè)只允許陽離子通過的小孔徑通道[2]，電導(dǎo)率約為MscL的1%[73]，僅通過打開孔道獲得的橫截面積有限，但Piezo具有巨大的曲率，受力時(shí)可以通過變平而使得Piezo-膜系統(tǒng)在膜平面上的投影面積(Aproj)發(fā)生巨大變化(圖2)，由此獲得極高的機(jī)械敏感性。

圖2 Piezo膜穹頂機(jī)制。從關(guān)閉(左圖)到開放(右圖)過程中，Piezo通道與膜系統(tǒng)的投影面積(上層平面)隨膜曲率(下層平面)變化(修改自參考文獻(xiàn)[4])。

MacKinnon研究組進(jìn)一步與Scheuring研究組合作證實(shí)了Piezo在受力時(shí)變平的可逆構(gòu)象變化[68]。首先通過脂質(zhì)體成像明確Piezo在磷脂環(huán)境中曲率可變，并使用高速原子力顯微鏡精確定量地描繪Piezo膜穹頂機(jī)制：受力時(shí)變平，在膜平面上的面積增大；力撤走后恢復(fù)彎曲，膜平面上的面積減小。此外，由實(shí)時(shí)受力值、形變值、自由能差推算得到的Piezo打開概率為50%的張力值，與電生理數(shù)據(jù)相符，支持了原子力顯微鏡在機(jī)械敏感離子通道定量研究中的可行性。

Piezo膜穹頂機(jī)制假設(shè)隨后由更多團(tuán)隊(duì)從不同角度提供了依據(jù)。在Piezo的彎曲構(gòu)象中，通道中央的C端胞外結(jié)構(gòu)域(CED)中有一片富含負(fù)電荷的區(qū)域，與旋臂的胞外卷曲中一片富含正電荷的區(qū)域具有靜電相互作用(圖1黑框部分，圖3)。破壞該靜電作用可使旋臂更容易變平，根據(jù)膜穹頂機(jī)制預(yù)測，即會(huì)使得通道更容易打開；相反，如果通過半胱氨酸突變在這兩片區(qū)域之間引入二硫鍵，則會(huì)使旋臂保持在彎曲狀態(tài)，據(jù)預(yù)測將會(huì)阻礙通道打開。Grandl研究組的電生理學(xué)測量結(jié)果正是如此[74]。Luo和Kalli研究組分別在不同的環(huán)境設(shè)定下通過分子動(dòng)力學(xué)模擬了Piezo1的打開構(gòu)象[75-76]：不論是由分子聚集(crowding-induced)還是直接增加膜張力引起的通道開放，Piezo的旋臂都呈現(xiàn)出變平、延展的構(gòu)象。最近，肖百龍教授研究組解析了Piezo1在磷脂中處于受力平展?fàn)顟B(tài)的中等分辨率結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證實(shí)Piezo受力變平的構(gòu)象變化，并提示了跨膜螺旋等主體結(jié)構(gòu)模塊受力時(shí)的變化軌跡(圖3)[77]。由于孔道部分的分辨率限制，此狀態(tài)下的Piezo是否開放還不明確。基于Piezo快速失活的特性，在脂質(zhì)體中穩(wěn)定受力的Piezo可能處于孔道關(guān)閉的失活狀態(tài)。

圖3 Piezo受力時(shí)的結(jié)構(gòu)重排模型。左圖為Piezo不受力時(shí)的彎曲構(gòu)象(PDB ID 7WLT)，右圖為Piezo受力后變平的構(gòu)象(PDB ID 7WLU)，其中C端胞外結(jié)構(gòu)域(CED)為橙色，位于CED與旋臂中發(fā)生靜電相互作用的兩段螺旋分別為品紅和青綠色，形成孔道的內(nèi)側(cè)跨膜螺旋為紅色，外側(cè)跨膜螺旋為黃色，其他跨膜螺旋為灰色，灰度從N端到C端逐漸加深，胞內(nèi)橫梁(beam)為藍(lán)色，序列在跨膜螺旋28號(hào)與29號(hào)之間的交叉螺旋(cross helices)為青色，孔道正下方的基座(base)和肘狀(elbow)螺旋為檸檬綠色，發(fā)卡(hairpin)螺旋為綠色(結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)[77])

