慢阻肺患者外周血單個核細(xì)胞lncRNA SNHG5的表達(dá)與炎癥因子水平相關(guān)性研究

胡玉蘭，趙 杰，盧立國，潘海洋，巢玉瓊

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221000；3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬沭陽醫(yī)院，江蘇 沭陽 223600)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要累及肺臟，也可引發(fā)全身其他臟器功能異常，威脅患者生命安全[1].長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種無蛋白編碼能力的核酸序列，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡、血管生成等過程，為疾病的分子診斷和基因治療提供了新方向[3].核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1(NOD1)是人體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可通過特異性識別病原菌相關(guān)分子模式激活免疫系統(tǒng)，抑制病原菌入侵[4].核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (NLRP3)由NLRP3的效應(yīng)蛋白Caspase-1和凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白共同組成，參與炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展[5].目前，關(guān)于COPD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已有研究[6]證實可能與免疫失調(diào)和炎癥反應(yīng)有關(guān).本研究主要探討COPD患者外周血單個核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5及NOD1、NLRP3的表達(dá)水平，為COPD的臨床診治提供新的參考.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月—2020年3月徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的COPD穩(wěn)定期患者80例為COPD穩(wěn)定期組，急性加重期患者80例為COPD急性加重期組.COPD穩(wěn)定期組中男48例，女32例；年齡43～76歲，平均(58.20±8.63)歲；病程3～11 a，平均(7.52±1.49)a.COPD急性加重期組中男46例，女34例；年齡44～78歲，平均(58.97±7.75)歲；病程4～10 a，平均(7.86±1.21)a.另收集同期健康志愿者80名為對照組，男47名，女33名；年齡41～76歲，平均(57.86±8.11)歲.一般資料在各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性.本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批號：YXLL-2020011S)，受試者均簽署知情同意書.

入選標(biāo)準(zhǔn)：符合2011年修訂的《慢性阻塞性肺疾病診斷、治療與預(yù)防全球策略》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)肺功能、動脈血氣分析等檢查確診；理解和溝通能力正常者.

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤，或肝、腎等重要器官功能嚴(yán)重不全的患者；合并感染性疾病、自身免疫性疾病的患者；近3個月有嚴(yán)重外傷史、手術(shù)史的患者.

1.2 主要試劑與儀器

Trizol提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒(上海百研生物科技有限公司)；RIPA裂解液(北京諾博萊德科技有限公司)；鼠抗人NOD1單克隆抗體、鼠抗人NLRP3單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的二抗(沃卡威(北京)生物技術(shù)有限公司)；Multiskan Sky全自動酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 外周血單個核細(xì)胞分離

COPD穩(wěn)定期組和急性加重期組患者入院次日、對照組體檢時采集空腹肘靜脈血5 mL，置于抗凝真空采血管中，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，收集血清，-80 ℃保存待測.取上述血清1 mL置于含1 mL磷酸緩沖液的離心管中，混合均勻后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入適量磷酸緩沖液充分混合均勻，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，洗滌后收集沉淀，-80 ℃保存待測.

1.3.2 RT-PCR檢測lncRNA SNHG5、NOD1、NLRP3mRNA

Trizol法提取外周血單個核細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定后用于后續(xù)實驗，260 nm處吸光度值/280 nm處吸光度值在1.8～2.0之間為單個核細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，按PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增.lncRNA SNHG5上游引物5′-TTCCTCTTCTTCGCTGGTGA-3′，下游引物5′-ATTG TCCTCCAACT GTTACCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段175 bp；NOD1上游引物5′-TGTCCTGTGCCAGTC CCAC-3′，下游引物5′-TTCTTACGGCGTTCCACGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段160 bp；NLRP3上游引物5′-CGTCGTTT GACCTTTCCTTC-3′，下游引物5′-TTTCCTTCACCT GACGCTCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段195 bp；β-actin上游引物5′-TAAAACCTCCCTA GAGCGAGG-3′，下游引物5′-GGTACTCTTCATACTGTTGTCCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段208 bp.引物設(shè)計由重慶波爾生物科技有限公司完成.PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA模板3 μL、雙蒸餾水5 μL.PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性3 min，94 ℃ 變性40 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，共45個循環(huán).以β-actin為內(nèi)參計算相對表達(dá)量.

1.3.3 Western blot檢測NOD1、NLRP3蛋白表達(dá)

使用高效RIPA裂解液提取外周血單個核細(xì)胞的蛋白，使用BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白濃度.取蛋白樣品10 μg行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，置于放有轉(zhuǎn)膜緩沖液的槽中，冰上恒壓轉(zhuǎn)移1～2 h，室溫下?lián)u床上搖動封閉1 h；滴加鼠抗人NOD1單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶800)，鼠抗人NLRP3單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶500)，兔抗人β-actin單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶2 000)，室溫下孵育2 h；滴加HRP標(biāo)記的二抗，稀釋倍數(shù)1∶2 000，使用ECL試劑盒檢測蛋白，ImageJ軟件讀取電泳條帶灰度值.

1.3.4 外周血C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6水平檢測

COPD穩(wěn)定期組和急性加重期組患者入院次日、對照組體檢時采集空腹肘靜脈血4 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，收集血清，-80 ℃保存待測.采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)，全自動酶標(biāo)儀讀取數(shù)值，嚴(yán)格按試劑盒說明操作.