以膜穹頂為起點(diǎn)進(jìn)行的理論計(jì)算和模擬顯示(圖4)，Piezo在穹頂以外的膜區(qū)域上可形成更大的膜足跡(membrane footprint)[78]，其形狀與幾個(gè)關(guān)鍵要素相關(guān)：Piezo穹頂?shù)幕拘螤?曲率)、膜的彎曲模量(硬度)、Piezo-膜系統(tǒng)所受的張力。膜足跡的存在使得Piezo可通過膜與鄰近的其他Piezo分子進(jìn)行相互作用，影響彼此在膜上的分布及門控特性。不同組織細(xì)胞甚至同一細(xì)胞上的不同膜區(qū)域具有不同的脂質(zhì)成分，可通過其硬度的差異來調(diào)節(jié)Piezo的機(jī)械激活特性。此外，細(xì)胞骨架將細(xì)胞膜間隔成不同大小的自由區(qū)域，可因此改變Piezo膜足跡的形狀大小，從而影響Piezo門控性質(zhì)。

圖4 Piezo膜穹頂與膜足跡?；疑糠譃榘琍iezo通道蛋白的膜穹頂，藍(lán)色部分為純脂質(zhì)成分的膜足跡(修改自文獻(xiàn)[78])

至此，關(guān)于Piezo激活的膜穹頂機(jī)制模型主體框架已基本明晰，但Piezo變平與使離子通透的孔道開放這兩者之間的關(guān)聯(lián)還沒有確認(rèn)。由于Piezo開放構(gòu)象的結(jié)構(gòu)還未解析，Piezo在受力開放時(shí)發(fā)生的具體變化，特別是孔道部分的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)還沒有明確。肖百龍教授研究組對此做出許多國際領(lǐng)先成果，結(jié)合Piezo1[6]、Piezo2[21]和相關(guān)異構(gòu)體[79]的關(guān)閉構(gòu)象以及Piezo1平展構(gòu)象[77]的結(jié)構(gòu)信息和電生理功能研究，針對Piezo受力后各結(jié)構(gòu)域的相互運(yùn)動(dòng)關(guān)系，目前已提出功能區(qū)模塊化作用[80]、杠桿作用[69]、雙門控作用[21]、以及門塞和閂鎖作用[79]等多個(gè)機(jī)制假說(圖3)。

在上述膜穹頂機(jī)制的基本原理基礎(chǔ)上，我們可以深入理解Piezo通道在不同組織器官中，響應(yīng)不同機(jī)械刺激并發(fā)揮不同生理功能的精細(xì)調(diào)控機(jī)制。

4 調(diào)控機(jī)制

目前在哺乳動(dòng)物中鑒定明確的機(jī)械敏感離子通道非常有限。TRAAK通道幾乎只分布在郎飛結(jié)(node of Ranvier)，且作為鉀離子選擇性通道，只能引起膜電位的超極化和復(fù)極化，不能在受力時(shí)觸發(fā)動(dòng)作電位[81]。TMC1/2最近被確認(rèn)為聽覺通道[82]，但聽覺以外的功能只在對線蟲、果蠅和斑馬魚研究中有報(bào)道[83]。許多TRP通道對機(jī)械刺激有一定的響應(yīng)，其中TRPN/NOMPC在線蟲、果蠅等模式生物中被明確為機(jī)械敏感離子通道[84-86]，但相應(yīng)的機(jī)械傳導(dǎo)功能表型并沒有在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。植物機(jī)械敏感通道OSCA在動(dòng)物中的同源蛋白TMEM63使異源表達(dá)293細(xì)胞獲得機(jī)械敏感性，其機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的生理功能尚有待鑒定[87]。最近有報(bào)道認(rèn)為哺乳動(dòng)物TACAN蛋白為機(jī)械敏感通道[88-89]，但多個(gè)獨(dú)立團(tuán)隊(duì)展示了相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[90-92]。

與此形成鮮明對比的是Piezo通道在哺乳動(dòng)物中極其廣泛的組織分布及復(fù)雜多樣的生理功能[2,93]。這就意味著Piezo1和Piezo2這僅有的兩種Piezo通道需要依靠十分精細(xì)的調(diào)控來適應(yīng)體內(nèi)不同的機(jī)械環(huán)境，包括力刺激的強(qiáng)度、形式、頻率等，從而保證機(jī)體對這些機(jī)械刺激做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)Piezo在不同細(xì)胞類型中可具有差異明顯的動(dòng)力學(xué)特征[94-96]。具體生理環(huán)境中，細(xì)胞膜成分、細(xì)胞內(nèi)外的相互作用分子、細(xì)胞骨架及胞外基質(zhì)等可能共同決定相同的Piezo分子具有特異性的通道特征并在相應(yīng)環(huán)境中行使相應(yīng)的機(jī)械傳導(dǎo)功能，而Piezo動(dòng)力學(xué)的具體調(diào)控機(jī)制以及相應(yīng)的生理功能目前還在積極的研究當(dāng)中。

4.1 Piezo蛋白

蛋白質(zhì)本身的氨基酸序列、理化性質(zhì)變化可直接影響Piezo通道門控特性，這正是Piezo突變造成各類遺傳疾病的原因[97]。在生理?xiàng)l件下，Piezo也可以通過可變剪接改變其序列從而實(shí)現(xiàn)功能的精細(xì)調(diào)控。Piezo2在非神經(jīng)元組織中主要表達(dá)為一種異構(gòu)體，而在不同類型的神經(jīng)元中呈現(xiàn)多種剪接類型，并在離子通透性、對鈣離子的敏感性以及失活特性等方面均有明顯差異[98]。不同剪接異構(gòu)體之間的區(qū)別主要是結(jié)構(gòu)尚未解析的幾段胞內(nèi)序列的差異缺失，可能參與來自細(xì)胞骨架的力傳遞[99]。對于Piezo1，其“門塞”部分被剪接去除后形成異構(gòu)體Piezo1.1，單通道電導(dǎo)升高，機(jī)械敏感性增加，且可以與野生型Piezo1形成異源三聚體，并具有中等水平的電導(dǎo)值[79]。

根據(jù)Piezo膜足跡預(yù)測，相互聚集的Piezo會(huì)影響彼此的門控[78]。有STORM超分辨成像顯示Piezo在質(zhì)膜上聚集成簇，且聚集動(dòng)態(tài)受膽固醇影響，而去除膽固醇可降低Piezo的機(jī)械敏感性和激活速率[100]。在分子動(dòng)力學(xué)模擬中，Piezo的膜足跡可相互重疊，從而降低膜曲率，使通道在不受力的狀態(tài)下開放[75]。初步細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)，不同密度的Piezo分布對其機(jī)械敏感性沒有明顯影響[101]。膜上的通道密度對Piezo具體產(chǎn)生什么作用，還需要更多研究探索。

翻譯后修飾是蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的常見機(jī)制。對于離子通道，修飾一方面可通過改變胞內(nèi)運(yùn)輸而影響細(xì)胞膜上的通道數(shù)量；另一方面可通過調(diào)節(jié)通道動(dòng)力學(xué)來影響通道的活性[102-103]。目前關(guān)于Piezo翻譯后修飾的報(bào)道還較少，有研究發(fā)現(xiàn)Piezo胞外結(jié)構(gòu)域上的兩個(gè)天冬酰胺殘基可發(fā)生N-連接糖基化，并影響Piezo在胞內(nèi)的有效運(yùn)輸[104]。