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血單個核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5的表達(dá)水平

lncRNA SNHG5的表達(dá)水平在各組間比較差異顯著(P<0.05)，其中，COPD急性加重期組lncRNA SNHG5的表達(dá)水平明顯低于COPD穩(wěn)定期組和對照組，COPD穩(wěn)定期組lncRNA SNHG5的表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05).見表1.

表1 各組外周血單個核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5的表達(dá)水平

2.2 各組外周血單個核細(xì)胞中NOD1、NLRP3 的mRNA和蛋白表達(dá)水平

NOD1、NLRP3的 mRNA和蛋白表達(dá)水平在各組間比較差異顯著(P<0.01)，其中，COPD急性加重期組NOD1、NLRP3 的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于COPD穩(wěn)定期組和對照組，COPD穩(wěn)定期組NOD1、NLRP3 的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05).見表2和圖1.

表2 各組外周血單個核細(xì)胞中NOD1、NLRP3的 mRNA和蛋白表達(dá)水平

1.對照組；2.COPD穩(wěn)定期組；3.COPD急性加重期組.

2.3 各組血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6水平

血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6水平在各組間比較差異顯著(P<0.01)，其中，COPD急性加重期組血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6水平明顯高于COPD穩(wěn)定期組和對照組，COPD穩(wěn)定期組血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6水平明顯高于對照組(P<0.05).見表3.

表3 各組血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6水平

2.4 COPD患者外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5、NOD1、NLRP3的表達(dá)與血清炎癥因子的相關(guān)性分析

COPD患者外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5表達(dá)與血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；COPD患者外周血單核細(xì)胞中NOD1、NLRP3表達(dá)與血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6呈正相關(guān)關(guān)系.見表4.

表4 COPD患者外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5、NOD1、NLRP3的表達(dá)與血清炎癥因子指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

近年來，我國人口老齡化問題導(dǎo)致COPD發(fā)病率呈快速增長趨勢，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[7-8].因此，探索早期診斷和評估COPD病情的分子生物學(xué)指標(biāo)，對早期診治、緩解病情、改善預(yù)后具有重要意義.COPD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，有研究[9]顯示：IncRNA、固有免疫、炎癥反應(yīng)參與調(diào)控COPD發(fā)病與進(jìn)展.與miRNA相比，IncRNA的序列更長，空間結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，能夠在遺傳、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與核內(nèi)轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)修飾等多項重要調(diào)控過程[10].本研究結(jié)果顯示：COPD急性加重期組lncRNA SNHG5的表達(dá)水平明顯低于COPD穩(wěn)定期組和對照組，COPD穩(wěn)定期組明顯低于對照組.提示COPD患者外周血單個核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5低表達(dá)可能是病情進(jìn)展的危險因素，可作為評估患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo).

相關(guān)研究[11]顯示：病原體模式識別受體與相關(guān)分子模式特異性結(jié)合后能夠激活下游信號通路，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞合并，并釋放炎癥因子，引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和固有免疫反應(yīng)，清除病原菌等多種外源性有害物質(zhì).病原體模式識別受體包括TLRs、NLRs家族等[12].NOD1是人體中廣泛存在的NOD蛋白家族成員，具有高度的遺傳保守性，能夠調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)過程[13].NOD1識別病原菌細(xì)胞壁上的肽聚糖、脂多糖后，蛋白激酶促進(jìn)了其與特異性配體相互結(jié)合，激活了NF-κB和MAPK信號通路，調(diào)控凋亡基因表達(dá)，進(jìn)而激活了Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞核中DNA斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體，進(jìn)而清除病原體[14].亦有研究[15]顯示：NOD1激活了NF-κB信號通路，并促進(jìn)NOD1的mRNA和蛋白高表達(dá)，進(jìn)而大量釋放炎癥因子.炎癥小體是細(xì)胞中的多蛋白復(fù)合體，參與人體固有免疫過程，炎癥小體的激活能夠發(fā)揮抗感染、免疫應(yīng)答、維持人體穩(wěn)態(tài)等作用，當(dāng)炎癥小體相關(guān)基因突變后，炎癥小體被過度激活，會誘發(fā)系統(tǒng)性炎癥損傷.NLRP3是一個具有重要生理作用的炎癥小體，可參與調(diào)控COPD的發(fā)病過程.當(dāng)病原菌侵入人體時，NOD識別不同病原體模式后激活NLRP3、Caspase-1，促進(jìn)IL-6等炎癥因子釋放，放大炎癥反應(yīng)，固有免疫被激活后參與COPD炎癥反應(yīng)和氣道損傷過程[16].C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6通過介導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)參與COPD的病程[17].

本研究結(jié)果顯示：COPD急性加重期組血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6水平明顯高于COPD穩(wěn)定期組和對照組，COPD穩(wěn)定期組明顯高于對照組，提示C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6參與COPD穩(wěn)定期向急性加重期的發(fā)展過程.相關(guān)性分析顯示：COPD患者外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5的表達(dá)與血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，NOD1、NLRP3的表達(dá)與血清C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6呈正相關(guān)關(guān)系.提示外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG5、NOD1、NLRP3可能通過調(diào)控炎癥因子C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α、IL-6的表達(dá)參與COPD病情的發(fā)生與進(jìn)展，其結(jié)果可用于臨床診斷和預(yù)后評估.