4.2 脂質(zhì)

首先要明確的是，Piezo感受機(jī)械力這一根本功能并不需要其他蛋白質(zhì)參與。Patapoutian研究組將純化的Piezo蛋白重構(gòu)到脂質(zhì)體當(dāng)中，在不同磷脂成分、滲透壓等條件下對Piezo脂質(zhì)體或小滴脂雙層進(jìn)行電生理測量[62,105]，證實(shí)了Piezo蛋白自身即可組成具有功能的機(jī)械敏感通道，不需要其他輔助蛋白形成通道復(fù)合體，或依賴胞外基質(zhì)或細(xì)胞骨架進(jìn)行力的傳遞，符合“force from lipids”模型。在這一模型中，脂質(zhì)可以直接對通道功能起到調(diào)控作用。

膜穹頂機(jī)制可以預(yù)測脂質(zhì)對Piezo激活過程產(chǎn)生怎樣的影響[4,68,78]。以一個(gè)簡化的模擬場景為例，從公式(3)中可以看到，通道從關(guān)閉到打開過程的自由能差，與來自磷脂膜的內(nèi)在自由能變化值ΔGbend相關(guān)。較硬的磷脂膜，較容易保持在展平的狀態(tài)，其ΔGbend的負(fù)值較大，那么較小的張力即可以使通道-膜系統(tǒng)整體自由能差為負(fù)，從而讓通道打開。也就是說，其他條件不變的情況下，使磷脂膜變硬的因素可讓Piezo通道對機(jī)械力更敏感。考慮到Piezo膜足跡，則脂質(zhì)的成分和硬度對Piezo門控的影響更為復(fù)雜、顯著[78]。此外，脂質(zhì)還可能通過直接結(jié)合Piezo蛋白或改變膜的曲率對Piezo造成影響。

在實(shí)驗(yàn)中人們已經(jīng)觀察到了許多脂質(zhì)對Piezo的調(diào)節(jié)現(xiàn)象。飲食中常見的飽和脂肪酸十七烷酸可增加膜硬度并抑制Piezo激活，而多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸則可以降低膜硬度并調(diào)節(jié)Piezo的失活效應(yīng)[106]。磷脂酰肌醇及其磷酸鹽(PIPs)是重要信號(hào)分子，其缺失可抑制Piezo功能[107-108]。通過藥物去除質(zhì)膜中的膽固醇可使Piezo電流減弱，對機(jī)械力敏感性降低[95,100]。質(zhì)膜中的鞘磷脂被鞘磷脂酶水解為神經(jīng)酰胺后，因脫去磷酸頭部而改變膜曲率，此時(shí)Piezo失去其快速失活特性而保持在激活狀態(tài)[109]。此外，機(jī)械敏感通道的非特異性抑制劑GsMTx4蜘蛛毒素[110]和阿爾茨海默病的致病因子之一Aβ肽[111]，都可能是通過其兩親性來改變磷脂膜性質(zhì)，從而影響Piezo功能。

在上述電生理實(shí)驗(yàn)中，來源于細(xì)胞膜的膜片脂質(zhì)成分難以控制，且存在細(xì)胞內(nèi)多種其他因素的干擾。要明確脂質(zhì)對Piezo的作用，需保證實(shí)驗(yàn)中的膜性質(zhì)參數(shù)穩(wěn)定，最好使用成分明確、可調(diào)的巨大脂質(zhì)體(giant unilamellar vesicle,GUV)，但Piezo通道在GUV中的電生理測量目前穩(wěn)定性和可重復(fù)性還較低，不能滿足計(jì)算精度的要求，因此脂質(zhì)成分完全可控的脂質(zhì)體電生理研究還很有限[105]。

分子動(dòng)力學(xué)模擬針對脂質(zhì)對Piezo的作用提供了一些新角度。包括Piezo和磷脂膜系統(tǒng)的多項(xiàng)模擬研究發(fā)現(xiàn)Piezo中一系列與膽固醇和磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸(PIP2)的結(jié)合位點(diǎn)，其中包括與疾病相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基[75,112-113]，其實(shí)際生理病理意義有待進(jìn)一步鑒定。

4.3 互作蛋白

盡管Piezo不需要其他蛋白就可以完成機(jī)械傳導(dǎo)的基本功能，但Piezo與其他蛋白的相互作用可從多個(gè)方面對Piezo的受力激活過程產(chǎn)生影響，包括直接與Piezo發(fā)生物理聯(lián)系，以及通過改變Piezo所處的環(huán)境間接調(diào)節(jié)Piezo功能。

與多囊腎病相關(guān)的Polycystin-2蛋白在腎小管上皮細(xì)胞中可抑制Piezo電流，且在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中與Piezo1存在免疫共沉淀現(xiàn)象[18]?？山Y(jié)合膽固醇的STOML3蛋白能夠調(diào)節(jié)Piezo機(jī)械敏感性，并在過表達(dá)的HEK-293細(xì)胞中與Piezo1和Piezo2均可發(fā)生免疫共沉淀[63]。Schmidt研究組通過免疫親和純化和高分辨率質(zhì)譜獲得了Piezo2在小鼠背根神經(jīng)節(jié)中的互作蛋白組，并從中鑒定了中心體蛋白Pericentrin[114]和磷脂酰肌醇磷酸酶Mtmr2[108]與Piezo2在細(xì)胞中共定位，并可以調(diào)節(jié)Piezo電流。肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP酶(SERCA)與Piezo1之間的相互作用通過免疫共沉淀和熒光共定位得到確認(rèn)，SERCA通過Piezo1/2中的一段linker連接序列對其產(chǎn)生抑制作用，并由此影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移[96]。

Piezo互作蛋白中比較特殊的一類即細(xì)胞骨架。由于細(xì)胞骨架可直接參與力的傳導(dǎo)，人們很早就在關(guān)注Piezo受細(xì)胞骨架的影響。全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)中，使用細(xì)胞松弛素D破壞胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白，可減弱Piezo電流[115]。在滲透壓應(yīng)激形成的缺乏細(xì)胞骨架的細(xì)胞膜泡(membrane bleb)中，Piezo更易被激活[116]。通過藥物抑制肌球蛋白Myosin II可抑制Piezo產(chǎn)生的鈣信號(hào)[16]，而磷酸化靠近細(xì)胞外周的Myosin II可激活Piezo[117]。此外，作為基底板成分的Ⅳ型膠原可使Piezo對機(jī)械拉力更為敏感[67]。最新報(bào)道發(fā)現(xiàn)，cadherinβ-catenin復(fù)合體將Piezo1栓系到胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白上[118]。藥物破壞肌動(dòng)蛋白骨架，siRNA敲降E-cadherin或β-catenin，或通過破壞E-cadherin與Piezo1多個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的分子間相互作用，均可顯著降低Piezo1對機(jī)械力的敏感性。由此，在“force from lipids”主體模型的基礎(chǔ)上，肌動(dòng)蛋白的參與也為Piezo激活調(diào)控明確增加了“force from filament”的元素。

另有一類蛋白通過影響Piezo周圍的脂質(zhì)來調(diào)節(jié)Piezo功能。如：TRPV1通道激活可減少質(zhì)膜中的磷脂酰肌醇，從而抑制Piezo[107]；鞘磷脂酶水解鞘磷脂可改變膜曲率并調(diào)節(jié)Piezo失活。G蛋白偶聯(lián)受體也被發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié)Piezo活性，可能是通過Gβγ下游的磷脂酰肌醇激酶PI3K改變其PIP2產(chǎn)物的含量[119]。前述Piezo的直接互作蛋白也可以同時(shí)改變Piezo脂質(zhì)環(huán)境，如STOML3可減少質(zhì)膜中膽固醇[95]，Mtmr2可調(diào)節(jié)PIP含量[108]，即同一調(diào)控蛋白可能存在多個(gè)作用模式。

4.4 小分子藥物

針對Piezo通道的藥理學(xué)研究進(jìn)展比較緩慢。最早經(jīng)過高通量篩選發(fā)現(xiàn)的Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1，可以顯著提高Piezo1對機(jī)械力的敏感性，并減緩失活過程，但對Piezo2沒有影響[23,70]。隨后篩選得到的Jedi1和Jedi2結(jié)構(gòu)類似，也是Piezo1的特異性激動(dòng)劑，可提高Piezo1的機(jī)械敏感性，且效果可與Yoda1疊加，因此與Yoda1的作用位點(diǎn)可能不同[69]。在Yoda1結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行改造得到的Dooku1[120]，以及從中藥提取物篩選得到的土貝母皂苷甲[121]，均是Yoda1的拮抗劑。目前還未見Piezo1特異性抑制劑或針對Piezo2的小分子藥物。

關(guān)于這些小分子藥物調(diào)節(jié)Piezo功能的機(jī)制還不明確。有表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)實(shí)驗(yàn)提示Yoda1、Jedi1和Jedi2直接與Piezo1結(jié)合[69]。分子動(dòng)力學(xué)模擬在Piezo1中央孔道外約40 ?定位了一個(gè)Yoda1的結(jié)合口袋，且結(jié)合Yoda1的旋臂在受到張力時(shí)伸展變平的位移比未結(jié)合Yoda1的旋臂更大，從而對機(jī)械力更敏感[122]。但是這個(gè)模擬的結(jié)合口袋序列在Piezo1和Piezo2之間是保守的，無法解釋Yoda1對Piezo1的特異性。此外，也有觀點(diǎn)認(rèn)為，Yoda1具有疏水性，可能通過改變磷脂膜的性質(zhì)間接影響Piezo1功能，而這同樣留下關(guān)于特異性的疑問[23]。

對于小分子調(diào)節(jié)劑的篩選、設(shè)計(jì)以及作用機(jī)制的研究是未來將其應(yīng)用于Piezo相關(guān)藥物干預(yù)的重要基礎(chǔ)，還有待于多個(gè)交叉領(lǐng)域的共同探索[123]。

5 總結(jié)和展望

從2010年P(guān)iezo通道被發(fā)現(xiàn)以來[2]，圍繞其通道特性、生理功能，以及相關(guān)疾病的研究層出不窮。關(guān)于Piezo最核心的機(jī)械激活過程，膜穹頂機(jī)制較好地解釋了其基本原理[4]。Piezo具有特征性的高度彎曲構(gòu)象，在受力時(shí)Piezo曲率降低，在膜平面上的投影面積增大。根據(jù)細(xì)菌MscL通道的相關(guān)研究，機(jī)械門控離子通道對機(jī)械力的敏感性與其在膜平面上的面積變化成正比(公式(1)和(2))[47-48,50]。Piezo通道正是可以通過曲率的變化在保持陽離子選擇性的小孔道條件下獲得極大的機(jī)械敏感性。

Piezo受力變平是一個(gè)形態(tài)上的整體變化，具體到三個(gè)亞基各個(gè)結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動(dòng)細(xì)節(jié)還有待Piezo開放構(gòu)象的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)解析。目前門控機(jī)制研究得較為清楚的離子通道，通常都有其開放和關(guān)閉等不同狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)信息作為解釋門控分子機(jī)理的關(guān)鍵依據(jù)。在機(jī)械門控通道領(lǐng)域，同樣是開關(guān)構(gòu)象均已解析的MscL通道向人們揭示機(jī)械敏感性與膜平面上通道橫截面積變化的關(guān)系，奠定了理解機(jī)械門控離子通道的物理基礎(chǔ)[48]。包括Piezo在內(nèi)的其他機(jī)械門控離子通道，雖然許多已有關(guān)閉構(gòu)象的結(jié)構(gòu)被解析[59,124-127]，但由于缺乏開放構(gòu)象，一系列基于突變及電生理實(shí)驗(yàn)觀察的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究[6,69,79]，以及分子動(dòng)力學(xué)模擬的機(jī)制假說[76,112-113,122]無法得到明確的證實(shí)。對于配體敏感的通道或受體分子，加入相應(yīng)的配體通常即可使其處在激活狀態(tài)，用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)研究。對于機(jī)械敏感通道，雖然大量篩選結(jié)晶條件有可能獲得通道處于激活狀態(tài)的晶體類型(如MscL和K2P)[48,56]，但膜蛋白結(jié)晶依然困難較大。在目前主流的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析過程中施加機(jī)械力仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。選擇特定脂質(zhì)重構(gòu)納米盤(nanodisc)在細(xì)菌MscS通道研究中有所應(yīng)用[128]，但推廣到Piezo在內(nèi)的其他機(jī)械敏感通道仍存在技術(shù)限制。最近解析的Piezo平展結(jié)構(gòu)使用的是蛋白脂質(zhì)體樣品，雖然受力狀態(tài)穩(wěn)定，但6.8 ?的分辨率尚不足以揭示孔道打開的細(xì)節(jié)[77]，需要在樣品制備、數(shù)據(jù)收集及處理上進(jìn)行更多探索。

此外，Piezo通道失活現(xiàn)象的具體機(jī)制同樣尚不明確。目前發(fā)現(xiàn)膜電位[74]、膜成分[106,109]、環(huán)境pH值[129]、細(xì)胞類型[94]、小分子藥物[23]等都可以影響失活過程的有無或快慢。Piezo通道的失活異?？捎蒀端胞外結(jié)構(gòu)域及形成孔道的內(nèi)側(cè)跨膜螺旋中幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸的點(diǎn)突變所導(dǎo)致[22,74,130-131]，并且與紅細(xì)胞脫水性貧血等許多疾病相關(guān)[38,132-134]。Piezo靜息/關(guān)閉-開放-失活的完整受力狀態(tài)變化循環(huán)的過程及其具體機(jī)制還缺失許多重要信息。

在研究Piezo機(jī)械門控機(jī)制的基礎(chǔ)上，人們可以更好地理解Piezo的功能如何受其環(huán)境調(diào)控。膜穹頂機(jī)制解釋并預(yù)測了一系列在電生理等實(shí)驗(yàn)中觀察到的Piezo調(diào)控現(xiàn)象，包括膜硬度、磷脂成分、通道密度等對Piezo機(jī)械敏感性的影響，為人們深入理解Piezo功能并針對性地進(jìn)行調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。此外，Piezo蛋白本身的機(jī)械屬性、小分子藥物、互作蛋白等都對Piezo功能提供了更為復(fù)雜精細(xì)的調(diào)節(jié)空間，有待更加深入、充分地研究探索。

Piezo功能異常與多種疾病相關(guān)，包括對個(gè)人生活質(zhì)量和社會(huì)經(jīng)濟(jì)都造成重大負(fù)擔(dān)的腫瘤、心血管疾病、慢性疼痛等。因此，我們期望針對Piezo功能調(diào)控的相關(guān)研究能夠有助于從糾正機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度為這些疾病的防治提出新思路。需要注意的是，Piezo在人體各組織中分布廣泛，直接靶向Piezo的藥物很可能會(huì)對非病變組織中的Piezo造成影響，從而導(dǎo)致各種副作用。因此，以目標(biāo)組織中特異的Piezo調(diào)控機(jī)制作為靶標(biāo)，比如通過抗體或小分子藥物特異性地阻斷Piezo與某種互作蛋白之間的物理聯(lián)系，可能是更好的選擇。